流式细胞检测课件 PPT
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流式淋巴细胞亚群检测技术原理ppt课件
淋巴细胞亚群检测
1
目录
1 淋巴细胞的分类 2 淋巴细胞亚群检测方法 3 淋巴细胞亚群检测原理 4 淋巴细胞亚群的免疫功能 5 淋巴细胞亚群的临床意义
2
淋巴细胞的分类
细胞免疫 T淋巴细胞
体液免疫 B淋巴细胞
淋巴细胞占外周血白细胞总数的20%-40%
固有免疫 NK细胞
3
检测方法
采用流式细胞术（FCM） 是以流式细胞仪为检测手段的一项能快速、精确的对单个
21
T4细胞降低
提示体内存在病毒等病原微生物，主要见于临床各种病毒 感染性疾病，以HIV感染时减少最为明显
T4细胞减少也可见于γ免疫球蛋白缺乏症、胸腺发育不良 、严重联合免疫缺陷病、严重创伤、大手术等
22
T8细胞
主要功能：特异性直接杀伤靶细胞 两条途径：一是分泌穿孔素、颗粒酶及淋巴毒素
等直接杀伤靶细胞 二是通过Fas/FasL途径诱导细胞凋亡。
细胞(或生物学颗粒)的理化特性进行多参数定量分析和分 选的技术
4
FCM
检测对象：单细胞悬液或生物颗粒； 检测参数：多参数； 检测特点：单细胞水平分析； 检测速度：高速，最高达上万个细胞/秒； 检测结果：精度高、准确性好； 可对目标细胞进行分选；
5
检测原理
免疫荧光染色主要有两种方法。间接标记的方法难以进 行多色标记，而且操作复杂，所以一般首选直接荧光染 色
主要检测项目
T4细胞 总T细胞
T8细胞
淋巴细胞
B细胞 NK细胞
15
淋巴细胞的免疫标志
总T淋巴细胞 CD3+
T4细胞 CD3+CD4+CD8-
T8细胞 CD3+CD8+CD4-
1
目录
1 淋巴细胞的分类 2 淋巴细胞亚群检测方法 3 淋巴细胞亚群检测原理 4 淋巴细胞亚群的免疫功能 5 淋巴细胞亚群的临床意义
2
淋巴细胞的分类
细胞免疫 T淋巴细胞
体液免疫 B淋巴细胞
淋巴细胞占外周血白细胞总数的20%-40%
固有免疫 NK细胞
3
检测方法
采用流式细胞术（FCM） 是以流式细胞仪为检测手段的一项能快速、精确的对单个
21
T4细胞降低
提示体内存在病毒等病原微生物，主要见于临床各种病毒 感染性疾病，以HIV感染时减少最为明显
T4细胞减少也可见于γ免疫球蛋白缺乏症、胸腺发育不良 、严重联合免疫缺陷病、严重创伤、大手术等
22
T8细胞
主要功能：特异性直接杀伤靶细胞 两条途径：一是分泌穿孔素、颗粒酶及淋巴毒素
等直接杀伤靶细胞 二是通过Fas/FasL途径诱导细胞凋亡。
细胞(或生物学颗粒)的理化特性进行多参数定量分析和分 选的技术
4
FCM
检测对象：单细胞悬液或生物颗粒； 检测参数：多参数； 检测特点：单细胞水平分析； 检测速度：高速，最高达上万个细胞/秒； 检测结果：精度高、准确性好； 可对目标细胞进行分选；
5
检测原理
免疫荧光染色主要有两种方法。间接标记的方法难以进 行多色标记，而且操作复杂，所以一般首选直接荧光染 色
主要检测项目
T4细胞 总T细胞
T8细胞
淋巴细胞
B细胞 NK细胞
15
淋巴细胞的免疫标志
总T淋巴细胞 CD3+
T4细胞 CD3+CD4+CD8-
T8细胞 CD3+CD8+CD4-
流式细胞仪介绍 ppt课件
Source
Forward Light
Detector
Cell Surface
Area
相对荧光强度（FL） (需探针标记)
是细胞或细胞上的荧光染料被激光激发后发射出
的荧光，不同的荧光染料其发射波长不同。
区分阴阳性：通过荧光强度可将同一个细胞群体
中的有荧光标记的细胞与无荧光标记的细胞区分
开来。
区分阳性强弱：也可以将阳性细胞中的高FL的细
非常节省细胞，对于科研珍贵标本尤为重要！
