IEF电泳分离
电泳分离技术
电泳分离技术
（二）缺点 1.易破碎，浓度不能太低。 2.易被细菌污染，不易保存，临用前配制。 3.琼脂糖支持层上的区带易于扩散，电泳后必须立即固定染
色。 4.与PAGE相比，分子筛作用小，区带少。
电泳分离技术
蛋白质是带有电荷的两性生物大分子，其正负电荷的数量 随所处环境酸碱度的变化而变化。在电场存在下的一定pH 溶液中，带正电的蛋白分子将向负极移动而带负电的蛋白 分子将向正极移动，在某一pH时，蛋白分子在电场中不再 移动，此时的pH值即为该蛋白质的等电点。 等电聚焦(IEF）电泳就是在凝胶中加入两性电解质从而构 成从正极到负极pH逐渐增加的pH梯度，处在其中的蛋白 分子在电场的作用下运动，最后各自停留在其等电点的位 置上，测出蛋白分子聚焦位置的pH值，便可以得到它的等 电点。
电泳分离技术
第一次的自由溶液电泳；第一台电泳仪； 1948年，获诺贝尔化学奖；
电泳分离技术
由于早期的电泳仪价格昂贵，分辨率低，易产生对流，因 而逐渐发展起了区带电泳。 自由界面电泳：又称移动界面电泳，是指在没有支持介质 的溶液中进行的电泳。其装置复杂，价格昂贵，费时费力， 不便于推广应用。 区带电泳是指在电泳迁移中以一个缓冲溶液饱和了的固相 介质作为支持介质，减少外界干扰的电泳技术。 凝胶电泳和等电聚焦电泳由于其明显的优越性，得到了越 来越广泛的应用。
无离子水至500毫升。显色约10分钟，蛋白带出现。 6. 无离子水漂洗后用50%甲醇终止显色。
电泳分离技术
电泳分离技术
SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳
十二烷基硫酸钠（SDS）的聚丙酰胺凝胶电泳是最 常用的定性分析蛋白质的电泳方法，特别是用于蛋白
蛋白质双向电泳注意点
蛋白质双向电泳注意点
蛋白质的双向电泳的第一向为等电聚焦（Isoelectrofocusing, IEF）,根据蛋白质的等电点不同进行分离；第二向为SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE），按亚基分子量大小进行分离。
经过电荷和分子量两次分离后，可以得到蛋白质分子的等电点和分子量信息。
注意事项：
1. 一向聚焦与二向电泳之间需要平衡，时间视蛋白质的性质而定，一般为10min，最多不超过15min。
2. 过量的上样量会引起双向图形畸形，特别在一向聚焦时，当样品浓度超过5mg时，则蛋白质凝聚和沉淀，使二向时产生水平和垂直条纹。
3. 含尿素的试剂均应避免过高的温度处理，一般不要超过30℃，否则尿素分解产生异硫氰酸盐会引起羧基甲酰化而导致电荷不均一性。
4. 第一向中过量的去污剂会严重影响双向电泳图谱，因此聚焦完毕进行平衡前，用双蒸馏水冲洗胶条，以除去残留的去污剂。
5. 双向电泳中双向凝胶间的界面紧密接触非常重要，如果接触不好或者两者之间留有气泡，则导致转移时分子扩散。
6. 双向电泳中的条纹现象是常见的问题。
水平条纹可能与一向电泳时间不够，聚焦不好有关，或者在加样处产生沉淀和引起重新溶解所致；纵向条纹则表明样品没溶解，这可以通过调整样品量，增加电泳时间，改善样品的溶解状态，同时在加样前通过高速离心以除掉所有不溶物。
实验三十五IEF电泳测定蛋白质等电点
实验三十五IEF电泳测定蛋白质等电点等电点(isoelectri。
point)是蛋白质的最重要理化性质之一，其定义是当蛋白质的酸性解离与碱性解离趋势相等，蛋白质分子的净电荷为零时，环境的pH。
当蛋白质分子的pI<环境pH时带正电荷向负极移动，pI>环境pH时带负电荷，向正极移动，处于等电点时的蛋白质在电场中既不向阳极移动，也不向阴极移动。
每一种蛋白质都有一个特定的等电点，测定蛋白质的等电点最为普遍采用的方法是等电聚焦(isoelectric focusing，IEF)电泳，IEF是60年代建立起来的一种蛋白质分离分析手段，其分辨率高，可达0．001pH单位，且操作方便、迅速，因此除用于蛋白质等电点测定外，也常被用于蛋白质纯度鉴定及分离制备蛋白质，是生物化学、分子生物学、遗传学等研究中的重要分离、分析方法。
