酵母双杂交系统技术介绍
膜系统酵母双杂交原理
膜系统酵母双杂交原理酵母双杂交技术作为发现和研究在活细胞体内的蛋白质与蛋白质之间的相互作用的技术平台，在近几年来得到了广泛运用。
酵母双杂交系统是在真核模式生物酵母中进行的，研究活细胞内蛋白质相互作用，对蛋白质之间微弱的、瞬间的作用也能够通过报告基因的表达产物敏感地检测得到，它是一种具有很高灵敏度的研究蛋白质之间关系的技术。
大量的研究文献表明，酵母双杂交技术既可以用来研究哺乳动物基因组编码的蛋白质之间的互作，也可以用来研究高等植物基因组编码的蛋白质之间的互作。
双杂交系统的建立得力于对真核生物调控转录起始过程的认识。
细胞起始基因转录需要有反式转录激活因子的参与。
80 年代的工作表明，转录激活因子在结构上是组件式的（modula r），即这些因子往往由两个或两个以上相互独立的结构域构成，其中有DNA 结合结构域（DNA binding domain，简称为DB）和转录激活结构域（activation domain ，简称为AD），它们是转录激活因子发挥功能所必需的。
单独的DB 虽然能和启动子结合，但是不能激活转录。
而不同转录激活因子的DB 和AD 形成的杂合蛋白仍然具有正常的激活转录的功能。
如酵母细胞的Gal4 蛋白的DB 与大肠杆菌的一个酸性激活结构域B42 融合得到的杂合蛋白仍然可结合到Gal4 结合位点并激活转录。
Fields 等人的工作标志双杂交系统的正式建立。
他们以与调控SUC2 基因有关的两个蛋白质Snf1 和Snf2 为模型，将前者与Gal4 的DB 结构域融合，另外一个与Gal4 的AD 结构域的酸性区域融合。
由DB 和AD 形成的融合蛋白现在一般分别称之为“ 诱饵” （bait）和“ 猎物” 或靶蛋白（prey or target protein）。
如果在Snf1 和Snf2 之间存在相互作用，那么分别位于这两个融合蛋白上的DB 和AD 就能重新形成有活性的转录激活因子，从而激活相应基因的转录与表达。
酵母双杂交酵母单杂交酵母三杂交课件
酵母单杂交系统的应用
寻找与特定DNA序列相互作用的蛋白质
01
通过将待研究的蛋白质与转录因子融合，可以筛选出与特定
DNA序列相互作用的蛋白质。
研究蛋白质的功能
02
通过分析蛋白质与DNA的相互作用，可以深入了解蛋白质的功
酵母杂交技术的发展趋势
操作简便化
随着技术的发展，酵母杂交技术 的操作将越来越简便，使得更多 的实验室和研究人员能够利用该
技术进行研究。
应用广泛化
随着研究的深入，酵母杂交技术 的应用范围将越来越广泛，不仅 局限于蛋白质之间的相互作用研 究，还可以应用于转录因子活性
等方面的研究。
系统化与自动化
未来，随着技术的发展，酵母杂 交技术将逐渐实现系统化和自动 化，进一步提高实验的准确性和
该方法基于真核生物的转录调控机制，通过将两个蛋白质的 编码基因分别与酵母的转录激活因子基因GAL4的N端和C端 融合，形成两个融合蛋白，再观察这两个融合蛋白在酵母细 胞中的相互作用对转录的影响。
酵母双杂交系统的应用
基因表达调控研究
药物筛选
通过分析不同条件下蛋白质之间的相 互作用，了解相关基因的表达调控机 制。
酵母三杂交系统
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酵母双杂交原理ppt演示
当两个蛋白质之间发生相互作用时，DNA结合域和转录激活域之间的空间构象发生 变化，从而激活报告基因的表达。
酵母双杂交系统的应用领域
蛋白质相互作用研究
通过酵母双杂交系统可以检测蛋白质 之间的相互作用，为研究蛋白质的功 能和调控机制提供有力支持。
将诱饵蛋白基因克隆到表达载 体中，转化大肠杆菌进行表达。
通过亲和纯化技术，如镍柱亲 和纯化，分离纯化诱饵蛋白。
目的
• 制备钓饵蛋白，用于与诱饵蛋白进行相互作用筛 选。
目的
• 将诱饵蛋白和钓饵蛋白导入酵母细胞中， 通过相互筛选找到与诱饵蛋白相互作用的 蛋白质。
目的
• 验证筛选得到的阳性克隆是否真正与诱饵蛋白相互作用。
03 酵母双杂交系统的应用实 例
蛋白质相互作用研究
01 02
蛋白质相互作用研究
酵母双杂交系统能够用于研究蛋白质之间的相互作用，通过将两个蛋白 质分别与转录激活域和转录抑制域融合，观察它们之间的相互作用是否 会导致转录活性的变化。
验证已知相互作用
利用酵母双杂交系统可以验证已知的蛋白质相互作用，从而验证相关生 物学过程的机制。
缺点
由于酵母双杂交系统依赖于真核生物的转录调控机制，因此对于某些在酵母中 不表达或表达水平较低的蛋白质可能无法检测到相互作用。此外，酵母双杂交 实验也可能受到非特异性干扰因素的影响。