绝对的细胞计数，无需计数微珠，细胞培养后往往需要细
胞计数仪，可以完全代替细胞计数仪。
自动标记，自动进样，自动清洗，节省时间。
自动补偿，对多色分析自动生成补偿数值
小巧的台式机设计,低噪，低热
非加压系统进样
(25)
34
仪器的竞争分析
BD的各种机型（一）
无加压系统
溶液瓶附着在仪器上
仪器状态能够通过溶液瓶的不同颜色来指示
软件基本特征
12‘’触摸屏（内嵌）
Live support 远程网络服务，德国工程师进
行远程在线检修机器
VGA 接口 (连接第二个显示器或者代替的显示
器)
功能强大、易于操作
——直观的操作界面 (用于仪器控制, 数据获取和数据
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Belgium
Canada
China
France
Germany
Forward Light
Detector
Cell Surface
Area
相对荧光强度（FL） (需探针标记)
是细胞或细胞上的荧光染料被激光激发后发射出
的荧光，不同的荧光染料其发射波长不同。
区分阴阳性：通过荧光强度可将同一个细胞群体
中的有荧光标记的细胞与无荧光标记的细胞区分
开来。
区分阳性强弱：也可以将阳性细胞中的高FL的细
非常节省细胞，对于科研珍贵标本尤为重要！
绝对的细胞计数，无需计数微珠，细胞培养后往往需要细
胞计数仪，可以完全代替细胞计数仪。
自动标记，自动进样，自动清洗，节省时间。
自动补偿，对多色分析自动生成补偿数值
小巧的台式机设计,低噪，低热
非加压系统进样
(25)
34
仪器的竞争分析
BD的各种机型（一）
无加压系统
溶液瓶附着在仪器上
仪器状态能够通过溶液瓶的不同颜色来指示
软件基本特征
12‘’触摸屏（内嵌）
Live support 远程网络服务，德国工程师进
行远程在线检修机器
VGA 接口 (连接第二个显示器或者代替的显示
器)
功能强大、易于操作
——直观的操作界面 (用于仪器控制, 数据获取和数据
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《流式细胞术贝克曼》课件
贝克曼流式细胞仪的应用
免疫学研究
贝克曼流式细胞仪在免疫学研究 中广泛应用，可以用于检测免疫 细胞的表面标志物、功能活性以
及免疫细胞的分选和培养等。
血液学研究
贝克曼流式细胞仪可以用于血液 学研究，检测血细胞的表面标志 物、血型抗原等，以及进行血细
胞的分选和培养等。
肿瘤研究
贝克曼流式细胞仪可以用于肿瘤 研究，检测肿瘤细胞的表面标志 物、肿瘤抗原等，以及进行肿瘤
辐射安全
废弃物处理
正确操作仪器，避免对实验人员造成辐射 伤害。
按照规定处理实验废弃物，确保实验室环 境的安全和环保。
贝克曼流式细胞仪的特点
高通量
贝克曼流式细胞仪具有高通量的 特点，能够在短时间内处理大量 细胞样本，提高了实验效率和检
测速度。
高灵敏度
贝克曼流式细胞仪采用先进的光电 检测技术，能够检测到微弱的荧光 信号，具有高灵敏度，能够检测到 低浓度的细胞标记物。
多参数分析
贝克曼流式细胞仪可以同时检测多 个参数，包括细胞大小、颗粒性、 荧光信号等，从而对细胞进行多维 度的分析和分选。
贝克曼流式细胞仪的原理
流式细胞术原理
流式细胞术是一种在液流中快速检测和分选细胞的技术。通 过将单个细胞与荧光染料结合，利用激光束激发荧光，并通 过光电倍增管检测荧光信号，实现对细胞的快速分析和分选 。
贝克曼流式细胞仪的原理
贝克曼流式细胞仪是应用流式细胞术的仪器之一，其原理是 将待测细胞与荧光染料结合后，通过高压液流将细胞送入流 动室，在流动室内与激光束相遇，激发荧光信号，并通过光 电倍增管进行检测和记录。
用于检测精子细胞和卵 子细胞的活性与质量。
