糖代谢与调节

二、黑曲霉柠檬酸生物合成途径
黑曲霉利用糖类发酵生成柠檬酸其生物合成途径是，葡 萄糖经EMP、HMP途径降解生成丙酮酸，丙酮酸一方面氧化 脱羧生成乙酰CoA，另一方面经CO2固定化反应生成草酰乙 酸，草酰乙酸与乙酰CoA缩合生成柠檬酸。 (1)生长期与产酸期都存在EMP与HMP途径，前者 EMP:HMP=2:1，后者EMP:HMP=4：1 (2)黑曲霉柠檬酸产生菌中存在TCA循环与乙醛酸循环，在 以糖质原料发酵时，当柠檬酸积累时，TCA和乙醛酸循环 被阻断或减弱。

根据代谢物脱下的氢的最初受体不同，分为 NADH呼吸链和FADH2呼吸链。
3、氧化磷酸化：以代谢物进行生物氧化所产生 的能量合成高能化合物（如ATP）的过程称为 氧化磷酸化。 4、P/O比值：表示氧的消耗与ATP生成的个数 间的关系，即每消耗1摩尔氧所消耗无机磷的 摩尔数，它表明每消耗1摩尔的氧所能生成的 ATP分子个数的多少。NADH呼吸链P/O=3， FADH2 呼吸链P/O=2。
+6CO2+12NADPH+12H++6Pi
磷 酸 戊 糖 途 径
6-磷酸葡萄糖(C6)×3
3NADP+ 3NADP+3H+
6-磷酸葡萄糖脱氢酶
6-磷酸葡萄糖酸内酯(C6)×3
第一阶段
6-磷酸葡萄糖酸(C6)×3
3NADP+ 3NADP+3H+
6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶
3CO2
5-磷酸核酮糖(C5) ×3 5-磷酸木酮糖 C5 5-磷酸核糖 C5 7-磷酸景天糖 C7 4-磷酸赤藓糖 C4 6-磷酸果糖 C6 5-磷酸木酮糖 C5 3-磷酸甘油醛 C3 6-磷酸果糖 C6
第二节
（一）D-核糖发酵机制
D-核糖发酵
（二）D-核糖发酵的代谢控制育种
1、出发菌株选择 芽孢杆菌属的细菌转酮酶缺陷突变株积 累D-核糖具有普遍性。多采用芽孢杆菌属细 菌作为出发菌株。
2、转酮酶缺陷突变株的分离（选育）
（1）选育不利用D-葡萄糖酸或L-阿拉伯糖的突变株， 因为D-葡萄糖酸和L-阿拉伯糖必须通过磷酸戌糖途径 进行代谢，若转酮酶发生缺陷，那样菌体自然也就不 能利用D-葡萄糖酸或L-阿拉伯糖。 （2）选育莽草酸缺陷突变株 （3）选育L-色氨酸 - 、L-酪氨酸 - 、L-phe- 、CoQ- 、Vk或叶酸缺陷突变、4-磷酸赤藓糖合成受阻、转酮酶 - 、
发酵代谢控制
Chapter 4 糖代谢与控制
第一节 糖代谢与调节
一、概述
“三羧酸循环” 有氧情况 好氧 生物 “乙醛酸循环” CO2 + H2O
“糖酵解”
葡 萄 糖
不需氧
丙酮酸
缺氧情况
“乳酸发酵”
乳酸
厌氧 “乳酸发酵”、“乙醇发酵” 乳酸或乙醇 生物
“磷酸戊糖途径”
需氧