实验原理等电点聚焦电泳的基本原理是通过在凝胶中加入载体两性电解质，使其在电场作用下，从阳极到阴极形成一个连续而稳定的线性pH梯度，其正极为酸性，负极为碱性，通常使用的载体两性电解质是脂肪族多氨基多羧酸化合物，其在电泳中形成的pH梯度范围有3～10，4～6，5～7，8～10等，蛋白质在IEF电泳时，当样品置于负极端时，因pH>pI，蛋白质分子带负电荷，电泳时向正极移动，在移动过程中，由于pH逐渐下降，蛋白质分子所带的负电荷逐渐减少，蛋白质分子移动的速度逐渐变慢，当移动到pH=pI时，蛋白质所带的净电荷为零，蛋白质即停止移动而聚焦成带。
当蛋白质置于正极时，也会获得同样的结果。
因此在进行IEF电泳时，样品可以置于任何位置。
由于各种不同蛋白质的氨基酸组成不同，因而有不同的等电点，在IEF电泳时，会分别聚焦于相应的等电点位置，形成一个很窄的区带。
在IEF电泳中蛋白质区带的位置是由电泳pH梯度的分布和蛋白质的pI所决定，而与蛋白质分子的大小及形状无关。
因此根据蛋白质区带在pH梯度中的位置便可测得该蛋白质的等电点。
等电聚焦电泳方法
等电聚焦电泳方法
等电聚焦电泳方法（Isoelectric focusing，IEF）是一种高效的分离蛋白质的方法，它基于蛋白质在特定pH 值下的等电点电荷状态差异进行分离。
该方法可用于分离电荷异构体、突变体、异构蛋白质和翻译后修饰的蛋白质。
IEF 方法需要一个pH 梯度凝胶，通常使用聚丙烯酰胺凝胶。
样品被加到凝胶的一侧，然后用电场沿pH 梯度进行电泳。
当蛋白质移动到与其等效的pH 值处时，电荷变为中性，停止运动。
这种分离方法可以在同一凝胶中完成多个样品的分离，并且它可以与其他分离方法例如SDS-PAGE 结合使用，从而实现更高的分辨率。
IEF 方法已被广泛应用于生命科学中的蛋白质研究和分析，例如生物医学、生物化学和分子生物学等领域。
《中国药典》2020版— 等电聚焦电泳法
0541电泳法
第六法等电聚焦电泳法
等电聚焦（ISOELECTRIC FOCUSING，IEF）电泳法是两性电解质在电泳场中形成一个 pH 梯度，由于蛋白质为两性化合物，其所带的电荷与介质的 pH 值有关，带电的蛋白质在电泳中向极性相反的方向迁移，当到达其等电点(此处的 pH 值使相应的蛋白质不再带电荷)时，电流达到最小，不再移动，从而达到检测蛋白质和多肽类供试品等电点的电泳方法。
本法用于蛋白质的定性鉴别、等电点测定、限度检查以及定量测定。
方法 1：垂直板电泳法
除各论中另有规定外，按以下方法测定。
1.仪器装置
恒压或恒流电源、带有冷却装置的垂直板电泳槽和制胶模具。
2.试剂
(1)水(电阻率不低于 18.2MΩ•cm)。
(2)A 液称取丙烯酰胺29.1g、亚甲基双丙烯酰胺0.9g，加适量水溶解，并稀释至 100ml，双层滤纸滤过，避光保存。
(3)B 液10%过硫酸铵溶液，临用前配制。
(4)供试品缓冲液(4 倍浓度) 取甘油8ml、40%两性电解质(pH3〜10)溶
1。
6第三节 等电聚焦(IEF)-生化分析汇总
等电聚焦技术
根据建立pH梯度原理的不同，梯度又 分为载体两性电解质pH梯度和固相pH梯度。 前者是在电场中通过两性缓冲离子建立pH 梯度，后者是将缓冲基团成为凝胶的一部 分。
三、载体两性电解质 1. 载体两性电解质的合成 1961年Svensson H提出的载体两性电解质 的理论基础，1964年Vesterberg O利用多乙烯 多胺和不饱和酸合成了载体两性电解质，它 是由脂肪族多氨基多羧基的异构物和同系物 组成，它们有连续改变的氨基与羧基比。
Байду номын сангаас
提高疏水蛋白在水中的溶解性
1. 尿素
改善疏水蛋白接近pI时的可溶性，也可增加
多肽的溶解度。 2. 非离子去污剂和两性离子去污剂 能在不破坏蛋白质结构保持生物活性的情况 下改善蛋白的溶解度。
尿素和去污剂结合使用是提高疏水蛋白可溶性 的最好方法。
7.加样方法
根据等电聚焦的原理，样品可加在凝胶上任何合适的位置都可 得到相同的结果。