02 酵母双杂交系统的实验流 程
目的
• 制备诱饵蛋白，用于筛选与钓饵蛋白相互作用的蛋白质。
步骤
设计诱饵蛋白的基因序列，确 保其在大肠杆菌中表达，并具 有可纯化的标签。
《酵母双杂交系统》课件
01
明确研究目标，确定需要验证的蛋白间相互作用或筛选与特定
蛋白相互作用的候选蛋白。
挑选合适的酵母菌株
02
根据研究目的选择适合的酵母菌株，如用于筛选候选蛋白的酵
母菌株或用于验证已知相互作用蛋白的酵母菌株。
构建诱饵和猎物蛋白的表达载体
03
将目的蛋白分别克隆到酵母表达载体上，构建诱饵和猎物蛋白
的表达载体。
应用领域
蛋白质互作网络研究
利用酵母双杂交系统可以大规模地筛选蛋白质之间的 相互作用，构建蛋白质互作网络。
疾病机制研究
通过研究疾病相关蛋白的相互作用，有助于深入了解 疾病的发生和发展机制。
药物靶点发现
发现新的药物靶点，为药物研发提供新的思路和方向 。
02
酵母双杂交系统的实验流程
准备阶段
确定研究目的
基因表达调控研究
研究转录因子与DNA的结合
利用酵母双杂交系统可以筛选与特定DNA序列结合的转录因子，进而研究其在基因表达调控中的作用 。
发现新的转录因子
通过与已知转录因子的相互作用筛选，可以发现新的转录因子，进一步揭示基因表达调控的机制。
药物发现与设计
寻找药物靶点
利用酵母双杂交系统可以筛选与药物作用靶点相互作用的蛋白质，为药物发现提供潜在 的靶点。
对生命科学领域的影响与贡献
促进基础研究
酵母双杂交系统作为一种强大的研究工具，有助于深入揭示生命 过程的奥秘，推动生命科学领域的基础研究。
疾病机制与治疗研究
通过研究疾病相关蛋白的相互作用，为疾病机制的解析和药物研发 提供有力支持。
生物技术产业
酵母双杂交系统的应用有助于推动生物技术产业的发展，如新药发 现、生物制品开发等。
酵母双杂交技术1
发展背景
酵母双杂交系统是由Fields等在1989年提出的一种在活细 胞中鉴定蛋白质相互作用的遗传系统。
酵母双杂交系统的建立得力于对真核细胞调控转录起始
过程的认识。研究发现，许多真核生物的转录因子都是由 两个可以分开的、功能上相互独立的结构域组成的。
酵母双杂交系统是一种在酵母细胞内分析 蛋白质相互作用的技术。 它可用于： 检验蛋白质间的相互作用； 分析蛋白质相互作用的结构域； 发现新的作用蛋白质。
酵母双杂交技术的原理
基于对真核生物基因调控转录起始过程的认识。 基因转录不仅需要有特定的DNA顺式序列结构，而且也需 要有反式转录激活因子的参与。 转录激活因子往往由两个或两个以上相互独立的结构域构 成,其中有DNA结合结构域(DNA binding domain, DB)和转录激活 结构域(activation domain, AD), 它们都是能激活基因转录，但不同转录激活因子 的DB和AD形成的杂合蛋白仍然具有正常的激活转录的功能。
酵母双杂交操作主要流程
1. 2. 3. 4. 5. 6. 分别构建BD和AD融合蛋白载体 分别将重组载体转化酵母菌细胞 对酵母转化子进行自激活检测 将重组载体共转化酵母菌细胞 检测报告基因表达产物 分析酵母双杂交实验结果
酵母双杂交技术的优点：
1. 是一种细胞内蛋白质相互作用研究技术，比体外的蛋白 质相互作用技术更接近生物体内的真实情况。
如果要研究两个蛋白之间有无相互作用，可以把这两 个蛋白分别与DB和AD形成的融合蛋白。 与DB 融合的蛋白称为“诱饵”(bait)， 与AD融合的蛋白称为“猎物”(prey)。 如果这两个蛋白能发生相互作用, 这两个融合蛋白上的 DB和AD就能重新形成有活性的转录激活因子, 从而激活报告 基因(reporter gene)的转录与表达。通过检测报告基因的 表达产物, 可判别“诱饵”和“猎物”这两个蛋白质之间是 否存在相互作用。
酵母双杂交技术
酵母双杂交常规技术一．双杂交系统原理及应用范围蛋白质之间的互作是很多反应机制分子水平的核心动作，如DNA合成、转录激活、蛋白质翻译、蛋白质定位和信号转导等所有的的反应的完成都涉及到蛋白质复合体的作用。
而随着酵母双杂系统的成熟和完善，其在蛋白质互作研究中的应用越来越广泛。
酵母双杂交系统是基于转录因子的典型结构特征所建立的，它利用了酵母的转录因子GAL4基因产物，该蛋白拥有两个典型的转录因子结构域DNA结合结构域（BD）与转录激活结构域（AD）。
前者结合GAL1启动子区的DNA序列，后者则激活转录（Fields and Song，1989）。