流式细胞术的发展历程
20世纪70年代
流式检测T细胞亚群 ppt课件
▪ 带通滤片 BP：允许相当窄的一段波 长范围内的光通过
ppt课件
11
(三)信号检测与分析系统
▪ 当细胞携带荧光素标记物，通过激光照射，受激光激发，产生代表不同物 质的不同波长荧光信号。这些信号以细胞为中心向空间360度立体角发射， 产生散射光和荧光信号。
ppt课件
12
散射光信号：
▪ 散射光分为前向角散射(forward scatter，FSC)和侧向角 散射(side scatter,SSC)，散射光不依赖任何细胞样品的制 备技术(如染色)，因此被称为细胞的物理参数或称固有 参数。
ppt课件
18
▪ 双参数数据的显示 双参数数据的显示是用于表达来自同一细胞两个参 数与细胞数量的关系，常用的表达方法有二维点图(dot plot)、等高线 图(contour plot)、二维密度图(density plot)。在二维图中，x坐标为 某细胞一个参数的数值，而Y坐标为该细胞另一参数的数值。从双参数 图形中可以将各细胞亚群区分开，同时可获得细胞相关的重要信息。
55%
5%
25%
ppt课件
30
精度。
ppt课件
7
▪ 流动室内充满了鞘液，鞘液的作 用是将样品流环包，鞘液流是一 种稳定的液体流动，鞘液以匀速 运动流过流动室，在整个系统运 行中流速是不变的，样品流在鞘 液的环包下形成流体力学聚焦， 使样品流不会脱离液流的轴线方 向，并且保证每个细胞通过激光 照射区的时间相等，从而得到准 确的细胞荧光信息。
ppt课件
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细胞计数
计算公式：四个角大方格细胞数的总和/4 ×104 （ml）
ppt课件
26
细胞计数要点：
1.进行细胞计数时，要求悬液中细胞数目不低于104个/ml， 如果细胞数目很少要进行离心再悬浮于少量培养液中；
流式细胞术原理及应用新课件PPT全
流式细胞术是20世纪70年代发展起来的一种技术，有人将流式细胞仪比喻成高级的荧光显微镜。 HLA-B27: 强直性脊柱炎 细胞功能检测：细胞周期、凋亡
Flow Sorting 直方图适用于：单参数分析
SORTING（细胞分选） CD16+56 NK细胞 可利用FCM进行细胞周期分析，适当选择周期特异性药物或非周期特异性药物。
巨血小板
• 细胞凋亡与坏死的区别 一般只测一个参数、不能分选
5、DNA含量分析法（晚晚期）
2F时LO必W需C停Y用TO免M疫E抑TR制Y剂。虽然凋亡与坏死的最终结果极为相似，但
凋亡检测
每一步都有检测它试剂盒们的过程与表现却有很大差别。
光路调节系统固定，自动化程度高，操作简便，易学易掌握,适合
坏死（necrosis）：坏死是细胞受到强烈理 流式细胞分析在人类基因组计划中发挥了重要作用，流式细胞技术的应用也适用于植物，目前这个技术应用范围包括流式核型分析，
目前，该技术以广泛用于生物及医 学基础研究与临床检测，在分子生物学、 免疫学、遗传学、血液学、肿瘤学等领 域内发挥着重要作用。
流式细胞仪
荧光显微镜
Flow Cytometry
控制 一般只测一个参数、不能分选
电脑
人脑
其细胞及组织的变化与坏死有明显的不同。
可利用FCM进行细胞周期分析，适当选择周期特异性药物或非周期特异性药物。
• 空白对照：ALL 应用领域将不断开拓，成为科研与临床不可或缺的重要工具。
随着白细胞分化抗原意义的确认以及单克隆抗体技术的发展，随着人们创新意识的加强，结合计算机技术和其他技术，流式细胞仪的 应用领域将不断开拓，成为科研与临床不可或缺的重要工具。 坏死（necrosis）：坏死是细胞受到强烈理化或生物因素作用引起细胞无序变化的死亡过程。