2. 引入电场时的变化 载体两性电解质分子将向阴极或阳极迁移，带
有最低等电点的分子（带最多的负电荷）将最快
的向阳极迁移，当它达到净电荷是零的位置时才
停止。
其次是一些低pI的载体两性电解质分子 （带有其次多的负电荷）也将向阳极移动， 直到它的净电荷被减少到零即停止。
3. 电泳结束后的变化
所有的载体两性电解质分子以增加pI级数的办
第三节 等电聚焦
(isoelectric focusing，IEF)
一、概述 等电聚焦(isoelectric focusing，IEF)是60 年代建立的一种高分辨率的蛋白质分离和分析 技术。它是利用具有pH梯度的支持介质分离 等电点不同的蛋白质的电泳技术。
电泳分离概述
29
1、原理
聚丙烯酰胺凝胶电泳一方面根据蛋白质电荷密度，也就 是在缓冲液中不同蛋白质间同性静电荷的差异，另一方面 基于分子筛效应，即与分子大小和形状有关，因此用聚丙 烯酰胺凝胶电泳不仅能分离各种蛋白质分子的混合物，还 可以研究其特性，如电荷、分子量、等电点乃至构想，并 且可以用于蛋白质纯度的鉴定。
13
5）电渗作用
电场作用下，溶液对固体支撑物的相对运动称为电渗。 固体支撑物多孔且带有可解离的带电基团，解离后常吸附溶液 中带正电或负电的反离子，这些反离子不是固定的，随着电压 梯度运转到正极或负极，直至被下一带电基团所捕获。总体效 果就是溶液在电场作用下向正极或负极移动。 电渗影响带电质点的迁移速度。但在保持一定的电渗流是有益 的，比如免疫电流。
垂直平板电泳：上下两个电泳槽，中间经垂直平板相连 ，凝胶加在两块垂直平行玻璃或塑料板之间。
26
一般平板电泳：凝胶载体为惰性材料，只起支撑作用， 无分离作用，如淀粉凝胶、琼脂糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶等 。
特殊平板电泳：载体除支持作用外，主要起分离作用， 如等电聚焦电泳、pH梯度电泳、密度梯度电泳、亲和电泳 等
6、
23
2、 按支持介质种类的不同，区带电泳可分为：
①纸电泳。
②色谱电泳
③醋酸纤维素薄膜电泳
④凝胶电泳：以淀粉、琼脂糖、聚丙烯酰胺凝胶为电 泳载体。
⑤聚焦电泳：如等电聚焦电泳、密度梯度电泳、亲和 电泳等。
聚丙烯酰胺和琼脂糖是目前实验室最常用的两种支持 介质。
24
3、按电泳次数、方向
①一维电泳：仅一个方向电泳一次。 ②二维电泳：平面X轴、Y轴方向各电泳一次。
4
双向电泳的基本原理
双向电泳的基本原理
双向电泳是蛋白质组学研究中最重要的技术，在蛋白质组学研究中发挥了重要作用。
其基本原理是：样品中含有两种或两种以上不同分子量的蛋白质，它们的分子量分布不同，在加有等电聚焦（IEF）等电聚焦缓冲液的一台凝胶电泳仪（如UMEACO）上，蛋白质分子按其大小和分子量进行分离，并可在不同的pH 范围内进行电泳。
由于等电聚焦缓冲液具有强的选择性，不同分子量的蛋白质在同一胶上得到分离，经凝胶染色后在垂直于凝胶的方向上能显示出清晰的条带。
蛋白质分子量大的向小的方向移动，分子量小的向大的方向移动。
每一条带就是一个独立的分子。
双向电泳技术可以大大缩短实验时间、降低实验成本、提高分析效率。
例如：已知蛋白序列为a/b/c，对某一蛋白进行研究，只需分离出a/b/c三条带，再经双向电泳技术分离后即可得到含有三条带的蛋白质条带。
双向电泳技术是蛋白质组学研究中最重要的技术之一，其基本原理是：将样品制备成胶后，在垂直于凝胶电泳方向上将蛋白进行分离。
—— 1 —1 —。
等电点聚焦测蛋白质等电点
实验四等电点聚焦测蛋白质等电点宫魁六组200928006841083一、实验原理：等电点聚焦（IEF）是在电场中分离蛋白质技术的一个重要发展，IEF实质就是在稳定的pH梯度中按等电点的不同分离两性大分子的平衡电泳方法。
在电场中充有两性载体和抗对流介质，当加上电场后，由于两性载体移动的结果，在两极之间逐步建立起稳定的pH梯度，当蛋白质分子或其它两性分子存在于这样的pH梯度中时，这种分子便会由于其表面电荷在此电场中运动，并最终到达一个使其表面静电荷为0的区带，这时的pH则是这种分子的pI。
