三种脱钙液对骨组织免疫组化染色的影响

三种脱钙液对骨组织免疫组化染色的影响
目的探讨三种脱钙液对骨组织免疫组化染色的影响。

方法选择12例骨组织，随机分为3组。

A组用14%硝酸脱钙液进行处理，B、C组分别用EDTA 脱钙液、PLANK脱钙液进行处理，同时对CD3、CD68、Ki—67 和TTF—1染色。

结果室温条件下，硝酸脱钙液的脱钙时间最短，但对组织损伤最大。

PLANK 脱钙液和EDTA脱钙液脱钙效果较好，组织结构完整，形态清晰，免疫组化染色较好。

结论室温条件下，三种脱钙液中PLANK脱钙液和EDTA脱钙液对骨组织脱钙及免疫组化染色效果较好。

但由于EDTA脱钙液脱钙时间过长，PLANK 脱钙液脱钙均匀，速度快，更适合用于临床病理检查。

硝酸脱钙液脱钙最快，但是免疫组化染色效果较差。

标签：脱钙液；骨组织；免疫组化染色
骨组织内含有大量无机钙盐，结缔组织坚硬，难以直接制片[1]。

如果强制切片，在蓝色钙盐背景下，往往无法看清细胞结构，所以需要选择一种能保持骨组织形态结构和染色后有利于保持细胞结构清晰度和对比度的脱钙液。

本文研究14%（体积分数）硝酸脱钙液、EDTA脱钙液、PLANK脱钙液对骨组织免疫组化染色的影响，以期寻找一种效果比较理想的脱钙液，对病理诊断工作提供帮助。

1 材料与方法
1.1 标本选择
12例骨组织标本均来源于我院，切成1 cm×1 cm×0.3 cm的骨块，在福尔马林中性液内固定24 h，用于脱钙及免疫组化染色实验。

1.2 三种脱钙液
①脱钙液Ⅰ：14%（体积分数）硝酸脱钙液，配制方法为14 mL浓硝酸加入
86 mL蒸馏水；②脱钙液Ⅱ：EDTA脱钙液，配制方法为EDTA10 g，蒸馏水100 mL，加NaOH充分搅拌溶解，在用10 mol/L的HCl调pH为8.0，最后加入4%甲醛15 mL。

③脱钙液Ⅲ：PLANK脱钙液，配制方法为氯化铝10 g，甲酸50 mL，10%福尔马林10 mL，冰乙酸1.5 mL，加蒸馏水至总体积100 mL。

1.3试剂和仪器
硝酸、盐酸、EDTA等化学试剂均购自广州化学试剂一厂，CD3、CD68、Ki—67和TTF—1等抗体购自福建迈新公司，EnVision二步法试剂盒购自DAKO 公司。

切片机、染色机和切片刀购自英国shandan公司。

1.4 方法
1.4.1 脱钙处理三组骨组织分别按以下方法进行脱钙处理：将12例骨组织标本平均分为A、B、C三组，并确定所选每份骨组织性质一样，分别将A、B、C组标本放入相对应的脱钙液中，间隔一定时间后更换脱钙液，以标本肉眼观察至半透明状，手感有弹性，大头针可顺利刺进骨组织，无砂粒感为脱钙完成，结合X射线确定脱钙终点。

接着进行石蜡切片、免疫组化染色。

1.4.2 免疫组化染色步骤骨组织固定、脱钙后，常规脱水、透明、浸蜡、包埋及制成4 μm厚的连续切片，裱片后进行70℃烤片1 h，脱蜡至乙醇溶液，3%（体积分数）甲醇—H2O2封闭内源性过氧化酶10 min，高压锅枸橼酸缓冲液法修复2 min，加入Ⅰ抗，37℃孵育1 h，加入EnVisionⅡ抗，再于37℃孵育30 min，DAB显色1 min，苏木精复染（图像分析所用的切片未染色），脱水，透片，封片，光镜观察。

1.4.3 免疫组化染色结果判定CD3阳性信号位于细胞膜、CD68阳性信号位于细胞浆、Ki—67和TTF—1阳性信号位于细胞核。

于光镜下观察三种脱钙液脱钙骨组织免疫组化标记的结果，未复染的切片做图像定量分析，其方法为：将每种抗体免疫组化染色后的切片放在显微镜下，在同一组的每张切片相同的部位观察10个视野（4种抗体×10=40个视野），被测物质的各种信息通过摄像机将所测目标转换成数字图像，传递到计算机系统，标定组织片空白处入射光的光密度值（OD值），在监视器上用不同的分割方法和编辑功能，计算免疫组化染色阳性细胞平均OD值，其值代表了切片中相应抗原性的相对强度。

1.5 统计学分析
图像分析结果以均数±标准差（x±s）表示，采用SPSS 13.0作方差分析。

2 结果
2.1 不同脱钙液对骨组织脱钙时间及效果比较
2.1.1脱钙时间14%硝酸脱钙液脱钙时间最短。

14%硝酸脱钙液<PLANK脱钙液<EDTA脱钙液（表1）。

2.1.2脱钙效果14%硝酸脱钙液脱钙效果最好。

14%硝酸脱钙液﹥PLANK 脱钙液﹥EDTA脱钙液（表1）。

2.1.3对组织损伤EDTA脱钙液对组织损伤最小。

EDTA脱钙液<PLANK 脱钙液<14%硝酸脱钙液。

见表1。

2.2 不同脱钙液脱钙对骨组织免疫组化染色结果比较
见表 2 。

三种脱钙液免疫组化染色图像结果用方差分析进行两两比较，其结果为硝酸脱钙液和PLANK、EDTA脱钙液比较有显著性差异，EDTA脱钙液和PLANK脱钙液比较无显著差异。

