组织学制片技术
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组织学制片技术
目的要求
1、了解组织学制片的基本程序；
2、熟悉HE染色的步骤；
3、掌握HE染色结果的观察。
一、组织学常用的几种标本类型
1．切片标本：组织经固定、切片（包括冰冻 切片、石蜡切片及火棉胶切片）染色、封固 而制成的各种玻片标本。它为组织学中最常 用的标本。
2．铺片标本：将肠系膜或皮下组织铺于载 玻片上，经固定、染色、封固而制成的标 本。
3、常用的透明剂有二甲苯、甲苯、氯仿等。 二甲苯：透明组织的能力强，但易使组织收缩和 变脆，故在二甲苯中不宜搁置太久。 氯仿：其透明能力远比二甲苯慢，透明时间可以 延长至24小时也无妨。
（五）包埋
1． 目的：由于生物体的组织有各种硬度不同的成份， 必须加石蜡等作支持物质渗入组织块内部，并将组织 块包埋起来，然后用切片机以制作极薄的切片。 2． 种类：包埋物质目前广泛采用的除石蜡外，还有 火棉胶、炭蜡、明胶以及环氧树脂、OTC(冰冻切片包 埋剂）等。
1、动物致死法： （1）颈椎脱臼法 （2）断头法 （4）空气栓塞法：
2、组织取材时应注意： (1)所取材料越新鲜越好； (2) 切取组织的刀剪刃口必 须锋利； (3) 取材时必须考虑切面的 方向； (4)组织块应力求小而薄； (5)收缩较大的新鲜组织； (6)注意清洁； （3）麻醉法
（三）标本的固定
8．活体标本：在组织细胞生活状态下进行观察 的标本，或生活状态下进行活体染色后制成 的标本。
9 ．血管注射标本： 一种是将树脂类铸形剂经血管灌 注后，用强酸或强碱腐蚀血管周围组织而制成的血管 铸形标本，可瓶装供肉眼观察或进一步处理后作扫描 电镜观察。另一种是将染料加明胶配制成染色液注入 血管内，然后取材、固定、包埋、切片和封固所制成 的组织切片标本。这类标本主要用于了解血管的走行 及其与所支配组织或器官的相互关系。
5．固定后处理
材料固定后，药剂继续留在组织中，易使组
织破坏，必须用水或酒精洗去。 三种方式进行处理： （1）流水冲洗（铬酸或铬酸盐固定的组织）； （2）酒精充分洗涤（Bouin’s液含苦味酸）； （3）直接入脱水剂。
（四）脱水与透明
1、目的 ：脱水与透明的目的在于为石蜡渗透 至组织块内部以便进一步包埋做必要的准备。 脱水必须从低浓度开始，逐渐转入高浓度脱水 剂。另外脱水必须进行得很彻底。 2、常用脱水剂： （1）酒精： （2）丙酮：
3．涂片标本：主要是将液态组织如血液、骨髓、痰 液、腹水、精液等液体涂抹于载玻片上，经固定、染 色制成的组织标本，以供观察细胞的形态与其微细结 构。
血液涂片
宫颈涂片
4．磨片标本：不经脱钙及切片手续，而直接用 手工在磨石上磨制成薄片，以便在显微镜下观 察的骨、牙磨片标本。
大丽紫染色
5．分离标本：将极小组织块用化学药物的水溶液浸 泡后，溶去其细胞间质，采用机械分离方法（如振 荡、针拨等方式）使之分离成单个而又完整的细胞， 经染色后涂于载玻片上进行镜检。
满蜡，待包埋盒表面的
熔蜡凝固后，将其移入
加冰块的冷水中加速凝
固，包埋即告完成。
1
70%乙醇
常温
12～24h
组 织 块 处 理 时 间 表
2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13
80%乙醇 90%乙醇 95%乙醇Ⅰ 95%乙醇Ⅱ 100%乙醇Ⅰ 100%乙醇Ⅱ 二甲苯Ⅰ 二甲苯Ⅱ 石蜡Ⅰ 石蜡Ⅱ 石蜡Ⅲ 石蜡Ⅳ
1．固定的目的
使细胞内蛋白质凝固，终止或抑制外源性和内源性
酶活性，防止组织自溶；使组织成份转变为不溶性
物质从而有利于保存。这就是固定的基本意义。
2．固定的注意事项
(1)组织块不宜太大，一般以厚度为 2毫米，长度不超 过0.5厘米*0.5厘米。 (2) 固定液的量一般以组织块大小的 30 倍为宜，最好 在固定组织的瓶底垫上脱脂棉或几层纱布以使固定液 能从上下左右前后各方都能渗入组织块。 (3)固定的时间，一般以24小时为宜。
常温 常温 常温 常温 常温 常温 常温 常温 48~50℃ 48~50℃ 58~60℃ 58~60℃