Fields和Song分别构建了含有含有编码GAL4 DNA结合结构域（GAL4BD）和GAL4转录激活结构（GAL4AD）序列的载体。
将我们所要研究的目的基因分别装载到这两个质粒载体中，两个结构域序列则分别与基因的ORF进行融合。
当转入相应酵母菌株后，若在酵母内表达的不同蛋白发生互作，则将使GAL4-BD和GAL4-AD相互靠近结合，再进一步与上游激活序列结合，激活相应报告基因（report gene）的表达。
特点与优点酵母双杂交系统的最主要的应用是快速、直接分析已知蛋白之间的相互作用及分离新的与已知蛋白作用的配体及其编码基因。
酵母双杂交系统检测蛋白之间的相互作用具有以下优点：（1）作用信号是在融合基因表达后，在细胞内重建转录因子的作用而给出的，省去了纯化蛋白质的繁琐步骤。
（2）检测在活细胞内进行，可以在一定程度上代表细胞内的真实情况。
（3）检测的结果可以是基因表达产物的积累效应，因而可检测存在于蛋白质之间的微弱的或暂时的相互作用。
（4）酵母双杂交系统可采用不同组织、器官、细胞类型和分化时期材料构建cDNA文库，能分析细胞浆、细胞核及膜结合蛋白等多种不同亚细胞部位及功能的蛋白。
局限性和存在的问题酵母双杂交系统是分析蛋白-蛋白间相互作用的有效和快速的方法，有多方面的应用，但仍存在一些局限性。
酵母双杂交实验报告
酵母双杂交实验报告一、实验目的酵母双杂交技术是一种用于研究蛋白质之间相互作用的分子生物学方法。
本次实验的目的是通过构建酵母双杂交载体，转化酵母细胞，筛选出与目标蛋白相互作用的蛋白质，从而深入了解蛋白质在细胞内的功能和调控机制。
二、实验原理酵母双杂交系统基于真核转录调控因子的结构和功能特点。
转录调控因子通常由两个结构域组成：DNA 结合结构域（BD）和转录激活结构域（AD）。
这两个结构域单独存在时不能激活转录，但当它们在空间上足够靠近时，则能够协同作用，激活报告基因的表达。
在酵母双杂交系统中，将编码目标蛋白（“诱饵”蛋白）的基因与BD 构建融合表达载体，将待检测的蛋白（“猎物”蛋白）的基因与 AD 构建融合表达载体。
如果“猎物”蛋白与“诱饵”蛋白相互作用，那么 BD 和 AD 就能够在空间上靠近，从而激活报告基因的表达。
通过检测报告基因的表达情况，就可以判断“猎物”蛋白与“诱饵”蛋白是否存在相互作用。
三、实验材料与试剂1、菌株与载体酵母菌株：AH109载体：pGBKT7（含 BD 序列）、pGADT7（含 AD 序列）2、工具酶与试剂盒限制性内切酶：EcoRI、BamHI 等T4 DNA 连接酶质粒提取试剂盒PCR 试剂盒3、培养基YPD 培养基SD 缺失培养基（Leu、Trp、His、Ade 等）4、试剂氨苄青霉素卡那霉素XαGal3-AT（3-氨基-1,2,4-三唑）5、实验仪器恒温培养箱离心机PCR 仪电泳仪凝胶成像系统四、实验步骤1、目的基因的扩增通过 PCR 技术从 cDNA 文库或基因组 DNA 中扩增出目标蛋白和待检测蛋白的编码基因。
设计合适的引物，在引物的 5'端引入限制性内切酶的酶切位点。
2、载体的构建分别用限制性内切酶对目的基因和载体进行双酶切，然后通过 T4 DNA 连接酶将目的基因连接到载体上。
将连接产物转化到大肠杆菌感受态细胞中，筛选出阳性克隆，提取质粒进行酶切鉴定和测序验证。
酵母双杂交技术原理
酵母双杂交技术原理
酵母双杂交技术是一种DNA定向克隆的分子生物学技术，又称为抗性转移技术。
它利用细胞壁抗生素的抗性性质作为分子生物学过程的引物，分子生物学的原理是利用噬菌体感染酵母的策略，将目标DNA 片段转移到仅有两种抗性的酵母菌中去。
具体的操作步骤如下：首先制备携带乙醇容抗体型剂量胞壁抗生素的噬菌体，再将酵母菌与这些抗生素装载的噬菌体混合放置，此时目标DNA会受到噬菌体的选择性感染，而不会感染来源酵母菌，进而将目标DNA进行吸收，最后再使酵母双向繁殖，最终形成携带抗性基因的酵母菌。
酵母双杂交自激活
蛋白质相互作用在细胞生物学和疾病中的作用。
此外，酵母双杂交系统还可以用于筛选新的药物靶点或鉴定新
03
的治疗策略。
酵母双杂交系统的优缺点
优点
酵母双杂交系统具有高灵敏度和特异性，能够检测到低亲和力的相互作用。此外 ，它还具有高通量和高可重复性的特点，可以同时检测多个蛋白质之间的相互作 用。
缺点
然而，酵母双杂交系统也存在一些局限性。例如，它可能受到酵母细胞内其他因 素的影响，导致假阳性结果。此外，由于酵母细胞与人类细胞存在差异，因此某 些在酵母细胞中检测到的相互作用可能无法在人类细胞中重现。