聚焦在等电点的分子也会不断地扩散。
一旦偏离其等电点后，由于pH环境的改变，分子又立即得到正电荷或负电荷，从而又向pI迁移。
因此，这些分子总是处于不断地扩散和抗扩散的平衡之中，在pI处得以“聚焦”。
二、实验仪器和用具：玻璃管（4支）、封口膜、试管架、细长滴管、注射器和长针头、培养皿、刀片、烧杯、微量移液器、圆盘电泳槽及电泳仪三、试剂：0.1M磷酸（500ml）、0.1M氢氧化钠（1000ml）、丙烯酰胺储液、两性载体电解质、TEMED、牛血清蛋白样品（0.5mg/ml）、过硫酸铵（10%）、三氯乙酸（10%）等四、实验步骤：1、先将玻管洗净，用封口膜封的一端垂直放在架上；2、配胶：丙烯酰胺储液0、67ml两性载体电解质0、2mlTEMED 0、004ml牛血清蛋白质样品0、04ml蒸馏水 2.9ml过硫酸铵0.02ml3、用细长滴管加入溶液至10cm高处，胶面上加3—3cm高水层，进行封闭，聚合10—50min，吸出上层水，用滤纸稍微吸取；4、在电泳槽上槽加800ml磷酸，下槽500ml氢氧化钠；5、将管接入电泳槽，要求上端浸入液面，下端不接触下槽底面，注意排除凝胶下表面的气泡；6、接上电源，正极接酸，负极接碱；恒定160v，4h左右，电泳至电流为“0”；7、取胶将聚胶后的含蛋白质样品的凝胶借助注射器针头注水取出；8、量取三条胶的长度；9、pH梯度的测定取KCl溶液分别加入2ml于10只小管中，将欲测pH 梯度的胶条置于玻片上，用刀片切成1cm长的小段，按顺序放入有标号的小管中，盖好盖子，室温下过夜；10、次日用pH计测每只小瓶中浸泡液的pH值。
IEF
IEF操作规程（聚丙烯酰胺凝胶）注意事项：玻璃板和模具必须清洁、干燥。
不要用有机溶剂，研磨清洁剂，热水清洗模具。
肥皂水，水，去离子水清洁玻璃板，然后用乙醇清洁。
用滤纸檫干。
1、将凝胶支持膜贴于玻璃板上*（gel support film），贴面朝下将玻璃板三面贴着盒壁，一面敞开。
2、准备单体——两性电解质溶液#，在真空下去气5分钟，不要太长，需要微量的氧去催化5-FMN3、准备催化液：过硫酸铵溶液需要新鲜配制。
4、将过硫酸铵溶液加入单体——两性电解质溶液中，轻微搅拌。
注意：不要用嘴吸丙烯酰胺溶液。
戴手套。
丙烯酰胺有神经毒性的。
5、用吸取上述溶液开始浇胶。
①持移液管45度角并且排出气泡。
②从玻璃板的一边慢慢的移到另一边。
③当液体前沿到板边，慢慢增加液体从板中央。
④控制流速，防止气泡产生，如果产生气泡，倾斜使气泡跑到边缘。
6、将模具放在荧光灯下，（光聚作用）。
7、照射45分钟。
8、从模具中取胶板。
a．从一边将平头铲插在胶与模具之间。
b．当空气进入缝隙后，轻轻从模具上取下板。
9、翻转板，玻璃面朝下，放置在模具上，进一步照射15分钟以去除没有聚合的单体。
#；聚丙烯酰胺凝胶试剂用量单体——两性电解质溶液:双蒸水 5.5ml单体浓度(25%T,3%C) 2.0ml25%甘油 2.0ml两性电解质0.5ml注:40%的两性电解质(BIO-L YTE 3/10,4/6,5/7,6/8,7/9)用20%两性电解质, 双蒸水改为5.0ml, 两性电解质用量为1ml.催化液:10% 过硫酸铵溶液15ul(若没5-FMN 改为40)0.1% FMN 50ulTEMED(纯) 3ul(若没5-FMN 改为10)注意:根据分离蛋白的等电点范围来选取两性电解质。
两性电解质经过特意的混合产生线性的PH梯度（不需要在混合）。
然而特别的分离可能需要混合两种或以上的两性电解质以达到分离效果。
*1、从包装袋内取一片凝胶支持膜，然后将包装袋从新密封。
IEF SDS PAGE双向电泳技术
IEF SDS PAGE双向电泳技术ief-sdspage双向电泳技术双向电泳一、材料样本：人神经母细胞瘤细胞sk-n-sh二、试剂SDS第1页所需试剂，30%acry-bis（w/V）29.2％acry29.2g0.8%比0。