石蜡包埋法：
商品石蜡 的处理： 反复溶化以增加石蜡的硬度
和密度。
浸蜡 ：
温度不能超过该石蜡的溶点 的2℃以上；1~2h 。
包埋：通常使用包 埋盒。
包埋通常使用组织包埋机、包埋盒及配套使用的
不锈钢模具。把熔蜡倒入模具内，再用加热的弯曲钝
头镊子夹取已经过浸蜡的组织块，使切面朝下平正地
置放于模具底面的中央处，然后放上包埋盒，继续加
二、组织切片的常规制作 （一） 概述
组织切片的制作方法有：石蜡切片法、冰冻切片
法、火棉胶切片法、超薄切片（电镜标本）、树脂切
片、碳蜡切片等。石蜡切片法是最常用的方法，本节 将较详细讲授其制作步骤。
组织切片制作方法的基本程序为：
取材→固定→脱水→透明→包埋→切片
→染色→封固。
（二）动物的致死与取材
6．压片标本：组织经化学药物软化及染色后， 用盖片压封于载玻片上进行镜检的标本。如运动 终板的制作。
7 ．整装标本：一种是将很小的动物或早期胚胎经 固定、染色后，封固于载玻片上。另一种是将小 动物、胚胎或病变器官经固定后，保存于固定液 中瓶装供肉眼观察用。可了解胚体的表面立体形 态特征及病变部位与周围组织的毗邻关系。
是习惯上称为10%的福尔马林液。
（2）10%中性缓冲福尔马林液：商品甲醛10ml，
0. 1mol/L pH7.4 PBS 90ml。
（3）4%多聚甲醛磷酸缓冲液（pH7.4） （4）Bouin’s液：苦味酸饱和水溶液75份，
甲醛25份，冰醋酸5份配制而成。
4．固定方法
（1）灌注法（Irrigation method）自左 心室插入主动脉，先以生理盐水冲冼血液后， 注入固定液，30min后取材，置同一固定剂 后固定。 （2）浸入法（Immersion method） 。
(4)后固定：柔软组织在新鲜时不易切成小块， 往往采用重新固定法处理。 （ 5 ）特殊固定：神经组织以在活体动物灌流
固定后再重新投入固定液为佳，有些组织如肺
则采用由气管注射固定液后再投入固定液为好。
3．固定剂
用以固定组织的药剂，称为固定液。
常用的固定液有： （1）10%福尔马林液：商品甲醛（36%—40%甲 醛水溶液）配成固定液其浓度为3.6%—4%，也就
目的要求
1、了解组织学制片的基本程序；
2、熟悉HE染色的步骤；
3、掌握HE染色结果的观察。
一、组织学常用的几种标本类型
1．切片标本：组织经固定、切片（包括冰冻 切片、石蜡切片及火棉胶切片）染色、封固 而制成的各种玻片标本。它为组织学中最常 用的标本。
2．铺片标本：将肠系膜或皮下组织铺于载 玻片上，经固定、染色、封固而制成的标 本。
3、常用的透明剂有二甲苯、甲苯、氯仿等。 二甲苯：透明组织的能力强，但易使组织收缩和 变脆，故在二甲苯中不宜搁置太久。 氯仿：其透明能力远比二甲苯慢，透明时间可以 延长至24小时也无妨。
（五）包埋
1． 目的：由于生物体的组织有各种硬度不同的成份， 必须加石蜡等作支持物质渗入组织块内部，并将组织 块包埋起来，然后用切片机以制作极薄的切片。 2． 种类：包埋物质目前广泛采用的除石蜡外，还有 火棉胶、炭蜡、明胶以及环氧树脂、OTC(冰冻切片包 埋剂）等。
1、动物致死法： （1）颈椎脱臼法 （2）断头法 （4）空气栓塞法：
2、组织取材时应注意： (1)所取材料越新鲜越好； (2) 切取组织的刀剪刃口必 须锋利； (3) 取材时必须考虑切面的 方向； (4)组织块应力求小而薄； (5)收缩较大的新鲜组织； (6)注意清洁； （3）麻醉法
（三）标本的固定
8．活体标本：在组织细胞生活状态下进行观察 的标本，或生活状态下进行活体染色后制成 的标本。
9 ．血管注射标本： 一种是将树脂类铸形剂经血管灌 注后，用强酸或强碱腐蚀血管周围组织而制成的血管 铸形标本，可瓶装供肉眼观察或进一步处理后作扫描 电镜观察。另一种是将染料加明胶配制成染色液注入 血管内，然后取材、固定、包埋、切片和封固所制成 的组织切片标本。这类标本主要用于了解血管的走行 及其与所支配组织或器官的相互关系。
5．固定后处理
材料固定后，药剂继续留在组织中，易使组
织破坏，必须用水或酒精洗去。 三种方式进行处理： （1）流水冲洗（铬酸或铬酸盐固定的组织）； （2）酒精充分洗涤（Bouin’s液含苦味酸）； （3）直接入脱水剂。