蛋白质的相互作用可以通过多种方式进 在酵母双杂交实验中，了解蛋白质之间 行，例如通过蛋白质的直接接触或通过 的相互作用有助于预测自激活的可能性， 与它们相关的其他分子之间的相互作用。 并采取措施避免或减少这种现象的发生。
基因表达水平的影响
基因表达水平对酵母双杂交自激活也有重要影响。当一个基因的表达水平过高时， 它可能会产生过多的蛋白质，导致自激活。
2
该系统基于两种基本的酵母转录因子，即GAL4 和STE12，它们可以分别与DNA结合并激活转录。
3
当一个转录因子与另一个转录因子结合时，它们 可以形成一个杂合二聚体，从而激活转录。
酵母双杂交系统的应用
01
酵母双杂交系统被广泛应用于研究蛋白质之间的相互作用，特 别是在信号转导和转录调控领域。
02
它可以帮助科学家确定蛋白质相互作用的结构基础，以及研究
酵母双杂交自激活
目录
• 酵母双杂交系统简介 • 酵母双杂交自激活的发现与确认 • 酵母双杂交自激活的影响因素
目录
• 酵母双杂交自激活的调控策略 • 酵母双杂交自激活的实际应用 • 未来展望与研究方向
酵母双杂交 原理
酵母双杂交原理酵母双杂交（Y2H）是一种广泛应用于分子生物学领域的实验技术。
它基于酵母细胞内所含的转录因子结合区域分开的与激活区域结合的能力的原理而发展出来。
当把转录因子分成两个区域，一个称为DBD（DNA binding domain），另一个称为AD（activation domain），并使它们相互独立地与相应的配体结合时，它们就可以进行有效的转录激活。
通常来说，DBD和AD都不具有激活作用，但它们可以相互结合并发挥起激活作用。
因此，当DBD与某一DNA序列结合时，如果另一配体结合于AD，则该复合体就可以被转录激活。
基于这个原理，Y2H技术使用酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）作为实验系统进行实验。
它使用了两个重要的质粒：一个称为“鱼钩”质粒（bait plasmid），它含有DBD和一个感兴趣的基因的DNA序列；另一个称为“猎物”质粒（prey plasmid），它含有AD和另一感兴趣的基因的DNA序列。
这两个质粒分别要被转化到两个不同的酿酒酵母分别作为它们的基因组。
当两个酵母的基因组都被转化后，它们被分别引入到含有选择性培养基的平板中去。
在这些平板上，只有那些同时表达了成功酯化的双杂交融合DBD和AD的细胞才能成长起来。
因此，这个实验系统几乎可以保证筛选到高亲合力的蛋白质因子。
值得注意的是，由于酿酒酵母是真核生物，与含有DBD和AD的两个质粒的匹配也是在真核生物级别上完成的，而不是简单的受体和配体之间的作用。
因此，这种技术可以很好地模拟在真核生物细胞内发生的相互作用。
Y2H技术不仅可以用于蛋白质因子的筛选，也可以用于检测DNA的相互作用。
例如，在要求蛋白质－DNA相互作用的特定细胞系上建立的实验系统中，可以使用这种技术来筛选那些与基因诱导子结合的转录因子。
因此，该技术可用于分析人类疾病中蛋白质相互作用的发生机制。
总的来说，酵母双杂交技术是一种强大而有效的分子生物学工具，可以用于研究蛋白质之间的相互作用以及转录机制。
酵母双杂交系统技术介绍.ppt
主要内容
• 酵母双杂交的背景介绍 • 酵母双杂交的基本原理 • Clontech 酵母双杂交系统 • 常见问versal Pr量 大大降低假阳性 更高的基因代表性
混合
DD
取1ml菌液按 照一定比例 用LB稀释， 150ul/板进 行涂板，过 夜培养。
在GAL4 based双杂交系统中:
GAL4 AD
Reporter Gene
基本原理: 三个启动子，四个报告基因
获得阳性克隆子
报告基因表达
AbA 抗性筛选
X-a-gal 蓝白筛选
Ade 营养筛选
His 营养筛选
M1
G1
G2
主要内容
• 酵母双杂交的背景介绍 • 酵母双杂交的基本原理 • Clontech酵母双杂交系统 • 常见问题分析
酵母单杂交-蛋白与DNA的相互作用
• Matchmaker™ Gold Yeast One-Hybrid Library Screening System （630491）
酵母双杂交-蛋白与蛋白的相互作用
• Matchmaker™ Gold Yeast Two-Hybrid System（630489） • Make your own “Mate & Plate™”library System (630490)
基本原理: 酵母双杂交参考文献
• Nature. 1989 Jul 20;340(6230):245-6.