《流式细胞仪》课件
便携式设备的应用
将流式细胞仪的设备体积继续缩小， 大量应用于生物界的基础研究以及 医学检测和移动采样等领域。
流式细胞仪的市场前景评估
1 市场规模
2 主要厂商
3 市场推动因素
流式细胞仪市场规模呈自上 世纪六十年代发明起逐年扩 大的趋势，预计到2027年达 到40亿美金。
Becton, Dickinson and Company、Beckman Coulter、 Merck Millipore等公司产品 市场占领率较高。
灯源
氙气灯、汞灯、钨丝灯等不同的光源都可以被用作流式细胞仪的光源，不同灯源在功率、波 长、寿命等方面存在差异。
探测器的选择
1
荧光检测器
是流式细胞仪检测系统的关键组成部分，不同的检测器可以检测不同的荧光参数， 如细胞大小、细胞形态、细胞核酸含量等。
2
散射检测器
散射检测器可检测颗粒的大小和光密度信息，如侧散射检测器用于检测细胞的大 小和形态，前散射检测器检测颗粒的光密度信息。
3 准确记录
记录样品来源、批号和实验日期等信息，并保证实验室干净卫生。
样本的处理与染色
细胞损伤
避免长时间的离心和过滤，防止 细胞的膜破坏和凋亡。
细胞处理
使用重组蛋白等方法对细胞进行 特定功能标记的处理。
荧光染色
使用专门的生物染料与细胞反应 后，在流动细胞仪中检测荧光信 号。
流式细胞仪的参数设置
软件设置
流式细胞仪最早由韦斯利·莱恩和墨菲博士等人于1965年开发。自此以后，它经历了巨大的 技术发展和应用范围的扩大。
用途
流式细胞仪可应用于人类疾病的研究、药物开发、医学诊断、基因工程、环境监测等领域。
流式细胞仪的原理
流式细胞仪结果分析课件PPT
何形成单个细胞流）
免疫胶乳颗粒的应用即液相芯片技术是把微小的乳胶微球分别染成上百种不同的荧光色，把针对不同检测物的乳胶微球混地结合，经激光照射后不同待测特产生不同颜色，并可进行定量分析。
易与标记单抗结合而不影响抗体的特异性
光束成形器：两十字交叉放置的透镜
前向散射光（forward scatter, FS）：激光束照射细胞时，光以相对轴较小角度(0. 乙醇或甲醇保存法（2周）
区阈（region, R）与门(gate, G ) 是两个相关的概念，区阈可与门对应，但是也可以包含于门。 用计算机系统对流动的单细胞悬液中单个细胞的多个参数信号进行数据处理分析，保证了检测速度与统计分析精确性。 D3 CD4- /CD3-
• 多参数分析 免疫胶乳颗粒的应用即液相芯片技术是把微小的乳胶微球分别染成上百种不同的荧光色，把针对不同检测物的乳胶微球混合后再加入
二维等高图 光电倍增管：FS, SS（散射光）， FL1, FL2, FL3, FL4（荧光）
流式细胞仪常检测的细胞特性 （二）免疫荧光染色的质控
假三维等高图 假三维等高图
由一维参数(散射光或荧光)与颗粒计数(COUNT)构成，反映同样散射光或荧光强度的颗粒数量的多少。 三、免疫胶乳颗粒技术的应用
• 三参数直方图 同型对照：即免疫荧光标记中的阴性对照，选用相同源性的未标记单抗作为对照调整和设置电压，以保证特异性。
同型对照为免疫荧光标记中的阴性对照，可使荧光标记单抗的信号保持其特异性。 流式细胞仪的基本结构：
• 双参数直方图:点图 光束成形器：两十字交叉放置的透镜
流式细胞仪分析中前向散射光、侧向散射光和荧光的检测意义。 用计算机系统对流动的单细胞悬液中单个细胞的多个参数信号进行数据处理分析，保证了检测速度与统计分析精确性。
流式细胞术原理及应用 ppt课件
• 荧光染料/荧光化合物 PI、7-AAD等插入核酸链中； CFSE和蛋白质共价结合；
– 荧光蛋白-如GFP、RFP、YFP、CFP、mCherry、DsRed等，自身发荧 光。
ppt课件
19
常用荧光素
