质粒载体构建

附录A 表达载体的构建
1、大肠杆菌质粒DNA的提取（SDS碱裂解法）
该方法参照分子克隆指南的方法修订而成。

细胞的制备
(1) 将2ml含相应抗生素的LB培养基加入到容量为15ml并通气良好（不盖紧）的试管中，然后接入单菌落，于37℃剧烈振摇下培养过夜。

(2) 将1.5ml培养物倒入微量离心管中，用微量离心机于4℃以最大转速离心30s，将剩余的培养物贮存于4℃。

(3) 吸去培养液，使细菌沉淀尽可能干燥。

细胞的裂解
(4) 将细菌沉淀重悬于100μl用冰预冷的碱裂解液I中，剧烈振荡。

(5) 加200μl新配制的碱裂解液Ⅱ于每管细菌悬液中，盖紧管口，快速颠倒离心管5次，以混合内容物。

应确保离心管的整个内表面均与碱裂解液Ⅱ接触。

不要振荡，将离心管放置于冰上。

(6) 加150μl用冰预冷的碱裂解液Ⅲ，盖紧管口，反复颠倒数次，使溶液Ⅲ在粘稠的细菌裂解物中分散均匀，之后将管置于冰上3-5min。

(7) 用微量离心机于4℃以最大转速离心5min，将上清转移到另一离心管中。

(8) 加等量体积的氯仿:异戊醇（24:1），振荡混合有机相和水相，然后用微量离心机于4℃以最大转速离心5min，将上清转移到另一离心管中。

质粒DNA的回收
(9) 用2倍体积的乙醇于室温沉淀核酸。

振荡混合，于室温放置2min。

(10) 用微量离心机于4℃以最大转速离心5min，收集沉淀的核酸。

(11) 小心吸去上清液，将离心管倒置于一张纸巾上，以使所有液体流出，再将附于管壁的液滴除去。

(12) 加1ml 70%乙醇于沉淀中并将盖紧的离心管颠倒数次，用微量离心机于4℃以最大转速离心2min，回收DNA。

(13) 小心吸去上清液，将离心管倒置于一张纸巾上，以使所有液体流出，再将附于管壁的液滴除去。

(14) 将开口的离心管置于室温使酒精挥发，直至离心管内没有可见的液体存在（5-10min）。

(15) 用50μl含有去DNA酶的RNA酶A（20μg/ml）的TE重新溶解核酸，温和几秒钟振荡，贮存于－20℃。

2、质粒DNA的酶切、回收与连接
质粒DNA的酶切
(1) 提取的质粒DNA用相应的酶进行酶切。

酶切体系为：
单酶切双酶切
ddH2O 8μl ddH2O 8μl
质粒DNA 10μl 质粒DNA 10μl
10×buffer 2μl 10×buffer 2μl
限制性内切酶Ⅰ0.4μl 限制性内切酶Ⅱ0.4μl
限制性内切酶Ⅲ0.4μl 混匀，简单离心后，37℃水浴反应2-4h。

酶切产物进行1%琼脂糖凝胶电泳检测。

(2) 单酶切需要用小牛肠碱性磷酸酶（CIAP）去除质粒DNA两端的磷酸基，以防止自身环化。

①酶切产物纯化。

取酶切产物加1/10体积3mol/LNaAc和2倍体积预冷无水乙醇，冰上放置5min，12000rpm离心5min，回收沉淀，用预冷的70%酒精洗涤沉淀2次，倒置风干，用25μl TE Buffer溶解。

②CIAP的去磷酸反应。

DNA 25μl
ddH2O 19μl
10×AP buffer 5μl
CIAP 1μl
混匀，简单离心后，37℃反应1h。

③去磷酸产物纯化。

取去磷酸产物加1/10体积3mol/LNaAc和2倍体积预冷无水乙醇，冰上放置5min，12000rpm离心5min，弃上清，倒置风干，用20μl 以下的TE Buffer溶解。