• A novel genetic system to detect protein-protein interactions. • Fields S, Song O. • Department of Microbiology, State University of New York at Stony
酵母双杂交技术
酵母双杂交技术引言酵母双杂交技术是一种常用的分子生物学技术，用于研究蛋白质-蛋白质相互作用。
该技术能够检测和分析细胞内发生的蛋白质-蛋白质相互作用，帮助科学家了解细胞信号传导、代谢途径和疾病发生机制。
本文将介绍酵母双杂交技术的原理、应用和优缺点。
原理酵母双杂交技术利用酵母细胞（通常是酿酒酵母）作为表达蛋白质的平台，通过操纵DNA序列，使得感兴趣的两个蛋白质分别与酵母细胞内的两个杂交域相连。
当两个蛋白质相互作用时，通过激活或抑制报告基因的表达来检测相互作用的发生。
具体来说，酵母双杂交技术包括以下几个步骤：1.构建融合基因表达质粒：将感兴趣的两个蛋白质的编码序列插入特定的表达质粒中，其中一个蛋白质与活化域相连，另一个蛋白质与靶向域相连。
2.转化酵母细胞：将构建好的表达质粒导入酵母细胞中，使其能够表达融合蛋白质。
3.遴选正交剪切位点：利用酵母细胞染色质中的正交剪切位点，确保融合蛋白质能够发挥其相互作用。
4.检测相互作用：通过报告基因（如荧光蛋白）的表达情况来检测融合蛋白质之间的相互作用程度。
一般来说，如果两个融合蛋白质相互作用，则报告基因被激活，表达结果可通过荧光显微镜观察或酵母细胞生长的特征来检测。
应用1.蛋白质相互作用网络研究：酵母双杂交技术可以帮助科学家构建蛋白质相互作用网络，了解细胞内不同蛋白质之间的相互关系和调控机制。
2.疾病相关蛋白质研究：酵母双杂交技术可以用于筛选和鉴定一些与疾病相关的蛋白质，帮助研究人员深入了解疾病的发生机制，并开发新的治疗方法。
3.药物靶点筛选：酵母双杂交技术可以用于筛选药物靶点，帮助研究人员发现新的药物靶点，从而加速药物研发过程。
优缺点酵母双杂交技术具有以下优点：•高通量：酵母双杂交技术可以同时检测大量蛋白质之间的相互作用，有助于加速研究的进程。
•对新蛋白质相互作用的发现：酵母双杂交技术可以帮助发现未知的蛋白质相互作用，有助于揭示新的细胞信号传导途径和代谢途径。
•相对简洁易行：酵母双杂交技术不需要复杂的实验设备，相对容易实施。
酵母双杂交
阻止它们的相互作用以达到治疗疾病的目的。
4、建立基因组蛋白连锁图
众多的蛋白质之间在许多重要的生命活动中都是彼 此协调和控制的。基因组中的编码蛋白质的基因之间存在 着功能上的联系，通过基因组的测序和序列分析发现了很
1、发现新的蛋白质和蛋白质的新功能
酵母双杂交技术已成为发现新基因的主要途
径。用已知基因作诱饵，利分离得到AD-Library载体，对其进行
测序并在GenBank中进行比较，可以得到与已知
基因在生物学功能上的联系。另外，也可作为研 究已知基因的新功能或多个筛选到的已知基因之 间功能相关的主要方法。
酵母转录因子（Gal 4）
与BD-fusion ---诱饵蛋白（bait protein ） 与AD-fusion ---猎物或靶蛋白（prey or target protein）
报告基因（reporter gene）
---Lac Z（编码β -半乳糖苷酶）
报道株
经改造的、含报告基因的重组质粒的宿 主细胞。 酵母细胞作为报道株的酵母双杂交系统具有 许多优点:
多新的基因和EST序列。
HUA等人利用酵母双杂交技术，将母双杂交技术，绘制出了人与致病性细菌
蛋白，从而找到基因之间的联系，建立基因组蛋白连锁图。
蛋白间相互作用的基因组蛋白网络连锁图，为深入研究人
与致病菌间的相互作用关系奠定了基础。
五、酵母双杂交的应用
酵母双杂交系统是在真核模式生物酵母中进行的， 研究活细胞内蛋白质相互作用，对蛋白质之间微弱的、 瞬间的作用也能够通过报告基因的表达产物敏感地检 测得到，它是一种具有很高灵敏度的研究蛋白质之间 关系的技术。
酵母双杂交实验原理及具体步骤
酵母双杂交原理：酵母双杂交（Yeast two-hybrid，Y2H）是一种常用的蛋白质相互作用研究技术，用于检测蛋白质间的物理相互作用关系。
其原理基于转录因子的两个功能域的可拆分性。
①转录因子可拆分性：构建酵母诱饵（bait）和猎物（prey）表达载体：将目标蛋白分别将其编码序列分别克隆到两个表达载体中。
其中，诱饵载体通常包含一个“催化域”（activation domain，AD），用于连接目标蛋白和转录激活子域；猎物载体通常包含一个“DNA结合域”（DNA binding domain，BD），与转录因子的靶位点序列结合。
通过将目标蛋白的相互作用引入到转录因子中，可以重新组装功能域并激活报告基因表达。
②目标蛋白的诱饵和猎物构建：将目标蛋白分别克隆到诱饵载体和猎物载体中。
诱饵载体中的目标蛋白与BD结合，形成诱饵蛋白-BD复合物；猎物载体中的目标蛋白与AD结合，形成猎物蛋白-AD复合物。
③互补的转录因子和报告基因：将诱饵和猎物载体转化到同一酵母细胞中，诱饵蛋白与猎物蛋白发生相互作用后，诱饵蛋白的BD域与猎物蛋白的AD域重新组装为完整的转录因子。
该转录因子能够结合到特定的报告基因启动子上，激活报告基因的表达。