CO2 + H2O
EMP途径
CO2 2
琥珀酸
α-酮戊二酸
琥珀酰CoA
CO2 NADH+H+ H H NAD+
磷酸戊糖途径：又称HMP途径(己糖磷酸支路）
是糖类的第二条重要代谢途径，即葡萄糖分解的另外一种机
制（不经EMP和TCA)。这种途径存在于细胞溶胶中，广泛存在于 动植物细胞内。它由一个循环式的反应体系构成，分为2个阶段： 氧化阶段:由6－磷酸葡萄糖直接脱氢脱羧生成磷酸戊糖 非氧化阶段:磷酸戊糖分子再经重排最终又生成6－磷酸葡萄糖。 总反应式为： 6×6-磷酸葡萄糖+12NADP++7H2O 5×6-磷酸葡萄糖
3、α-酮戊二酸脱氢酶的调节
在黑曲霉柠檬酸产生菌中，TCA循环的一个显
著特点是,α -酮戊二酸脱氢酶的合成受葡萄糖和
铵离子的阻遏。因此当以葡萄糖为碳源时，在柠
檬酸生成期，菌体内不存在α -酮戊二酸脱氢酶或
活力很低。
(三)氧对柠檬酸积累的调节
乙酰CoA和草酰乙酸结合生成柠檬酸过程中要引进一 个氧原子，因此氧也可以看作为柠檬酸生物合成底物。它 对柠檬酸发酵的作用为： (1)氧是发酵过程生成的NADH2重新氧化的氢受体。 (2)近来的研究发现，黑曲霉中除了具有一条标准呼吸链 以外，还有一条侧系呼吸链。
（1）温度35－37℃。
（2）严格控制培养基中的Mn、Zn、Fe。
（3）氮源、蛋白质控制在0.45％，适量补充硫酸铵。 （4）控制前期长菌pH4左右，后期产酸3以下。 （5）溶解氧要高。
作业4
1、什么是能荷？细胞中的能荷高低是如何调节 糖代谢的？ 2、根据柠檬酸的生物合成途径及代谢调节机 制，阐述柠檬酸高产菌的育种思路。
2、能荷的调节
图4－1 能量生成代谢体系的调节
当能荷降低时：则激活催化糖分解酶系，或解 除ATP对这些酶的抑制（如糖原磷酸化酶、果糖磷 酸激酶、柠檬酸合成酶、异柠檬酸脱氢酶等）并抑 制糖类合成酶(糖原合成酶，1、6磷酸果糖酯酶)， 从而加速糖分解和TCA的产能代谢。
当 能 荷 升 高 时 ： 细 胞 中 AMP ， ADP 转 变 为 ATP，这时ATP则抑制糖原降解以及糖酵解和TCA 循环中的关键酶，并激活糖类合成酶，从而抑制糖 的分解，加速糖原的合成。
4、选择耐高渗透压的突变株。 （高糖、高柠檬酸的培养基中能生长） 5、选择不分解利用柠檬酸的突变株。 6、选育形态突变株。
7、选育单氟乙酸、三氟乙酸或2,4-二硝基酚敏感突
变株。
8、选育某些氨基酸缺陷型突变株。
9、选育抗药性突变株。
10、选育强化CO2固定反应的突变株。 11、强化柠檬酸合成酶。 12、选育形成微小菌球体的突变株。（直径小于0.1mm) 13、发酵控制
Mn2+
COOH CO + GTP CH2 COOH 草酰乙酸
（3）
丙酮酸
苹果酸
草酰乙酸
电子传递系统与氧化磷酸化