8g加水至100ml溶解，棕色试剂瓶4℃贮存，ph<7，数月后重配2.10%十二烷基硫酸钠储存溶液（w/V）rt保存，因sds在4℃会析出3、 tris-HCl缓冲液①1.5m的ph8.8的tris-hclbuffer――分离胶buffer100ml含tris18 171g，添加DDW至80ml，并用浓HCl 8调节pH 8。
定容至100ml，4℃保存②1.0m的ph6.8的trisbuffer――浓缩胶buffer：50ml含tris6 057g，添加DDW至40ml，并在8℃下用浓盐酸将pH 6调节至50ml，然后固定体积4、temed它以自由基的形式起作用，催化AP形成自由基。
因此，当pH值较低时，聚合反应受到抑制，易吸湿、氧化，并由无色变为黄色。
因此，应在4℃的密闭条件下储存5、10％ap1g AP溶于10ml水中，4℃保存，每隔一周新鲜制备6、ph8.3电泳缓冲液1l，rt保存特里斯基地gly（25.05）sds加水至1L，不调整pH值7、甘油液4℃31ml丙三醇5.5mlddw25.5ml3g14。
4g1g终浓度250mm250mm0.1%(192mm)8.考马斯亮蓝染料cbb（RT，50%甲醇+冰醋酸+R250）总体积100ml45ml10ml0。
25克终浓度45%10%0.1%甲醇水冰醋酸r250改进：（0.12%g250,10%(nh4)2so4,10%h3po4,20%甲醇）先溶解100ml H2O+100ml H3PO4（先混好，生热）+100g粉末（NH4）2SO4（搅拌时加入），然后加入1.2gg250，然后溶解（未真正溶解），体积固定为800ml，搅拌时加入200ml甲醇，最终体积为1000ml（可储存至少半年）。
微生物蛋白质组学研究中的二维凝胶电泳技术
微生物蛋白质组学研究中的二维凝胶电泳技
术
二维凝胶电泳技术是一种用于分离和鉴定复杂混合物中蛋白质的高分辨率方法。
它包括两个连续的步骤：第一步是根据分子重量用等电聚焦（isoelectric focusing，IEF）电泳将蛋白质在凝胶中分离成不同的等电点谱峰；然后将这些分离的蛋白质再根据它们的电荷密度使用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）进一步分离。
通过这两个步骤，可实现在凝胶上的二维图像。
在微生物蛋白质组学研究中，二维凝胶电泳技术已经成为了一项必不可少的工具，用于研究微生物的蛋白质组成及其调控。
通过分离和鉴定微生物细胞中蛋白质的变化，研究人员可以了解微生物在不同的环境条件下的适应和响应机制，包括对不同类型的生物或非生物压力的应答反应、代谢通路变化等。
尽管二维凝胶电泳技术有着高分辨率和高灵敏度的优点，但在微生物蛋白质组学研究中仍存在着一些限制。
比如，某些微生物的蛋白质非常相似，难以分离和鉴定，而且如果蛋白质的表达量非常低，则可能无法检测到。
因此，需要使用其他的方法，如质谱（mass spectrometry）分析，来辅助鉴定。
等电聚焦实验报告
1. 了解等电聚焦电泳（IEF）的基本原理和操作步骤。
2. 学习利用等电聚焦电泳技术测定蛋白质的等电点（pI）。
3. 掌握实验操作技能，提高实验动手能力。
二、实验原理等电聚焦电泳（IEF）是一种利用pH梯度介质分离等电点不同的蛋白质的电泳技术。
其基本原理是在一个具有pH梯度的介质中，蛋白质分子根据其等电点在电场作用下向相应pH位置移动，直至聚焦于该位置。
蛋白质分子是两性电解质，其等电点（pI）是指蛋白质分子在溶液中呈电中性时的pH值。
在pH低于蛋白质的pI时，蛋白质分子带正电荷；在pH高于蛋白质的pI 时，蛋白质分子带负电荷。
在等电聚焦电泳过程中，当蛋白质分子移动到与其pI相等的pH位置时，其净电荷为零，停止移动，从而实现蛋白质的分离和聚焦。
三、实验仪器与试剂1. 仪器：毛细管电泳仪、恒温水浴、pH计、移液器、超纯水系统等。
2. 试剂：蛋白质样品、两性电解质载体、尿素、磷酸、氢氧化钠、乙酸等。
四、实验步骤1. 准备样品：取适量蛋白质样品，加入适量两性电解质载体，制成蛋白质溶液。
2. 制备pH梯度：根据蛋白质的pI值，配制相应的pH梯度介质，置于毛细管中。