ppt课件
20
常用荧光染料
• PI（碘化丙啶 535, 623） 可选择性的插入核酸双螺旋碱基对中。常用于 DNA分析，需要用RNase处理细胞排除RNA对DNA荧光定量的影响；PI 不能透过活细胞膜，常用于鉴定死细胞。
ppt课件
10
• 实验中，常利用FSC和SSC这两种参数的组合，区分不同的细 胞群体，去除碎片、死细胞和粘连细胞的干扰。
红细胞、死细胞和碎片
ppt课件
粒细胞 单核细胞 淋巴细胞
11
• 阈值：溶液中的杂质或者死细胞，很容易产生微小的干扰信 号，所以必须设置阈值，排除杂质、细胞碎片或体积较小的 死细胞。
•横坐标：道数
•横坐标：某细胞参数
•纵坐标：细胞数
相对含量
•纵坐标：该细胞另一
参数含量
等高线图（Contour Plot）
ppt课件
15
细胞分选系统
• 电荷式分选 超声振动器(15-100kHz) 液流充电系统 高压偏转板 收集装置(流式管、离心 管、培养板、载波片等)
MACS ®技术：Magetic Activated Cell Sorting 免疫学+细胞生物学+磁力学
RNA呈橙黄色荧光，可进行DNA/RNA双参数分析。
ppt课件
21
三、如何设计流式实验
准备工作： •确定实验要检测的marker •选择合适的荧光素标记的抗体 •选择合适的同型对照抗体
– 荧光蛋白-如GFP、RFP、YFP、CFP、mCherry、DsRed等，自身发荧 光。
ppt课件
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常用荧光素
ppt课件
20
常用荧光染料
• PI（碘化丙啶 535, 623） 可选择性的插入核酸双螺旋碱基对中。常用于 DNA分析，需要用RNase处理细胞排除RNA对DNA荧光定量的影响；PI 不能透过活细胞膜，常用于鉴定死细胞。
ppt课件
10
• 实验中，常利用FSC和SSC这两种参数的组合，区分不同的细 胞群体，去除碎片、死细胞和粘连细胞的干扰。
红细胞、死细胞和碎片
ppt课件
粒细胞 单核细胞 淋巴细胞
11
• 阈值：溶液中的杂质或者死细胞，很容易产生微小的干扰信 号，所以必须设置阈值，排除杂质、细胞碎片或体积较小的 死细胞。
•横坐标：道数
•横坐标：某细胞参数
•纵坐标：细胞数
相对含量
•纵坐标：该细胞另一
参数含量
等高线图（Contour Plot）
ppt课件
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细胞分选系统
• 电荷式分选 超声振动器(15-100kHz) 液流充电系统 高压偏转板 收集装置(流式管、离心 管、培养板、载波片等)
MACS ®技术：Magetic Activated Cell Sorting 免疫学+细胞生物学+磁力学
RNA呈橙黄色荧光，可进行DNA/RNA双参数分析。
ppt课件
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三、如何设计流式实验
准备工作： •确定实验要检测的marker •选择合适的荧光素标记的抗体 •选择合适的同型对照抗体
流式细胞术的原理及应用ppt课件
➢可把感兴趣细胞分 选到特定培养孔或板 上（4路和24孔板）
➢适用于高速分选和 多色分析
6
在整堂课的教学中，刘教师总是让学 生带着 问题来 学习， 而问题 的设置 具有一 定的梯 度，由 浅入深 ，所提 出的问 题也很 明确
流式细胞仪检测范围
细胞大小
细胞粒度
细 细胞表面面积
胞 结
核浆比例
构 DNA含量与细胞周期
18
在整堂课的教学中，刘教师总是让学 生带着 问题来 学习， 而问题 的设置 具有一 定的梯 度，由 浅入深 ，所提 出的问 题也很 明确
