酵母双杂交系统技术介绍

酵母双杂交系统技术介绍
Clontech
Matchmaker™
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背景介绍: Matchmaker Gold 系统
酵母单杂交-蛋白与DNA的相互作用
• Matchmaker™ Gold Yeast One-Hybrid Library Screening System （630491）
酵母双杂交-蛋白与蛋白的相互作用
• Matchmaker™ Gold Yeast Two-Hybrid System（630489） • Make your own “Mate & Plate™”library System (630490)
酵母三杂交—三个蛋白之间的相互作用
• pBridge Three-Hybrid Vector （630404）
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背景介绍: Matchmaker Gold系统原理
Reporter Gene
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Reporter Gene
Reporter Gene
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主要内容
• 酵母双杂交的背景介绍 • 酵母双杂交的基本原理 • Clontech 酵母双杂交系统 • 常见问题分析
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基本原理: 酵母双杂交参考文献
• Nature. 1989 Jul 20;340(6230):245-6.
• A novel genetic system to detect protein-protein interactions. • Fields S, Song O. • Department of Microbiology, State University of New York at Stony
▪ 文库分装，冻存 ▪1ml mating
GGG CCC
GGG CCC
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AAAAAAAAA TTTTTTTT
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LD-PCR
AAAAAAAA TTTTTTTT
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文库构建: Clontech MM文库构建方法
▪ SMART合成cDNA ▪共转化，涂板
Brook, Stony Brook 11794.
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63000次引用
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基本原理: GAL4转录因子的结构
DNA-BD
AD
BD 结合结构域
GAL4 蛋白具有两个功能结构域
AD 激活结构域
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基本原理: GAL4转录因子的分子机理
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Clontech MM系统: 蛋白互作基本流程
Clontech蛋白互作相关试剂盒
自己构建文库： 630490 预制细菌文库： 638802 （传统型） 预制酵母菌文库： 630480 （均一化，通用型）
酵母双杂交系统： 630489 酵母菌转化试剂盒： 630439 酵母培养基（套装）： 630495 插入片段检测： 630497 酵母质粒提取： 630467
蛋白质相互 作用研究
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背景介绍: 为什么要研究蛋白互作？
发现新的蛋白质和蛋白质的新功能 在细胞体内研究抗原和抗体的相互作用 筛选药物的作用位点 研究药物对蛋白质之间相互作用的影响 建立基因组蛋白连锁图
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Clontech MM系统的优点
异常 简便
SMART方法与同源重组技术结合构建 文库，聪明的酵母自己做克隆。
抗性 筛选
AbA抗性筛选的添加，有效抑制背景 生长，大大降低假阳性。
设计 巧妙
文库构建于型酵母菌株α型Y187中，方 便后续与a型菌株Y2H Gold进行mating 直接筛选。
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正常情况在酵母细胞内:
GAL UAS
Promoter
Transcription gal metabolic gene
在GAL4 based双杂交系统中:
GAL4 AD
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基本原理: 三个启动子，四个报告基因
获得阳性克隆子
报告基因表达
AbA 抗性筛选
X-a-gal 蓝白筛选
Ade 营养筛选
His 营养筛选
M1
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G1
G2
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主要内容
• 酵母双杂交的背景介绍 • 酵母双杂交的基本原理 • Clontech酵母双杂交系统 • 常见问题分析
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酵母双杂交系统 技术介绍
宝日医生物技术（北京）有限公司
April 11, 2021
主要内容
• 酵母双杂交的背景介绍 • 酵母双杂交的基本原理 • Clontech 酵母双杂交系统 • 常见问题分析
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背景介绍: 关注蛋白质
蛋白组时代
蛋白质功能
生物信息学 的发展
背景介绍: Clontech 酵母双杂交系统的功能
发现新的与已知蛋白互作的蛋白 鉴定两个蛋白之间的相互作用
确定蛋白相互作用的区域
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背景介绍: Clontech分子生物学工具
Gene discovery
Gene Function
Gene Expression
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文库构建: Clontech MM自制文库筛选
▪ 培养，收集菌液 ▪ 文库分装，冻存
自己 做பைடு நூலகம்隆
▪1ml mating
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文库构建: Clontech MM文库构建方法
▪ SMART合成cDNA ▪共转化，涂板
▪ 培养，收集菌液 ▪ 文库分装，冻存
▪1ml mating
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体内验证： 630489 630305 体外Co-IP验证： 630458 630459 631723 631604
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文库构建: Clontech MM文库构建方法
▪ SMART合成cDNA
AAAAAAAAA
▪共转化，涂板 ▪ 培养，收集菌液
GGG CCC