1.生物氧化：在生物体内生物酶的催化作用下，
凡是能通过氧化作用释放能量的反应都称为生
物氧化作用。

过程：脱氢、递氢、受氢

2、呼吸链：从代谢物脱下的氢，经过一系列 传递体，最终传给分子氧生成水的全部体系称 为呼吸链。又称为电子传递体系。
转醛酶-。
3、其它标记
在维持转酮酶缺陷的情况下，进一步诱变
使菌体带上具有高葡萄糖脱氢酶活性和丧失孢 子形成能力，可使D-核糖大量积累。
4、利用基因工程
小林等人将葡萄糖脱氢酶基因克隆到载体 质粒PHY300PLK中，然后转化到枯草芽孢杆菌中 去。构建扩增葡萄糖脱氢酶的D-核糖工程菌， 35℃发酵80h可积累49g/L D-核糖。
微生物发酵葡萄糖 最为重要，有机物只 是部分被氧化，如葡 萄糖到丙酮酸，称为 糖酵解。
乙酰CoA H2O
CoA
柠檬酸
H2O
草酰乙酸
NADH+H+ H H NAD+
顺乌头酸
H2O
苹果酸
异柠檬酸
NAD+
H2O
延胡索酸
H2 FADH2 FAD
三羧酸循环
ATP
GTP GDP
H H NADH+H+
草酰琥珀酸
二、糖代谢的调节－能荷的调节
1、能荷的概念（energy charge）
能荷是一个表示细胞能量状态的参数。是细胞中所含腺 苷酸中含有相当于ATP的数量百分比，其表示式为： 能荷=（[ATP]+0.5[ADP]）/（[ATP]+[ADP]+[AMP]） ×100% 当细胞中腺苷酸全部是ATP，能荷为1； 当细胞中腺苷酸全部是ADP，能荷为0.5； 当细胞中腺苷酸全部是AMP，能荷为0 当细胞或线粒体中三种核苷酸同时并存时，能荷大小随 三者比例而异，三者的比例随细胞生理状态而变化。
5、发酵控制
发酵培养基：
碳源：葡萄糖、D-甘露糖、山梨醇、D-甘露醇、麦芽 糖、乳糖、甘油、 糊精、可溶性淀粉等。 氮源：干酵母、酵母膏、牛肉膏、蛋白胨 、玉米浆 、 （NH4）2SO4、CaCO3 。
要在好气条件下，pH中性，温度37℃。
第三节 柠檬酸发酵
一、柠檬酸简介

柠檬酸又名枸橼酸，学名α-羟基丙烷三羧酸，是 生物体主要代谢产物之一。化学名称2-羟基丙三 羧酸，英文文献俗名citric acid，分子式C6H8O7。 无色或白色晶体，无臭，味极酸，易溶于水和乙 醇、微溶于乙醚、水溶液呈酸性反应。
三、柠檬酸生物合成的代谢调节机制 （一）糖酵解及丙酮酸代谢的调节 1、磷酸果糖激酶（PFK）：
2、丙酮酸羧化酶：催化生成草酰乙酸
（二）三羧酸循环的调节
1、柠檬酸合成酶的调节：柠檬酸合成酶是TCA循环第一个 酶。但黑曲霉中柠檬酸合成酶没有调节作用。（组成型酶） 2、顺乌头酸酶、异柠檬酸脱氢酶的调节： 顺乌头酸酶是催化柠檬酸－顺乌头酸－异柠檬酸正逆反 应的酶，研究表明，黑曲霉中有一种单纯的位于线粒体上 的顺乌头酸水合酶，它在催化时能建立下面的平衡：柠檬 酸:顺乌头酸:异柠檬酸＝90:3:7。 顺乌头酸酶、异柠檬酸脱氢酶在柠檬酸产生与不产生时均 存在，而当控制铜离子0.3mg/L，铁离子2mg/L和pH2.0情况 下，这2种酶均不出现活力，发酵中柠檬酸正是在这个pH条 件下积累的。
当缺氧时，只要很短时间中断供氧，就会导致此侧 系呼吸链的不可逆失活，而导致柠檬酸产酸急剧下降。
四、柠檬酸发酵的代谢控制育种
1、出发菌株的选择 2、选择透明圈大的突变株。 如：平板：10%甘薯 + 2 %的琼脂 + 0.5%
Caቤተ መጻሕፍቲ ባይዱO3
3、选择变色圈大的突变株。平板：麦汁培养基 + pH值指示剂 诱变后，33℃培养3天，变色圈大的则好。
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第 二 阶 段
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3-磷酸 甘油醛 C3
CO2的固定反应
（1）
COOH CO + CO2 + ATP + H2O CH3 丙酮酸
Mg2+
COOH CO CH2 COOH 草酰乙酸 + ADP + Pi + 2H+
（2）
COOH CO CH2 烯醇式磷酸丙酮酸 P + GDP + CO2