3. 样品上样：将制备好的蛋白质溶液加入毛细管中，注意避免气泡产生。
4. 设置参数：根据仪器要求，设置电泳电压、温度、时间等参数。
5. 运行实验：开启毛细管电泳仪，开始电泳实验。
6. 数据采集：实验结束后，采集数据，分析蛋白质的等电点。
五、结果与分析1. 根据实验数据，绘制蛋白质的迁移曲线，分析其等电点。
2. 与理论值进行比较，评估实验结果的准确性。
1. 等电聚焦电泳是一种有效的蛋白质分离和鉴定技术，具有分辨率高、操作简便等优点。
2. 通过本次实验，掌握了等电聚焦电泳的操作步骤，提高了实验动手能力。
3. 在实验过程中，需要注意以下几点：a. 精确配制pH梯度介质，确保pH梯度均匀。
b. 避免气泡产生，影响实验结果。
c. 严格控制实验参数，确保实验结果的准确性。
等电聚焦ief电泳技术
等电聚焦[IEF]电泳技术等电聚焦（isoelectric focusing，IEF）是60年代中期问世的一种利用有pH梯度的介质分离等电点不同的蛋白质的电泳技术。
由于其分辨率可达0.01pH单位，因此特别适合于分离分子量相近而等电点不同的蛋白质组分。
⒈IEF的基本原理在IEF的电泳中，具有pH梯度的介质其分布是从阳极到阴极，pH 值逐渐增大。
如前所述，蛋白质分子具有两性解离及等电点的特征，这样在碱性区域蛋白质分子带负电荷向阳极移动，直至某一pH位点时失去电荷而停止移动，此处介质的pH恰好等于聚焦蛋白质分子的等电点（pl）。
同理，位于酸性区域的蛋白质分子带正电荷向阴极移动，直到它们的等电点上聚焦为止。
可见在该方法中，等电点是蛋白质组分的特性量度，将等电点不同的蛋白质混合物加入有pH梯度的凝胶介质中，在电场内经过一定时间后，各组分将分别聚焦在各自等电点相应的pH位置上，形成分离的蛋白质区带。
⒉pH梯度的组成pH梯度的组成方式有二种，一种是人工pH梯度，由于其不稳定，重复性差，现已不再使用。
另一种是天然pH梯度。
天然pH梯度的建立是在水平板或电泳管正负极间引入等电点彼此接近的一系列两性电解质的混合物，在正极端吸入酸液，如硫酸、磷酸或醋酸等，在负极端引入碱液，如氢氧化钠、氨水等。
电泳开始前两性电解质的混合物pH为一均值，即各段介质中的pH相等，用pH0表示。
电泳开始后，混合物中pH最低的分子，带负电荷最多，pI1为其等电点，向正极移动速度最快，当移动到正极附近的酸液界面时，pH突然下降，甚至接近或稍低于PI1，这一分子不再向前移动而停留在此区域内。
由于两性电解质具有一定的缓冲能力，使其周围一定的区域内介质的pH保持在它的等电点范围。
pH稍高的第二种两性电解质，其等电点为pI2，也移向正极，由于pI2＞pI1，因此定位于第一种两性电解质之后，这样，经过一定时间后，具有不同等电点的两性电解质按各自的等电点依次排列，形成了从正极到负极等电点递增，由低到高的线性pH梯度，如图16-3所示。
等电聚焦电泳(IEF)分离蛋白及测定蛋白质等电点
一、原理等电点聚焦（IEF）是在电场中分离蛋白质技术的一个重要发展，等电聚焦是在稳定的pH梯度中按等电点的不同分离两性大分子的平衡电泳方法。
在电场中充有两性载体和抗对流介质，当加上电场后，由于两性载体移动的结果，在两极间逐步建立稳定的pH梯度，当蛋白质分子或其他两性分子存在于这样的pH梯度中时，这种分子便会由于其表面电荷在此电场中运动，并最终达到一个使其表面静电荷为0的区带，这时的pH则是该分子的pI，聚焦在等电点的分子也会不断扩散，一旦偏离其等电点后，由于pH环境的改变，分子又立即得到正电荷或负电荷，从而又向pI迁移。
因此，这些分子总会是处于不断扩散和抗扩散的平衡中，在pI处得以“聚焦”.二、仪器与试剂1．材料：蛋白样品2．试剂：聚丙烯酰胺、甲乙聚丙烯酰胺、两性电解质、尿素、NP-40、teiton-100电极液：1M磷酸（阳极液）、1M氢氧化钠（阴极液）固定液：100g三氯乙酸、10g磺基水杨酸溶于500ml，定容为1000ml染色液：0.35g考马斯亮蓝R－150溶于300ml脱色液中，加热到60－70℃，加入0.3g硫酸铜。
