苦参碱调节Aurora-A表达逆转胰腺癌吉西他滨耐药的研究

1、项目名称：苦参碱调节Aurora-A表达逆转胰腺癌吉西他滨耐药的研究

2、研究前景分析

胰腺癌的发病率逐年升高，在欧美居常见恶性肿瘤的第4位，在我国位于恶性肿瘤死亡的第9位。据报道胰腺癌在初次确诊后，1年内死亡率达80%，3年内为95%。转移患者的中位生存时间3-6 mon，局部晚期6-10 mon。存活率的提高主要源于手术切除率和外科治疗水平的提高。手术仍是目前惟一有希望治愈胰腺癌的措施，但由于缺乏早期诊断手段，只有10%～20%的病人就诊时适宜手术切除，总的切除率为14%。手术切除者，总的5年存活率为18%，淋巴结阴性的病人为32%，切缘和淋巴结均为阴性的病人可达到40%。70%～80%的病人由于肿瘤无法切除，必须通过非手术治疗来改善生活质量并延长生存期[1]。即使是肿瘤切除的病人，既往的随机对照研究也证明远期效果不理想，患者大多死于肝转移和局部复发。所以在手术同时配合辅助化疗，以期达到提高生活质量和延长生存时间的目的。但胰腺癌的化疗效果仍不是很理想，作为胰腺癌的首选药物的而吉西他滨，其化疗有效率仅为25%[2]。多药耐药（multidrug resistance，MDR）是肿瘤化疗失败的主要原因之一。MDR 是指抗某种细胞毒物药的耐药特征，可对许多结构上无关或作用机制上不同的其他细胞毒药物产生交叉抗药性，可由肿瘤细胞的MDR基因过表达或扩增所引起，但是其机制却不明确。

吉西他滨在胰腺癌的化疗中有着极其重要的地位。吉西他滨是一种属于新型抗嘧啶核苷酸代谢化疗药物，属细胞周期特异性抗代谢类药物，主要作用于DNA合成期（即S期）的肿瘤细胞，是胰腺癌的标准一线化疗方案[3]。有报道指出，腹腔内吉西他滨灌注能有效抑制肿瘤生长，改善患者生活质量，并减轻全身毒性反应[4]。尽管吉西他滨单药方案已经成为胰腺癌辅助治疗的标准方案，但其疗效还不能令临床医生满意，尤其是对无手术指征的局部晚期和转移性胰腺癌，中位生存期的延长较传统的5-FU/LV也仅数月。多药耐药（multidrug resistance，MDR）是肿瘤化疗失败的主要原因之一。因此研究胰腺癌吉西他滨耐药机制，寻找逆转耐药的关键靶位，对提高胰腺癌吉西他滨化疗效果具有重要的意义。

目前已知的多药耐药机制包括MDR基因及其编码的P-糖蛋白过表达、拓扑异构酶Ⅱ的

改变、谷胱甘肽及其相关酶的改变、蛋白酶C改变、DNA损伤修复能力增强、细胞凋亡相关基因表达的增加[5]等。不管何种机制，细胞凋亡障碍或减少是引发耐药的重要因素。p53作为促凋亡基因已被肯定，p53基因缺失或其产物P53蛋白功能抑制是引起细胞凋亡减弱的重要原因，进一步的研究表明P53蛋白可能与肿瘤的化疗敏感性相关。P53蛋白在上游基因如Mus81等的调控下活性增强，从而介导细胞细胞凋亡，表现出对化疗药物的敏感[6]，而在抑制了P53的活性后，肿瘤细胞表现出对化疗药物的耐药。Cascalló等[7]研究发现在人胰腺癌移植瘤模型中，依次摄入吉西他滨和p53能明显抑制肿瘤生长，其抑制作用明显强于单用吉西他滨和p53，且两者联用时的化疗增敏作用与肿瘤的组织学特征相关(如增加肿瘤组织内纤维化和凋亡水平)。提出人胰腺癌体内移植模型中，恢复p53的抑瘤作用使吉西他滨化疗增敏的分子途径得以建立。Dong等[8]研究发现p53突变非独立的胰腺癌预后因素，但可以显著增加胰腺癌某些化疗药物的化疗敏感性。上述研究提示P53蛋白差异表达与胰腺癌吉西他滨化疗敏感性有关。而Aurora-A 是p53的结合蛋白，p53通过位于Aurora-A N末端的Aurora-box直接与Aurora-A结合，抑制Aurora-A激酶的活性，抑制Aurora-A引起的中心体扩增，抑制Aurora-A转化NIH3T3细胞的能力。而Aurora-A可对p53 315位丝氨酸磷酸化，导致它通过泛素化途径降解。而无活性Aurora-A的情况下p53不能被降解[9]。提示Aurora-A通过调节p53活性参与细胞凋亡及耐药[10]。研究表明Aurora-A在胰腺癌中高表达，有可能作为胰腺癌的增殖性标记，与胰腺癌的预后相关。Dr V on Hoff的实验室经过进一步研究甚至已将其作为诊治胰腺癌的分子靶点。吉西他滨高耐药的胰腺癌预示着较差的预后，可能与Aurora-A正相关[11]。因此进一步研究意为黎明女神的Aurora-A与胰腺癌吉西他滨耐药性的关系具有重要的意义。