（四）脱水与透明
1、目的 ：脱水与透明的目的在于为石蜡渗透 至组织块内部以便进一步包埋做必要的准备。 脱水必须从低浓度开始，逐渐转入高浓度脱水 剂。另外脱水必须进行得很彻底。 2、常用脱水剂： （1）酒精： （2）丙酮：
3．涂片标本：主要是将液态组织如血液、骨髓、痰 液、腹水、精液等液体涂抹于载玻片上，经固定、染 色制成的组织标本，以供观察细胞的形态与其微细结 构。
血液涂片
宫颈涂片
4．磨片标本：不经脱钙及切片手续，而直接用 手工在磨石上磨制成薄片，以便在显微镜下观 察的骨、牙磨片标本。
大丽紫染色
5．分离标本：将极小组织块用化学药物的水溶液浸 泡后，溶去其细胞间质，采用机械分离方法（如振 荡、针拨等方式）使之分离成单个而又完整的细胞， 经染色后涂于载玻片上进行镜检。
满蜡，待包埋盒表面的
熔蜡凝固后，将其移入
加冰块的冷水中加速凝
固，包埋即告完成。
1
70%乙醇
常温
12～24h
组 织 块 处 理 时 间 表
2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13
80%乙醇 90%乙醇 95%乙醇Ⅰ 95%乙醇Ⅱ 100%乙醇Ⅰ 100%乙醇Ⅱ 二甲苯Ⅰ 二甲苯Ⅱ 石蜡Ⅰ 石蜡Ⅱ 石蜡Ⅲ 石蜡Ⅳ
1．固定的目的
使细胞内蛋白质凝固，终止或抑制外源性和内源性
酶活性，防止组织自溶；使组织成份转变为不溶性
物质从而有利于保存。这就是固定的基本意义。
2．固定的注意事项
(1)组织块不宜太大，一般以厚度为 2毫米，长度不超 过0.5厘米*0.5厘米。 (2) 固定液的量一般以组织块大小的 30 倍为宜，最好 在固定组织的瓶底垫上脱脂棉或几层纱布以使固定液 能从上下左右前后各方都能渗入组织块。 (3)固定的时间，一般以24小时为宜。
常温 常温 常温 常温 常温 常温 常温 常温 48~50℃ 48~50℃ 58~60℃ 58~60℃
石蜡包埋法：
商品石蜡 的处理： 反复溶化以增加石蜡的硬度
和密度。
浸蜡 ：
温度不能超过该石蜡的溶点 的2℃以上；1~2h 。
包埋：通常使用包 埋盒。
包埋通常使用组织包埋机、包埋盒及配套使用的
不锈钢模具。把熔蜡倒入模具内，再用加热的弯曲钝
头镊子夹取已经过浸蜡的组织块，使切面朝下平正地
置放于模具底面的中央处，然后放上包埋盒，继续加
二、组织切片的常规制作 （一） 概述
组织切片的制作方法有：石蜡切片法、冰冻切片
法、火棉胶切片法、超薄切片（电镜标本）、树脂切
片、碳蜡切片等。石蜡切片法是最常用的方法，本节 将较详细讲授其制作步骤。
组织切片制作方法的基本程序为：
取材→固定→脱水→透明→包埋→切片
→染色→封固。
（二）动物的致死与取材
6．压片标本：组织经化学药物软化及染色后， 用盖片压封于载玻片上进行镜检的标本。如运动 终板的制作。
7 ．整装标本：一种是将很小的动物或早期胚胎经 固定、染色后，封固于载玻片上。另一种是将小 动物、胚胎或病变器官经固定后，保存于固定液 中瓶装供肉眼观察用。可了解胚体的表面立体形 态特征及病变部位与周围组织的毗邻关系。
是习惯上称为10%的福尔马林液。
（2）10%中性缓冲福尔马林液：商品甲醛10ml，
0. 1mol/L pH7.4 PBS 90ml。
（3）4%多聚甲醛磷酸缓冲液（pH7.4） （4）Bouin’s液：苦味酸饱和水溶液75份，
甲醛25份，冰醋酸5份配制而成。
4．固定方法
（1）灌注法（Irrigation method）自左 心室插入主动脉，先以生理盐水冲冼血液后， 注入固定液，30min后取材，置同一固定剂 后固定。 （2）浸入法（Immersion method） 。
(4)后固定：柔软组织在新鲜时不易切成小块， 往往采用重新固定法处理。 （ 5 ）特殊固定：神经组织以在活体动物灌流
固定后再重新投入固定液为佳，有些组织如肺
则采用由气管注射固定液后再投入固定液为好。
3．固定剂
用以固定组织的药剂，称为固定液。
常用的固定液有： （1）10%福尔马林液：商品甲醛（36%—40%甲 醛水溶液）配成固定液其浓度为3.6%—4%，也就