脱色液：25％乙醇、8％冰乙酸溶于水样品缓冲液:1％Ampholine 、2％Triton X-100、9M尿素三、操作步骤：1, 样品制备：用IEF样品缓冲液提取待分析样品，如其他缓冲液提取的样品则应透析后，冷冻干燥、再复溶于IEF样品缓冲液。
充分溶解后，离心去除不溶杂质。
2,制模具：洗干净两块IEF专用玻璃板，进行硅化和反硅化处理，两块玻璃板的硅化和反硅化面相对，放上夹条，夹子夹好。
3, 配胶：胶液组成：6ml胶母液（10％，19/1）6－8％尿素1ml Ampholine (pH3.5-10)60-80ul 10%AP5 ul TEMED4, 灌胶：配好的胶迅速灌入模具5, 电泳：等胶凝固后，小心揭去上下玻璃板，将塑料垫片底部擦干，小心放于电泳槽上。
在胶面两边各放一根浸透电极缓冲液的电极条。
ief凝胶保存方法
ief凝胶保存方法
IEF凝胶（等电点聚焦凝胶）是一种用于分离和分析肽和蛋白的电泳技术，
基于蛋白质的等电点进行分离。
保存IEF凝胶的方法如下：
1. 密封保存：将IEF凝胶放在密封的容器中，以避免其受到空气和湿气的影响。
2. 避免阳光直射：将容器放在阴凉处，避免阳光直接照射，以免凝胶变质。
3. 不要过度折叠：如果凝胶被折叠得太厉害，它可能会破裂或损坏。
因此，应该将其平放在容器中。
4. 定期检查：定期检查凝胶的保存情况，以确保其质量和有效性。
如果发现凝胶有任何异常，例如变色或变形，应该立即停止使用。
请注意，以上仅为一般性的建议，您应当根据具体情况选择合适的保存方法。
ief电泳电压
ief电泳电压IEF电泳电压IEF电泳（Isoelectric Focusing Electrophoresis）是一种基于蛋白质等电点的分离技术。
在IEF电泳中，电极通过施加不同的电压来实现蛋白质的分离。
本文将重点探讨IEF电泳中的电压对分离效果的影响。
在IEF电泳中，电极的施加电压是非常重要的因素。
电压的选择直接影响到蛋白质在凝胶中的迁移速度和分离效果。
通常情况下，电压越高，电泳速度越快。
然而，过高的电压可能会导致凝胶发热，影响到分离的准确性。
因此，在选择电压时需要综合考虑分离效果和样品的特性。
电压的选择应根据样品的等电点范围来确定。
等电点是指蛋白质在电泳介质中具有中性电荷的pH值。
根据蛋白质的等电点范围，可以选择合适的电压来实现分离。
一般来说，样品等电点范围越窄，电压可以选择得越高，以加快分离速度。
相反，等电点范围较宽的样品，则需要选择较低的电压，以避免过快的分离导致重叠和混杂。
电压的选择还应考虑凝胶的类型和尺寸。
不同类型的凝胶对电压有不同的要求。
例如，聚丙烯酰胺凝胶通常需要较低的电压，而聚丙烯酰胺-聚酰胺共聚物凝胶则可以承受较高的电压。
此外，凝胶的尺寸也会影响电压的选择。
较小尺寸的凝胶可以使用较高的电压，以加快分离速度。
而较大尺寸的凝胶则需要选择较低的电压，以避免凝胶发热和样品迁移不均匀。
对于IEF电泳中的电压选择，还需要考虑凝胶电解液的成分及其pH 值。
电解液的pH值会影响到蛋白质的等电点定位和分离效果。
选择合适的电压，应结合电解液的pH值来确定。
通常情况下，电压的选择应使得凝胶中的电场分布均匀，以确保分离效果的准确性和可重复性。
IEF电泳中的电压选择是影响分离效果的重要因素。
在实验中，需要根据样品的等电点范围、凝胶类型和尺寸、以及电解液的成分和pH值等因素综合考虑，选择合适的电压。
合理的电压选择可以提高分离效果，使得IEF电泳在蛋白质分析和研究中发挥更大的作用。
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3.5 等电聚焦电泳的缺点
先用pH3-10的宽范围的两性电解质粗测,再用如 pH6-8等窄范围的两性电解质细测
在pH3-10的范围内测定 无法测定小于pH3或大于pH10 蛋白聚焦靠近两性电解质的极端的pH范围,其pH 是测不准的
pH8.3 pH9.0 pH10.2 pH10.6
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圆盘状IEF测定乙醇酸氧化酶的pI
