细胞免疫荧光详细步骤

细胞免疫荧光步骤

【原理】用特异性抗体（第一抗体）与细胞中的相应抗原反应，洗去未与抗原结合的抗体再用荧光标记的第二抗体与结合在抗原上第一

抗体结合，形成抗原-抗体-荧光抗体复合物由于荧光素在荧光显

微镜下经过特定波长的光照摄激发后能发射出荧光，借此可对抗

原定位和定量。

【材料】培养细胞

【试剂】①4%的多聚甲醛。

②PBS (0.18M PH≌7.2) ：NaCl 18克，Na2HPO 4. 12H2O 12克，

NaH2PO4,2H20 0.8克溶于2000m蒸馏水。

③封闭血清：与二抗同种来源属性的非免疫血清。

④第一抗体：xxx。

⑤第二抗体：与一抗种属性匹配TRITC标记的，（中杉金桥公司，ZF-0313 Goat Anti-Mouse IgG (H+L),）。

⑥ DAPI ：（碧云天公司，Cat. C1006）染核。

⑦抗荧光淬灭封片剂 : 碧云天公司 Cat .PO126

【器材】冰箱，载玻片，盖玻片（做正面标记），微量移液枪，移液枪枪头，吸管，湿盒，指甲油，DOCK 笔，EP管，

吸水纸，六孔板，摇床，振荡器。

【配制液体等】①0.5%-Triton ： ( PBS 99.5ml +0.5mlTriton 由于Triton 比较粘，配前先在室温放会儿 ,磁力搅拌器搅匀可分装储存)

②10% 正常封闭血清：( 用PBS-Triton 稀释，振荡器上振荡充分混匀，临用前配制)。

③0.3%-Tween ；用PBS稀释Tween。

【步骤】

1 取出生长48小时的细胞爬片，移入一个干净的六孔板冷PBS浸泡不超

过3分钟（事先在六孔板的第一排三个孔分别标记)。

2 每个玻片滴加4%的多聚甲醛冰上固定14分钟。注意，要水平，覆盖均匀。（准备封闭血清用PBS-Triton稀释1:10 振荡器上振荡混匀）。

3 冷PBS,5分钟X2次摇床150rpm缓慢洗净，PBS-Triton透膜5min。（如果是胞浆，核或膜内表面表达需要这一步，如果是膜外表面表达的则不需要透膜）

4擦干爬片边缘，用DOCK 笔在爬片四周边沿画圈（以防止爬片上所加试剂因失去张力流失，导致干片）。将爬片分别放入六孔板下排与上排标记相对应的孔内（该加封闭血清了，此时要求板是干燥的，下一排板没用过是干燥的）。

5用微量移液枪，在每张爬片上加10% 正常封闭血清，室温湿盒中阻断30 min。（准备一抗，用PBS-Triton稀释抗体1:100 振荡器上振荡混匀）。

6一抗孵育：加已经稀释好的一抗，用微量移液枪小心加一抗，（逐个片去封闭液，擦干圈外水，加一抗注意：不要碰细胞）置湿盒中，4º冰箱过夜，剩余的一抗保留。

7 . 次日，轻轻去盖，查看张力还在。轻轻移至室温，湿盒内再孵育1 小时。注意不干片。

8 PBS-Tween 洗，3次x5min （据情况适当变化）, 。

9 将爬片四周擦干，再将其分别放回六孔板上一排原先的孔内。（加二

抗，上一排板已干，所以再移回上一排板中）。

10. 避光处，加二抗覆盖均匀平放室温孵育一小时（由于试剂会

挥发，此间要查看，适当补加二抗避免干片）。

11 避光处,，PBS-Tween洗3次X5min （据情况适当变化）, 轻轻的。

12 避光处，待爬片晾干，加DAPI（一小滴）,室温孵育4min，PBS-Tween

洗3次，用手晃动洗涤。

13 避光处，待爬片晾干，往载玻片上滴加封片剂，爬片倒扣于封片剂上，

用指甲油封爬片四周（防封片剂溢出并固定爬

片)。。

14 观察：注意荧光强度随着灯光刺激衰减，尽快照相

注意：为了避免互相污染从第3步开始，三个爬片滴加试剂的吸管不能混用。