④报告基因表达和筛选：通过培养在所选的选择性培养基上，只有发生了特定蛋白相互作用的酵母细胞才能生长。
选择性培养基可能缺乏某些必需营养物质，当酵母菌株与目标蛋白质发生相互作用时，新的遗传特征和功能产物的表达则能够弥补酵母细胞在选择性培养基上的缺陷。
例如，当使用缺乏组氨酸（histidine）的培养基时，只有酵母菌株表达了完整的转录因子，才能够合成组氨酸并正常生长。
⑤结果验证：据此可以筛选出具有蛋白相互作用的酵母突变株。
验证通常通过进一步的亲和试验（如共免疫沉淀）或其他技术（如荧光共定位）来确认蛋白质相互作用的可靠性。
总体来说，酵母双杂交实验通过利用转录因子可拆分性的原理来检测蛋白质的相互作用。
酵母双杂交技术的原理及应用
酵母双杂交技术的原理及应用酵母双杂交技术，听上去挺高级的名词对吧？别慌，其实它跟我们日常生活中的“拼爹”有点类似，不过它是在生物学里面玩的花样。
想象一下，你有两个朋友，想知道他们俩会不会成为超级好基友，那你可以用这个技术来一探究竟。
我们得有两种酵母，就像是两个潜在的基友候选人。
然后，我们给它们点刺激，让它们有机会结识、互动。
这个“刺激”就是让它们的基因混合在一起，看看能不能擦出什么火花。
这种技术背后的原理挺复杂，但想象成两个人打牌，要看看谁的牌更配对，就差不多了。
酵母也是，我们看它们的基因配对，看看哪些特征能够“一拍即合”。
而这个技术的应用可不少，不仅仅是让酵母们交朋友，还能帮助科学家们研究基因、了解生物的运作规律。
有了它，科学家们能够更准确地探索基因是如何影响生物性状的，就像解开谜题一样。
想象一下，如果你是一位厨师，你可能想知道为什么有些酵母可以让面包发得特别好吃，而有些却不行。
用这个技术，科学家们可以找出关键的基因，然后想办法让所有的面包都发得又快又好，那不就是个厨艺大咖吗？不过，别小看了这些酵母们，它们可是科学研究中的一把好手。
有了它们，科学家们能够在实验室里模拟各种情况，看看不同的基因组合会带来什么变化。
这就好像是一场“基因大混搭”，只不过最后得到的是科学数据，而不是时髦的搭配。
说到这些，我想起了一句俗语：“物以类聚，人以群分”。
这个技术就像是在研究生物界的“朋友圈”，看看谁跟谁更亲密、更默契。
也像是在研究生物界的“CP”配对，想知道哪些基因组合才是最佳拍档。
这个技术也有它的局限性。
酵母们虽然看起来基因搭配很好，但实际上在生活中却不一定能搭伙儿。
这就像是有些人看起来合得来，但真正相处起来可能却“水火不容”。
酵母双杂交技术不仅仅是一种实验方法，它还是科学探索的一把利器。
通过它，科学家们可以深入探索生物世界的奥秘，了解基因如何影响生物的种种特性。
就像探险一样，每次实验都是一次挖掘未知的冒险，不知道会有什么惊喜等着我们。
请详述酵母双杂交的基本原理和具体操作步骤。
请详述酵母双杂交的基本原理和具体操作步骤。
酵母双杂交是一种常用的实验技术，用于研究蛋白质相互作用和基因功能。
酵母双杂交的基本原理是利用酵母细胞中的转录激活因子来检测两个蛋白质相互作用。
该技术基于转录激活因子在酵母细胞中诱导报告基因表达的原理。
核心思想是将需要检测
相互作用的两个蛋白质分别与两个互补的转录激活因子结合，从而使这两个转录激活因子
相互结合并激活报告基因的表达。
具体操作步骤如下：
1. 构建酵母双杂交载体：
- 选择一个载体，将一种转录激活因子的DNA序列插入该载体中的启动子和报告基因
之间，构建转录激活因子的融合蛋白。
- 在另一个载体上将另一种转录激活因子的DNA序列插入该载体中的启动子和报告基
因之间。
2. 转化酵母细胞：
- 将上述构建好的双杂交载体分别转化进酵母细胞中。
这一步骤常用的方法有直接转化、化学转化或电击转化。
- 在转化后，将酵母细胞培养至适当的条件，以使其能够自我复制并表达融合蛋白。
3. 鉴定蛋白相互作用：
- 将转化后得到的酵母细胞分别进行孵育和培养。
- 如果两个融合蛋白能够相互结合，其结合后的转录激活因子能激活报告基因的表达，则酵母细胞会在选择性培养基上生长，形成菌落。
- 将生成的菌落进行筛选和鉴定，确定其是否存在转录激活作用。
常用的方法有β-
半乳糖苷酶报告基因检测、荧光素酶报告基因检测等。
通过上述酵母双杂交的基本原理和具体操作步骤，可以很方便地研究蛋白质相互作用
和基因功能。
酵母双杂交技术应用进展
酵母双杂交技术应用进展酵母双杂交技术是一种强大的生物技术方法，用于研究蛋白质之间的相互作用。
这项技术自20世纪80年代问世以来，已经广泛应用于基因功能研究、药物研发和生物技术应用等领域。
本文将介绍酵母双杂交技术的原理、应用进展及未来展望。
酵母双杂交技术是基于真核生物体内两个互补的转录因子，即GAL4和DBD-VP16，以及一个含有报告基因的载体穿梭质粒构建而成的。
在该技术中，一个转录因子（DBD-VP16）与一个诱饵蛋白结合，另一个转录因子（GAL4）与目标蛋白结合。
当诱饵蛋白与目标蛋白相互作用时，两个转录因子将形成一个复合物，该复合物将激活报告基因的表达。
通过检测报告基因的表达情况，可以确定蛋白质之间的相互作用。
基因功能研究酵母双杂交技术已成为研究基因功能的重要工具。
通过使用该技术，科学家们可以筛选出与特定基因相互作用的其他基因，从而揭示基因在细胞中的功能。