质粒DNA的回收
采用TaKaRa Agarose Gel DNA Purification Kit Ver.2.0进行凝胶回收。

(1) 对酶切产物进行1%琼脂糖凝胶电泳。

在紫外灯下切出含有目的DNA 的琼脂糖凝胶，用纸巾吸尽凝胶表面的液体。

此时应注意尽量切除不含目的
DNA 部分的凝胶，尽量减小凝胶体积，提高DNA回收率。

(2) 切碎胶块。

称量胶块重量，以重量:体积1:3(1mg=3μl)向胶块中加入胶块融化液DR-I Buffer。

(3) 均匀混合后，75℃加热融化胶块，此时应间断振荡混合，使胶块充分融化（约6-10分钟）。

胶块一定要充分融化，否则严重影响DNA回收率。

(4) 向上述胶块融化液中加入DR-I Buffer量的1/2体积量的DR-II Buffer，均匀混合。

(5) 将试剂盒中的Spin Column安置于Collection Tube上。

(6) 将上述操作(4)的溶液转移至Spin Column中，12000 rpm离心1 min，将滤液再加入Spin Column中离心一次，可以提高DNA的回收率。

(7) 将500μl的Rinse A加入Spin Column中，12000 rpm离心30 s，弃滤液。

(8) 将700μl的Rinse B加入Spin Column中，12000 rpm离心30 s，弃滤液。

请确认Rinse B中已经加入了指定体积的100%乙醇。

(9) 重复操作步骤(8)。

(10) 将Spin Column安置于Collection Tube上，12000 rpm离心1 min。

(11) 将Spin Column安置于新的1.5 ml的离心管上，在Spin Column膜的中央处加入25μl的预热至60 ℃灭菌蒸馏水或Elution Buffer，室温静置1 min。

(12) 12000 rpm离心1 min洗脱DNA，4 ℃保存备用。

质粒DNA的连接
将酶切回收的目的片段DNA和载体DNA用T4 DNA ligase进行连接，连接产物可直接转化大肠杆菌。

连接体系：
PEG4000 1μl
Vector 0.5μl
DNA 5.5μl
10×ligase buffer 2μl
T4 DNA ligase 1μl
先将Vector和DNA混合好，置于45℃水浴5min，马上置于冰上冷却，再加入其他成分，混匀，简单离心后，置16℃过夜。

3、大肠杆菌感受态细胞的制备（CaC12法）
全过程都要在冰上进行，且动作尽量要轻
(1) 从37℃培养16-20h的平板中挑取单菌落，转到5ml LB液体培养基中，
37℃，250rpm，培养过夜（约16h）。

(2) 按1%接种量接种到含有50ml LB液体培养基的500ml三角瓶中，37℃，250rpm，培养2-2.5h（定时检测OD600值，使OD600≈0.4）。

(3) 将菌液转移到一个无菌的、一次性使用的、用冰预冷的50ml离心管中，冰上放置10min，使培养物冷却至0℃。

(4) 于4℃，4000rpm离心10min，以回收细胞。

(5) 倒出培养液，将管倒置1min以使最后的痕量培养液流尽。

(6) 每50ml初始培养液用30ml冰预冷的0.1mol/L CaC12溶液重悬细胞沉淀。

(7) 于4℃，4000rpm离心10min，以回收细胞。

(8) 倒出培养液，将管倒置1min以使最后的痕量培养液流尽。

(9) 每50ml初始培养液用2ml冰预冷的0.1mol/L CaC12溶液重悬细胞沉淀，置于冰上4-10min，分装成200μl /1.5mL离心管中，于-70℃保存备用。

4、大肠杆菌的转化
(1) 取DNA连接物10μl，冰浴下加入到200μl大肠杆菌感受态细胞中，混匀，冰上放置30min；其间可轻摇管2-3次，防止菌体沉于管底。

(2) 将管放入预加温至42℃的循环水浴中，热激90s，不要摇动管。

(3) 快速将管转移到冰浴中，室细胞冷却1-2min。

(4) 每管加入到800μlSOC液体培养基中，37℃，200rpm温育40min-1h，以使大肠杆菌复苏，并表达质粒编码的抗生素抗性标记基因。

(5) 将适当体积（每个90mm平板达200μl）已转化的感受态细胞转移到含相应抗生素的SOB平板上，室温放置直至液体被吸收。

(6) 倒置平皿，于37℃培养12-16h。

5、重组子的鉴定
(1) 重组子的PCR鉴定：
①从平板上挑取白色单菌落，于装有1ml LB(含有相应抗生素)的1.5ml离心管内37℃培养过夜；
②取1μl菌液作为模板，对单菌落进行PCR鉴定，初步筛选出含目的片段的阳性菌落。

(2) 重组质粒的酶切鉴定：
将待测阳性菌落进行扩培，用SDS碱裂解法进行质粒DNA的提取，通过酶切分析对阳性重组子进行最终确认。