硝酸脱钙液对组织损伤较大，切片颜色欠鲜艳，细胞核着色弱，组织结构欠清晰。

PLANK和EDTA脱钙液脱钙效果较好，显微镜下观察组织结构完整、清晰，色泽鲜艳，对比度较好。

2.3 脱钙后免疫组化染色效果
见表2。

见图1～3。

3 讨论
脱钙是指用化学或物理方法将骨组织中的钙盐和胶原纤维分离，除去钙盐，获得完整的胶质纤维成分[2]。

骨组织含有大量的钙盐和无机盐，需经过脱钙处理，使组织软化后才能进行切片处理。

常用的脱钙剂主要包括单纯酸类、混合酸类、螯合剂等。

免疫组织化学对临床病理检查非常重要，因而应选择较好的脱钙液对所选骨组织标本进行较好的脱钙处理，且不破坏细胞和组织结构，形态清楚，进而确保免疫组化染色的效果较好并合适临床需要。

14%硝酸脱钙液是常用于临床脱钙液之一，具有脱钙能力最强、脱钙时间最短等优点。

但是，对骨组织脱钙程度较难把握，容易造成过度脱钙现象；同时脱钙后易出现组织肿胀及细胞结构不完整清晰的不良现象。

硝酸在脱钙过程产生CO2，气泡从组织中溢出将导致结缔组织分离。

另一方面，硝酸对组织进行脱钙时还酸化组织，造成细胞核着色能力下降而返蓝困难进而变成淡红色，对比度差，由于亚硝酸形成使组织变黄而影响其后的染色[3]，在室温条件下更明显。

硝酸在溶解骨组织钙盐时也对抗原物质具有破坏性，因而抗原免疫活性降低，免疫组化染色效果不佳[4]。

结合本实验验证硝酸脱钙液脱钙后较易影响其后的免疫组化染色效果。

EDTA是科研中常用的脱钙剂，能够与羟基磷灰石结晶的外层钙结合，同时促进内层结合钙向外转移，进而溶解钙盐，是脱钙和免疫组化染色理想的脱钙剂[5]。

本实验观察到EDTA脱钙液对骨组织脱钙效果较好，能保持完整的组织结
构，且不破坏抗原物质，免疫组化染色阳性细胞数量多、着色深、背景淡。

然而，在室温条件下，其脱钙时间过长，脱钙后组织稍微变硬，不太适合临床电镜快速诊断的要求，且其价格较贵，综合而言不利于临床检查工作。

目前认为，应用微波技术可促进EDTA的螯合作用，缩短脱钙时间[6]。

使用微波技术时应注意固定实验条件、调整微波功率和时间、温度也不能超过60℃等。

本研究表明，与硝酸、EDTA脱钙液比较，PLANK脱钙液具有常温脱钙时间较短、脱钙效果较好，免疫组化染色着色鲜艳、对比度佳、阳性细胞数多等优点。

PLANK脱钙液[7]是一种氯化铝、甲酸、甲醛和冰乙酸组成的混合脱钙液，其中甲酸和溶液中的铝离子对组织影响较小，免疫组化染色效果优良。

甲醛可加强对组织的固定并具有抗酸浸蚀的作用。

冰乙酸能较好保持染色体结构，并能减少酸对细胞核的破坏。

其配制成分中，通过增加甲酸的浓度并用冰乙酸辅助，可以加快脱钙速度。

常温下PLANK脱钙液快速软化组织，对组织抗原损伤较少，细胞结构清晰完整，加之其脱钙时间较短、配制简单、经济等有利条件，较适合用于临床检查工作[8]。

CD3、CD68、Ki—67和TTF—1等细胞因子多在肿瘤组织中表达，快速准确的病理诊断有利于患者的临床诊治。

因而，选择合适的脱钙液成为重要工作环节之一。

本实验通过比较14%硝酸脱钙液、EDTA脱钙液和PLANK脱钙液的脱钙和免疫组化染色效果，综合评价认为PLANK脱钙液较适合用于临床快速病理诊断。

[参考文献]
[1] 赵刚，杨海贤，白景文，等.不脱钙骨组织标本超薄切片的制作方法[J].临床与实验病理学杂志，2005，21（3）：36.
[2] 胥维勇，杨群.脱钙方法与脱钙液的选择及应用[J].中国组织化学与细胞化学杂志，2002，11（3）：263.
[3] 谢玲，邹丽宜，张志平，等.改良脱钙液制作脱钙骨石蜡切片与传统方法的比较[J].中国组织工程研究与临床康复，2008，12（11）：2125—2128.
[4] Weisberg EC，Hilburn M，Johnson B，et al. Intraoperative Microwave processing of bone margins during resection of head and neck cancer[J].，Arch Otolaryngol Head Neck Surg，2001，127（7）：790—793.
[5] 罗灿峤，莫木琼，钟觉民.不同的脱钙液在骨组织制片中的比较应用[J].中国实用医药，2011，6（19）：27—28.
[6] 刘大维，初同伟，张良，等.微波脱钙骨的免疫组化染色[J].第三军医大学学报，2003，25（1）：77—78.
[7] 陈世梁，卢志承，董玉英.介绍一种改良脱钙液在骨组织制片中的应用[J].临床与实验病理学杂志，2009，25（5）：557—558.
[8] 连丽琴，夏凌志，钟惠霞.三种脱钙液对骨组织脱钙后切片染色效果分析[J].武警医学，2008，19（10）：937—938.。