例如，一项研究发现人类肺癌细胞中抑癌基因TP53的相互作用蛋白，从而为肺癌治疗提供新的思路1。
在药物研发方面，酵母双杂交技术也发挥了重要作用。
通过该技术，科学家们可以筛选出能够与特定药物靶点相互作用的小分子化合物，从而发现新的药物候选。
例如，利用酵母双杂交技术成功发现了一种能够抑制乳腺癌细胞增殖的新药候选2。
酵母双杂交技术在生物技术应用方面也具有广泛的应用价值。
例如，利用该技术成功克隆了一个编码具有工业应用价值的酶的基因，并实现了该基因的高效表达3。
酵母双杂交技术还被用于构建具有重要应用价值的基因调控网络。
随着基因组学、蛋白质组学和代谢组学等研究的深入发展，酵母双杂交技术的应用前景将更加广阔。
在基因组学领域，利用酵母双杂交技术可以揭示基因之间的相互作用和调控关系，有助于深入理解生命活动的复杂性。
在蛋白质组学领域，酵母双杂交技术可以应用于蛋白质相互作用的研究，为揭示生物学过程和疾病机制提供有力支持。
在代谢组学领域，酵母双杂交技术可以帮助研究代谢物之间的相互作用和调控机制，为代谢调控和代谢性疾病研究提供新的视角。
酵母双杂交原理和具体流程
酵母双杂交原理和具体流程下载温馨提示:该文档是我店铺精心编制而成，希望大家下载以后，能够帮助大家解决实际的问题。
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酵母双杂交是一种利用酵母遗传学方法来研究蛋白质相互作用的技术。
酵母双杂交系统
酵母双杂交的原理
• 利用酵母作为真核鉴定蛋白的相互作用 • 使用不同的培养基筛选阳性克隆
• 双杂交系统的两个重要元件：
• 转录激活因子： DNA结合结构域（DNA binding domain， 简称为DB）和转录激活结构域（activation do筛选相互作用的蛋白
序列分析
酵母双杂交系统 的优点与缺点
再次，双杂交鉴定过程中要经过两次转化，而且，酵母细胞的转化效率比细菌要低约4个数量级。
对于认识一些重要的生命活动：如信号传导、代谢途径等有重要意义。
将诱饵质粒转化缺乏报告基因启动子的酵母细胞株中，选择被转化的酵母
Bait Protein
Prey Protein
DNA-Binding Domain
DNA-Binding Site
Rep4或LexA或其他合适蛋白的DNA结合域融合构 建诱饵质粒
• 将诱饵质粒转化缺乏报告基因启动子的酵母细胞株中，选择被 转化的酵母
GAL 4 DNA-BD
GAL 1 UAS
GAL 4 AD Promoter
Transcription GAL1
Protein X GAL 4 DNA-BD
GAL4 AD protein Y
Protein X
GAL 4 DNA-BD
GAL 1 UAS
GAL 4 AD Protein Y
Transcription
DNA-Binding Site
酿酒酵母的GAL4蛋白质N-端和C-端分别融合的两种蛋白质相互作用可激活具有UAS（upstream activating sequence，上游激活序列）
报告基因的表达
将待测基因与Gal4或LexA或其他合适蛋白的DNA结合域融合构建诱饵质粒
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4/11/2021 • 15
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Clontech MM系统: 蛋白互作基本流程
Clont802 （传统型） 预制酵母菌： 630480 （均一化，通用型）
酵母双杂交系统： 630489 酵母菌转化试剂盒： 630439 酵母培养基（套装）： 630495 插入片段检测： 630497 酵母质粒提取： 630467▪ 分装，冻存 ▪1ml mating
GGG CCC
GGG CCC
酵母双杂交系统技术介绍
AAAAAAAAA TTTTTTTT
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LD-PCR
AAAAAAAA TTTTTTTT
4/1法
▪ SMART合成cDNA ▪共转化，涂板
酵母双杂交系统技术介绍
4/11/2021 • 7
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背景介绍: Matchmaker Gold系统原理
Reporter Gene
酵母双杂交系统技术介绍
Reporter Gene
Reporter Gene
4/11/2021 • 8
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主要内容
• 酵母双杂交的背景介绍 • 酵母双杂交的基本原理 • Clontech 酵母双杂交系统 • 常见问题分析
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Clontech MM系统的优点
异常 简便
SMART方法与同源重组技术结合构建 ，聪明的酵母自己做克隆。抗性 筛选
AbA抗性筛选的添加，有效抑制背景 生长，大续与a型菌株Y2H Gold进行mating 直接筛选。
酵母双杂交系统技术介绍
Brook, Stony Brook 11794.