散射光
它反应细胞的物理特性,根据前侧向散射光，可以把不同 类型的细胞群加以区分
FSC（小角散射光)它反 应细胞的相对大小和截 面积的大小
SSC (90度角散射光)代 表细胞的颗粒度和精细 结构的变化
1.液流系统： 细胞悬液被吸入检测室后，在鞘液
(sheath)的约束下，通过喷嘴，使其形成单细 胞悬液。
10
在整堂课的教学中，刘教师总是让学 生带着 问题来 学习， 而问题 的设置 具有一 定的梯 度，由 浅入深 ，所提 出的问 题也很 明确
2.光学系统： 激光是较常用的光源, 稳定性好、单色性好。 散射光和荧光信号被收集、处理转化为数字信号。
FACS Vantage DiVa
科研型（大型机）
特点： ➢多数字化 ➢适用于各类细胞分选 ➢4路分选
5
在整堂课的教学中，刘教师总是让学 生带着 问题来 学习， 而问题 的设置 具有一 定的梯 度，由 浅入深 ，所提 出的问 题也很 明确
FACSAria
科研型
特点： ➢分辨率高
➢选配多种波长和类 型激光器
成,将产生的光信号引导至检测器
➢适用于高速分选和 多色分析
6
在整堂课的教学中，刘教师总是让学 生带着 问题来 学习， 而问题 的设置 具有一 定的梯 度，由 浅入深 ，所提 出的问 题也很 明确
流式细胞仪检测范围
细胞大小
细胞粒度
细 细胞表面面积
胞 结
核浆比例
构 DNA含量与细胞周期
18
在整堂课的教学中，刘教师总是让学 生带着 问题来 学习， 而问题 的设置 具有一 定的梯 度，由 浅入深 ，所提 出的问 题也很 明确
散射光
它反应细胞的物理特性,根据前侧向散射光，可以把不同 类型的细胞群加以区分
FSC（小角散射光)它反 应细胞的相对大小和截 面积的大小
SSC (90度角散射光)代 表细胞的颗粒度和精细 结构的变化
1.液流系统： 细胞悬液被吸入检测室后，在鞘液
(sheath)的约束下，通过喷嘴，使其形成单细 胞悬液。
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在整堂课的教学中，刘教师总是让学 生带着 问题来 学习， 而问题 的设置 具有一 定的梯 度，由 浅入深 ，所提 出的问 题也很 明确
2.光学系统： 激光是较常用的光源, 稳定性好、单色性好。 散射光和荧光信号被收集、处理转化为数字信号。
FACS Vantage DiVa
科研型（大型机）
特点： ➢多数字化 ➢适用于各类细胞分选 ➢4路分选
5
在整堂课的教学中，刘教师总是让学 生带着 问题来 学习， 而问题 的设置 具有一 定的梯 度，由 浅入深 ，所提 出的问 题也很 明确
FACSAria
科研型
特点： ➢分辨率高
➢选配多种波长和类 型激光器
成,将产生的光信号引导至检测器
流式细胞术及其临床应用课件(1)
光源与光学系统
➢ 激发光源 ➢ 光学系统
信号收集与光电转 换系统
计算机与分析系统
细胞分选与浓缩系统
激发光源 滤光片
流动室、鞘 液和样本流
信号检测器
计算机分析
（二）激光光源与光学系统
（一）激发光源 ：激光器
气体激光器：氩离子(488nm、355nm)、氦氖(633nm)、氪离子 (647nm)、氪氩(568nm)；
（四）计算机和分析系统
十字门
线性门
流式细胞仪特点
流式细胞术的最大特点是能在保持细胞及细胞器或微 粒的结构及功能不被破坏的状态下，通过荧光探针的 协助，从分子水平上获得多种信号对细胞进行定量分 析或纯化分选
细胞不被破坏，测量快速、大量、准确、灵敏、定量
目前国内主要流式细胞仪厂家 Beckton Dickinson(BD) BACKMAN COULTER
淋巴细胞亚群分析