与化疗药物毒副反应大的特点相比，中草药具有独特的优势。随着对中草药研究的不断深入，发现了许多具有抗肿瘤作用的中草药。苦参是一味传统中药，含有多种生物碱。现代医学表明，苦参类生物碱不仅具有较高的抗肿瘤活性及免疫调节作用，近来研究表明还具有逆转肿瘤对化疗药物耐药的作用。丁艳芳[12]等研究了苦参碱逆转人白血病K562/ADM细胞对阿霉素耐药性的研究，其研究结果表明了苦参碱能部分逆转K562/ADM

细胞对ADM的耐药性，提高K562/ADM细胞对ADM的敏感性，进而促进细胞凋亡，从而初步证明了苦参碱既是一种抗肿瘤药物，又是一种耐药逆转剂。该研究反应了苦参碱对白血病K562/ADM细胞对阿霉素耐药的逆转现象，但缺乏对逆转机制的深入研究。陈雁鸿[13]等将苦参碱分别与长春新碱、阿霉素、平阳霉素、顺铂及环磷酰胺六种常用的化疗药物联合作于于喉癌KBV200耐药细胞株，通过测定耐药相关蛋白P糖蛋白（P-gp）表达判断苦参碱对耐药的逆转作用。研究结果发现苦参碱分别与长春新碱和阿霉素联合作用后可使KBV200耐药细胞株P-gp的表达水平下降，从而逆转其耐药性。其研究结果表明苦参碱具有逆转部分化疗药物耐药性的现象，并表明其逆转作用与下调P-gp表达有关，但上述研究均未涉及苦参碱对耐药菌株Aurora-A表达的影响，也无苦参碱逆转耐药与调节Aurora-A有关的结论。然而以往的研究表明[14]，苦参碱可明显上调p53基因及其表达产物P53蛋白的表达，从而诱导肿瘤细胞凋亡。苦参碱具有调节P53蛋白表达的作用，Aurora-A可调控P53蛋白的活性，而P53蛋白表达与胰腺癌吉西他滨化疗敏感性相关，因此，苦参碱可能通过调节Aurora-A的表达来调控P53蛋白表达逆转胰腺癌吉西他滨耐药性，需要进行深入的研究证实。

构建相应动物及细胞模型是研究肿瘤发生发展重要的部分，建立具有明确特征的肿瘤模型是研究和揭示肿瘤分子机制的关键平台[15-17]。目前国内外对于胰腺癌吉西他滨耐药细胞系建立多采用体外细胞培养的方式。国外Togawa等[18] 通过体外吉西他滨阶梯浓度培养法建立了一个对吉西他滨耐药的胰腺癌细胞系，并通过该模型研究发现此细胞系同时也对5-FU 有耐药性，提示针对吉西他滨与5-FU 的耐药性通路可能有所重叠，或许与肿瘤的多药耐药有关。国内要洁等[19]通过亦逐步增加培养基中吉西他滨的浓度，在人胰腺癌细胞系SW1990中建立了对吉西他滨耐药的细胞系SW1990-GEM。并且研究表明SW1990和SW1990-GEM的半数抑制浓度(IC50)有显著性差异；SW1990-GEM，耐药性能明显、稳定，对5-FU、表柔比星、丝裂霉素、甲氨蝶呤、紫杉醇、泰素帝、长春新碱和依托泊苷产生交叉耐药，对顺铂、阿糖胞苷无交叉耐药。这些动物模型、细胞系的构建为胰腺癌及化疗耐药性的机制研究提供了平台。但这些模型不能真实反映临床上胰腺癌耐药多通过体内药物诱导逐步产生的实际