酵母双杂交系统技术介绍
63000次引用
4/11/2021 • 10
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基本原理: GAL4转录因子的结构
DNA-BD
AD
BD 结合结构域
GAL4 蛋白具有两个功能结构域
AD 激活结构域
酵母双杂交系统技术介绍
4/11/2021 • 11
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基本原理: GAL4转录因子的分子机理
蛋白质相互 作用研究
酵母双杂交系统技术介绍ห้องสมุดไป่ตู้
4/11/2021 • 3
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背景介绍: 为什么要研究蛋白互作？
发现新的蛋白质和蛋白质的新功能 在细胞体内研究抗原和抗体的相互作用 筛选药物的作用位点 研究药物对蛋白质之间相互作用的影响 建立基因组蛋白连锁图
酵母双杂交系统技术介绍
4/11/2021 • 4
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体内验证： 630489 630305 体外Co-IP验证： 630458 630459 631723 631604
酵母双杂交系统技术介绍
4/1法
▪ SMART合成cDNA
AAAAAAAAA
▪共转化，涂板 ▪ 培养，收集菌液
GGG CCC
AbA 抗性筛选
X-a-gal 蓝白筛选
Ade 营养筛选
His 营养筛选
M1
酵母双杂交系统技术介绍
G1
G2
4/11/2021 • 13
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主要内容
• 酵母双杂交的背景介绍 • 酵母双杂交的基本原理 • Clontech酵母双杂交系统 • 常见问题分析
酵母双杂交系统技术介绍
4/1选
背景介绍: Clontech 酵母双杂交系统的功能
发现新的与已知蛋白互作的蛋白 鉴定两个蛋白之间的相互作用
确定蛋白相互作用的区域
酵母双杂交系统技术介绍
4/11/2021 • 5
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背景介绍: Clontech分子生物学工具
Gene discovery
Gene Function
Gene Expression
酵母双杂交系统 技术介绍
宝日医生物技术（北京）有限公司
April 11, 2021
主要内容
• 酵母双杂交的背景介绍 • 酵母双杂交的基本原理 • Clontech 酵母双杂交系统 • 常见问题分析
酵母双杂交系统技术介绍
4/11/2021 • 2
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背景介绍: 关注蛋白质
蛋白组时代
蛋白质功能
生物信息学 的发展
酵母双杂交-蛋白与蛋白的相互作用
• Matchmaker™ Gold Yeast Two-Hybrid System（630489） • Make your own “Mate & Plate™”library System (630490)
酵母三杂交—三个蛋白之间的相互作用
• pBridge Three-Hybrid Vector （6301ml mating
酵母双杂交系统技术介绍
4/1法
▪ SMART合成cDNA ▪共转
酵母双杂交系统技术介绍
4/11/2021 • 19
酵母双杂交系统技术介绍
Clontech
Matchmaker™
4/11/2021 • 6
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背景介绍: Matchmaker Gold 系统
酵母单杂交-蛋白与DNA的相互作用
• Matchmaker™ Gold Yeast One-Hybrid Library Screening System （630491）
酵母双杂交系统技术介绍
4/11/2021 • 9
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基本原理: 酵母双杂交参考文献
• Nature. 1989 Jul 20;340(6230):245-6.
• A novel genetic system to detect protein-protein interactions. • Fields S, Song O. • Department of Microbiology, State University of New York at Stony
正常情况在酵母细胞内:
GAL UAS
Promoter
Transcription gal metabolic gene
在GAL4 based双杂交系统中:
GAL4 AD
Reporter Gene
酵母双杂交系统技术介绍
4/11/2021 • 12
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基本原理: 三个启动子，四个报告基因
获得阳性克隆子
报告基因表达