试剂：BD Multitest IMK Kit 标本：外周血（常用） 配色：CD3-FITC/CD8-PE/CD45-PerCP/CD4-APC
（三）荧光信号
目前常用FCM配置（BD Calibar） 488nm激光管常用染料有 第一通道（FL1）：FITC (Fluorescein Isothiocyanate) 第二通道（FL2）：PE (Phycorey- thrin) 第三通道（FL3）：PerCP (Peridinin Chlorophyll Protein) PE-Cy7、PE-Cy5、 PerCP-Cy5.5 633nm激光管常用染料有
1
10
2 700
3 720
4
15
……
Counts
0…………101…………102…………103
➢ 激发光源 ➢ 光学系统
信号收集与光电转 换系统
计算机与分析系统
细胞分选与浓缩系统
激发光源 滤光片
流动室、鞘 液和样本流
信号检测器
计算机分析
（二）激光光源与光学系统
（一）激发光源 ：激光器
气体激光器：氩离子(488nm、355nm)、氦氖(633nm)、氪离子 (647nm)、氪氩(568nm)；
（四）计算机和分析系统
十字门
线性门
流式细胞仪特点
流式细胞术的最大特点是能在保持细胞及细胞器或微 粒的结构及功能不被破坏的状态下，通过荧光探针的 协助，从分子水平上获得多种信号对细胞进行定量分 析或纯化分选
细胞不被破坏，测量快速、大量、准确、灵敏、定量
目前国内主要流式细胞仪厂家 Beckton Dickinson(BD) BACKMAN COULTER
淋巴细胞亚群分析
试剂：BD Multitest IMK Kit 标本：外周血（常用） 配色：CD3-FITC/CD8-PE/CD45-PerCP/CD4-APC
（三）荧光信号
目前常用FCM配置（BD Calibar） 488nm激光管常用染料有 第一通道（FL1）：FITC (Fluorescein Isothiocyanate) 第二通道（FL2）：PE (Phycorey- thrin) 第三通道（FL3）：PerCP (Peridinin Chlorophyll Protein) PE-Cy7、PE-Cy5、 PerCP-Cy5.5 633nm激光管常用染料有
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2 700
3 720
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……
Counts
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- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
工作流程
❖样本制备 ❖荧光染色 ❖上样检测 ❖数据分析
Y
+
Cell Suspension
Fluorescently Labelled Antibody
Histogram
Blue Laser (488 nm)
Fluorescence Detector
Fluorescence
Single Cell Suspension
抗体的选择： ➢ 首选直接标记抗体 荧光分子强度：APC >PE >PerCP >FITC
PE较强，适用于弱表达抗原 FITC最便宜，适用于强表达抗原
常见荧光物质的应用
直方图和点阵图
直方图(Histogram Plot) ——单参数分析. X-Axis: 荧光信号强度. Y-Axis: 细胞数目.
点阵图(Dot Plot) ——双参数分析. ▪X and Y axis：两种荧光信号强度. ▪每个点代表一个细胞.
Log & Lin:荧光强度的坐标可以是线性的，也可以是对数的.
