基因工程清单

专题一基因工程清单

1.基因工程的概念：基因工程是指按照人们的愿望，进行严格的设计，通过【体外DNA重组和转基因】技术，赋予生物以新的遗传特性，创造出更符合人们需要的新的【生物类型和生物产品】。基因工程是在【DNA分子水平】上进行设计和施工的，又叫做【DNA重组技术】。

※①操作环境:生物体外；②操作对象:基因（DNA）；③操作水平:分子水平；

④实质（原理）：基因重组；⑤供体：提供目的基因；⑥受体：表达目的基因。

⑦特点:打破物种界限，定向改造生物遗传特性。

⑧基因工程取得成功的原因：DNA基本单位和空间结构相同（成功拼接）；生物界共用一套遗传密码（成功表达）。

2.基因工程的基本工具（工具和工具酶的关系）

（1）“分子手术刀”——【限制性核酸内切酶-限制酶】

①来源：主要是从【原核生物】中分离纯化出来的。（2012已考）

②功能：能够识别双链DNA分子的某种【特定的核苷酸序列】，并且使每一

条链中特定部位的两个核苷酸之间的【磷酸二酯键】断开，具有【专一性】。

③结果：产生【黏性末端或平末端】。

※①获得某个特定性状的基因（目的基因），必须分别在目的基因的上游和下游

用限制酶酶切（2个切口），可产生4个黏性末端（目的基因两侧各有一个黏性末端）。

②目的基因两侧最好用不同的限制酶切形成两个不同的粘性末端，同时，切割目的基因的限制酶和切割运载体的限制酶要形成相同的黏性末端或平末端。这样有利于构建基因表达载体时，避免产生目的基因-目的基因、运载体-运载体及目的基因反向和运载体拼接等拼接产物。

③限制酶识别序列及切割位点的特点：同一条链上沿中轴线对称的碱基互补，因而在其互补链上有相同的识别序列和切割位点；如果切割位点（磷酸二酯键）两端碱基互补，则形成平末端，否则为黏性末端。

④不同的限制酶可能形成相同的黏性末端。

（2）“分子缝合针”——【DNA连接酶】（2012已考）

①种类：【E·coliDNA连接酶】和【T

DNA连接酶】

4-

②相同点：都缝合【磷酸二酯键】。

③区别：E·coliDNA连接酶只能将双链DNA片段互补的【黏性末端】之间的

DNA连接酶能缝合【两种末端】，但连接平末端【磷酸二酯键】连接起来；而T

4

的之间的效率较低。

④与DNA聚合酶作用的异同：DNA聚合酶只能将【单个核苷酸】加到已有的核苷酸片段的末端，形成磷酸二酯键，因此需要模板和引物；DNA连接酶是将【两个DNA片段的末端】连接，形成磷酸二酯键。

（3）“分子运输车”——载体

①载体具备的条件：能在受体细胞中复制并稳定保存；具有一至多个限制酶切点，供不同外源DNA片段插入；具有标记基因，供重组DNA的鉴定和选择。

②最常用的载体是质粒，它是一种裸露的、结构简单的、独立于细菌染色体之外，并具有自我复制能力的双链环状DNA分子。

③其它载体：噬菌体的衍生物、动植物病毒。（2012已考）

3.基因工程的基本操作程序“四部曲”

第一步：目的基因的获取

①目的基因：是指编码蛋白质的结构基因（含具有调控作用的因子）。

②获取途径：

A.从基因文库中分离提取获取:

※基因文库含有某种生物不同基因的受体菌的群体，每个受体菌分别含有这种生物的不同的基因。

※基因组文库和cDNA文库的主要区别在于有无非编码序列，如启动子、内含子等。B.人工合成:

a.已知结构基因的核苷酸序列化学方法人工合成；如蛋白质工程中推测的目的基因。

b.真核生物一般用反转录法:用mRNA为模板反转录产生互补的DNA(原理-2017高考）；

c.PCR技术扩增：又称多聚酶链式反应，其实质是【在体外对目的基因进行大量复制】。

原理：DNA双链复制过程：

步骤：第一步：热变性（加热至90～95℃DNA解链）；第二步：复性（冷却到55～60℃，引物结合到互补DNA链）；第三步：延伸（加热至70～75℃，热稳定DNA聚合酶从引物起始互补链的合成）。

条件：模板（目的基因的两条核苷酸链）、引物（2种）、Taq酶、原料（4种）

※与细胞内DNA复制的区别：解旋过程不需要DNA解旋酶，复制过程需要耐热的DNA聚合酶，呈指数式增长（2n个，其中两条模板链不含引物），PCR一般要经历三十多次循环，而生物体内DNA复制受生物体遗传物质的控制。

第二步：基因表达载体的构建（基因工程的核心步骤）

①目的：使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可以遗传至下一代；同时使目的基因能够表达和发挥作用。

②组成：目的基因＋启动子＋终止子＋标记基因+复制原点

启动子：是一段有特殊结构的DNA片段，位于基因的首端，是RNA聚合酶识别和结合的部位，能驱动基因转录出mRNA，最终获得所需的蛋白质。（和起始密码不同）

终止子：也是一段有特殊结构的DNA片段，位于基因的尾端，使转录在需要的地方停止。标记基因：鉴别并筛选含有目的基因的受体细胞。常用的标记基因是抗生素基因（筛选时在培养基中加入标记基因对应的物质，如相应的抗生素）。

※构建基因表达载体时选择限制酶的标准：切割目的基因两侧形成的两个末端不同，切割载体形成的两个末端分别和目的基因的两个末端相同；不破坏目的基因、启动子等结构，不破坏有利于选择含目的基因的受体细胞的标记基因结构。

第三步：将目的基因导入受体细胞_

转化：目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程；其实质是基因重组。

导入目的基因的方法：

A.导入植物细胞：采用最多的方法是【农杆菌转化法】（农杆菌中的Ti质粒上的T-DNA 可转移至受体细胞，并整合到受体细胞染色体的DNA上），其次还有【基因枪法】和【花粉管通道法】。

B.导入动物细胞：常用的方法是显微注射技术。受体细胞是受精卵或重组胚胎。

C.导入微生物细胞：感受态细胞转化法

①原核生物作为受体细胞的原因是【繁殖快、多为单细胞、遗传物质相对较少】，最常用的原核细胞是【大肠杆菌】。②其转化方法是（感受态细胞转化法）：先用Ca2+ 处理细胞，使其成为【感受态细胞-具有吸收DNA分子的能力】，再将重组表达载体DNA分子溶于【缓冲液】中与感受态细胞混合，促进感受态细胞吸收DNA分子，完成转化过程。

※重组表达载体DNA分子(重组质粒）导入受体细胞后，在培养基中加入与标记基因表达产物对应的物质如抗生素，筛选含有基因表达载体的受体细胞，依据是标记基因是否表达。第四步：目的基因的检测和表达

分子水平检测:

①检测转基因生物的染色体DNA上是否插入了目的基因：方法是采用DNA分子杂交技术