板状电泳
◆ 在板状凝胶的一个泳道加入样品；在另一泳
道加入多中已知pI的标准蛋白。通过比较标 准蛋白的pI，则可测定样品的pI。
◆
采用表面pH电极
注意:测定时温度与电泳聚焦时的温度一致。温度 对pH的测定有较大影响
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板状IEF测定乙醇酸氧化酶的pI
蛋白酶分离纯化技术
华南师范大学生命科学学院
2005/2006
3.4 等电聚焦(IEF)的分辨率
分辨率是能分辨出的相邻两条蛋白带的pI 的差值(⊿ pI)
◆ D: 蛋白扩散系数(常数) ◆ dpH/dx: pH梯度
◆ E: 电场强度
◆ du/dpH: 蛋白迁移率(常数)
目前最大分辨率为0.001pH
稳定,接近为零
※根据需要，将凝胶进行不同的处理 ♠测定纯度
进行酶的特异性染色(活性染色)和普通的蛋白染色 (考马斯亮蓝染色)
♥测定pH值
圆盘状电泳
★ 将凝胶从玻璃管中取出,等分成若干小段。各小 段分别用一定量的蒸馏水浸泡提取2-3h，然后测定 水溶液的pH值
★将凝胶从玻璃管中取出,采用表面pH电极直接测 定凝胶表面不同部位的pH值 注意:测定时温度与电泳聚焦时的温度一致。温度对 pH的测定有较大影响
图. 用醋酸纤维薄膜电泳测定乙醇酸氧化酶的pI 1,2,3,4: pH分别为8.3、9.0、10.2和10.6，箭头所指的 是酶蛋白点样的位置
4 等电聚焦电泳的种类
是否加入电泳支持物(或稳定剂)
加入支持物(或稳定剂)的种类
4.1 自由溶液IEF
不加入电泳支持物(或稳定剂)
方便分离蛋白 要迅速回收蛋白
5:标准蛋白; 1,6-7:乙醇酸氧化酶
♣ 若要在等电聚焦后，进一步制备其多克
隆抗体
ₒ把蛋白带子切下,研磨
ₒ离心取上清,加入佐剂(亲脂性分子),注射至动物体内 ₒ免疫五次后,取动物血
♦若要在等电聚焦后，进一步纯化
双向电泳 将凝胶条取出后，平放于SDS-凝胶平板的 表面，再进行SDS-PAGE电泳
毛细管电泳的电渗作用
2 分离模式 按毛细管内是否有无分离介质，以及分离 介质的种类来分
♠ 毛细管自由电泳 毛细管内无分离介质，一般毛细管电泳就是指毛细 管自由电泳
♠ 毛细管凝胶电泳 毛细管内加入聚丙烯酰胺凝胶为分离介质，使蛋 白按大小进行分离
♠ 凝胶内加入SDS，蛋白也经SDS裂解后上样，
SDS-毛细管凝胶电泳
可同时可测定带负电、带正电和不带电的蛋白酶 的亚基分子量
A
苯甲酸
B
C
1 2 3
4
5
乙醇酸氧化酶的SDS-PAGE (A),CE-SDS (B)和SDS-醋酸 纤维素薄膜电泳(C)
1:乙醇酸氧化酶; 2:标准层的毛细管电泳
用不带电的物质凃在毛细管的内壁上，可消除电渗作用
除去两性电解质,蔗糖等分子量较小的物质
4.3聚丙烯酰胺凝胶等电聚焦电泳(最常用)
用聚丙烯酰胺凝胶为支持物
圆盘状电泳或板状电泳
操作过程
※制备凝胶和蛋白上样. 丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺聚合, 凝胶浓度为10％左右, 同时加入两性电解质
※ 待测蛋白可在制备凝胶前或后均可以
※等电聚焦: 从400V提高为800V左右。电流不断下降至
既按等电点，又按分子量的大小进行分离
分辨率更高
蛋白质组学的核心技术
七、 毛细管电泳 1 原理 采用石英毛细管，层析柱的内径很小(<75um)
在pH>3, 石英毛细管层析柱的内表面带负电, 使与之接触的溶液感应带正电
在高压下，电渗的作用大大增强。 在溶液无论带正电、负电和不带电的蛋白酶均 向负极泳动
4.2蔗糖或甘油密度梯度等电聚焦
两性电解质和蔗糖或甘油等稳定剂一起加入 操作过程
※等电聚焦: 从400V提高为800V左右。电流不断下降
至稳定,接近为零 ※ 用泵小心吸出聚焦柱外的正极和负极电极溶液,分 步收集。注意:不要震动柱子，以防止区带紊乱
※分别测定pH值、蛋白质含量或酶活力等 ※把酶活力高的几管合并,采用透析、凝胶层析等方法