直方图：可根据单一因素区分细胞亚群
70
70 cells each
have a green
fluorescence
intensity of
荧光信号
➢ 线性放大——DNA、RNA、总蛋白质含量等的检测。 ➢ 对数放大——抗原检测等。 ➢ 荧光信号的面积(FL2－A)——准确反映DNA的含量。 ➢ 荧光信号的宽度(FL2－W)——常用来区分双联体细胞。
常见荧光素： • FITC(异硫氰酸荧光素）：绿色 530nm • PE（藻红蛋白）：橙黄色 575nm • PerCP(多甲藻黄素叶绿素蛋白）：深红色 675nm • PI(碘化丙啶）：橙红色 620nm • APC(别藻兰蛋白）：红色 660nm
SSC 粒细胞 FSC
SSC 单核细胞 FSC
SSC 淋巴细胞 FSC
Side Scatter
0 200 400 600 800 1000
Forward Scatter
荧光信号
488nm excitation
~520nm emission
FITC-labeled antibody binds surface antigen
可以互相讨论下，但要小声点
光学系统
FCM的光学系统是由若干组透镜、滤光片、小孔组成。
Longpass
460 500 540
Shortpass
460 500 540
Bandpass
460 500 540
LP 500
SP 500
BP 500/50
LP 500 = >500 nm SP 500 = <500 nm BP 500/50 = 475 nm – 525 nm
电子器件
检测器 、光电二极管、光电培增管
功能: • 量化电压脉冲 • 将模型信号转换
成数字信号 • 荧光补偿 1) 数据传给电脑以
便分析
软件系统
InCyte 开放模块- Flexibility
整合多组 数据
分析方式 灵活
R1
拖曳式设门，操
作简单易学
R2
多种Plot 以供选择
Work Station
微毛细管流动池
20mm 50-100mm
Flow Rate = 0.1 - 1 ul / second
0.1mm
Probe Volume = 200 pl
Volume = 200nl
Volume = 0.03 Volume = 0.02 Volume = 0.01
大家有疑问的，可以询问和交流
Presentation title in footer | 00 Month 0000
流式细胞技术
FLOW CYTOMETRY
2015-07-07
What does it mean?
CYTOMETRY
Cell Measure(ment)
MEASUREMENT OF A CELL
FLOW CYTOMETRY ：在液流系统中，快速测定单个细 胞或微粒的物理特性和生化特性的方法。 Flow Cytometer (FCM)仪
液流系统
功能：传送待测样本中的细胞到激光照射区。 样本：0.2-150微米的粒子，最快可在1秒种内计测数万个细胞。
No Sheath Fluid Waste： <10ml /hr run 2千—1万 cells/Test
Sheath Fluid: ~10 mL/Test Waste：1L / hr run 10万—100万cells/Test
FSC: Forward angle light scatter – 区分细胞与细胞碎片
SSC: Side-angle (90) light scatter – 在细胞大小相同的情况下，区分不同的细胞种类。
Scatter – How it works
Laser Light
Laser Light
Laser Light
M2
about 400
53
35
M1
Notice the subpopulation?
18
Count
0
10e0
10e1
10e2
10e3
CD20-FITC (GRN-HLog)
10e4
点阵图：根据多因素区分细胞亚群
流式细胞仪
BD FACSVantage
BD Calibur
Guava 5HT 微毛细管细胞分析仪
BECKMAN CytoFLEX
Miltenyi MACSQuant
流式细胞仪的组成
Fluidics
Waste
Optics
Electronics
Software
进样准备
样品规格： 96孔板 或 1.5 mL 小管
Min/Max threshold
Heat-Map数据 分析直观化
测量参数
光散射强度 荧光强度 样本体积 细胞数目
前向散射角和侧向散射角
侧向散射角
虽然也与细胞的形状与大小有关， 但是它对细胞膜、胞质、核膜的， 折射率更敏感。
前向散射角
Incident laser light
“大小”
成正比例关系: • 截面积大小 • 折射率 • 细胞形状
easyCyte 5HT system
激发光: 75 mW Blue Laser (488 nm)
检测荧光通道： Forward Scatter – FSC Side Scatter – SSC Green – 525/30 nm Yellow – 583/26 nm Red1 – 680/30 nm