蛋白表达纯化试验步骤

1、取适当相应蛋白高表达的动物组织提total-RNA 。

2、设计蛋白表达引物。

引物要去除信号肽, 要加上适当的酶切位点和保护碱基。

3、R T-PCR,KO［酶扩增获取目的基因c DNA.
4、双酶切,将cDNA.克隆入PET28/32等表达载体。

5、转化到DH5z感受态细菌中扩增,提质粒。

6、将质粒转化入表达菌株, 挑菌检测并保种。

表达菌株如Bl21(DE3) 、Rosetta gami(DE3) 、Bl21 codon(DE3) 等。

7、蛋白的诱导表达。

1)将表达菌株在3ml LB培养基中摇至0。

=左右，加入IPTG,浓度梯度从25卩M
到1m 37度诱导过夜(一般3h以上即有大量表达)。

2)SDS-PAGE电泳检测目的蛋白的表达。

注：目的蛋白包涵体表达量一般会达到菌体
蛋白的50%以上,在胶上可以看到明显的粗大的条带。

3)将有表达的菌株10%甘油保种，保存1ml左右就足够了，并记录IPTG浓度范围。

甘油是用卩m过滤除菌的，储存浓度一般是30%-60%使用时自己计算用量。

4)用上述IPTG浓度范围的最低值诱导10ml表达菌,18度,低转速(140-180rpm), 诱导过夜作为包涵体检测样品。

注意:1.如果表达的蛋白对菌体有毒性，可以在加IPTG之前的培养基中加入1%的葡萄糖用来
抑制本底表达。

葡萄糖会随着细菌的繁殖消耗殆尽, 不会影响后面的表达。

2.
保种可以取一部分分成50卩l 一管，每次用一管，避免反复冻融。

8、包涵体检测。

方案见附件 2
1)取保种的表达菌株先摇10ml,37度,300rpm摇至OD>=约5h左右,视菌种
1、取适当相应蛋白高表达的动物组织提total-RNA 。

9、如有上清表达, 则扩大摇菌。

1)取保种的表达菌株先摇10ml,37度,300rpm摇至OD>=约5h左右,视菌种
的活性而异, 也可过夜摇菌。

2）将上一步中的8ml加入300ml培养基中37度,250rpm 摇至OD=左右（约
~3h）,然后加IPTG（浓度同包涵体检测中使用的浓度。

）注：菌液浓度要适当
的浓一些,否则第二天收集不到足够的菌体,因为低温低转速细菌生长非常缓慢。

拿起锥形瓶对光摇动, 看到有大量云雾状菌体即可。

另一方法是, 将手指放在瓶底晃动, 看不清手指为宜, 不过此法宜受气泡影响。

3）过夜摇菌，使用包涵体检测的温度（18。

左右）,转速140rpm左右。

4）将菌液6000rpm,4min,4度离心收集菌体。

加入20mM PBS洗一遍后用平衡缓
冲液重悬。

每250ml 菌液用30 ml 到50ml 平衡缓冲液,视菌液的浓度而定。

可用4支50ml 的离心管同时离心, 但是, 离心管要重复使用, 用完后洗净保存。

10、超声波裂解。

1）用6mm变幅杆，35%功率,工作,7s休息,50min即可。

注意：1. 要冰浴。

2.要随时观察裂解情况以防意外。

3.要将探头探入到溶液中下部,尽量不要打出大量气泡。

一般溶液量比较大的时候不会出现大量气泡。

4. 正常声音为：孜孜声, 尖锐刺耳的声音表明探头位置不对或者功率太大或者探头
松动等原因, 要及时调整。

溶液由浑浊变清透, 由粘稠变不粘稠表明裂解完成（后面3000转离心时，如果沉淀少说明裂解的好）。

5.超声波破碎仪工作30分min要休息5min（即关闭总电源开关）。

注意：1. 如果纯化的蛋白较易被蛋白酶降解,在超声裂解之前要加蛋白酶抑制剂（PMSF）,PMSF 工作浓度为1%。

2.如不能判断是否裂解完全,就按上述条件裂解
60 分钟,60 分钟足够裂解。

11 、取得上清
1）将破碎好的溶液收集到50ml 离心管中。

10000rpm,15min,4 °离心。

沉淀为包涵
体、细胞碎片和未破碎的细胞。

轻轻的将上清倒出,尽量不要倒出沉淀。

（此时可以测量一下pH值,pH值最好在左右。

平衡buffer的pH是左右，裂解后上清就会在左右。

） 12、纯化上清--- 摸洗脱条件。

1）镍柱处理。

将1ml 镍柱吸入空层析管中, 待其中的液体流完后加入平衡缓冲液3ml。

2）将10ml上清加到已经平衡过的NI柱上,并将过柱的样品重复上样3次。

（若是流
速慢可以在柱子下面加一个针头，或者用1ml的枪将胶体吹散。

）取20卩I过柱后的样品，以
备跑胶。

3）分别加20mM 40mM 60mM 80 mM的咪唑梯度来洗脱杂蛋白。

每个梯度分别
的上样量为4ml、2ml、2ml、2ml。

每个次上样的液体分前面1ml和后面1ml分别收集入EP
管中，以备跑胶。

注意：理论上是要将收集的溶液测量280nm处的吸光度，直到吸光度为零时再进行下一个梯
度的洗脱。

实际上测不到零，怎么都会有一点的，上面说的量已经做够洗脱了。

4）加Elution Buffer 将目的蛋白洗脱。

上样量为（将前面的单独接入EP
管,再将后面的4ml接入另外两个EP管）,留跑胶样品。

5）加MES将NI柱重生。

MES加10ml,流完后再加10ml Miliq H2O 。

流完后保存于2
倍体积的20%乙醇中，镍柱至少能重复利用6 次。

（尿素可能对NI 柱有损伤。

）注意：所有溶液使用前都要确定其pH是否正确,pH对挂柱及洗脱影响较大。

镍柱所用溶液MES勺ph=,其
余Equilibration Buffer pH= , 上清pH= ,Wash Buffer pH= ,Elution Buffer pH= 。

13、跑胶验证。

1）跑2块的PAGE交,把所有的样品都加上去，注意两块胶的浓分离比要相
同两块胶才会比较一致。

2）跑胶顺序：负对照、正对照、上清、过柱样品、W1、W2、W3、W4、W5、W6、
W7、W8、W9、E1、E2、MES
3）300V快速压胶5min左右,160V分离样品50min左右。

（也可以300V,30min,只是
图没有160V好看。

）
4）考马斯亮蓝染色。

一般染色2h 即可。

5）脱色。

先用脱色剂1 脱15min, 再用脱色剂2脱过夜。

14、纯化上清--- 收集目的蛋白
1）将重生的镍柱再次平衡（即加Equilibration Buffer 3ml）。

2）重复步骤12中的操作，只是wash时只用步骤12中摸好的咪唑浓度洗。

15、跑胶验证。

同步骤13 这次胶图要跑的漂亮一点（用160V）, 保存好。

16、透析。

1）配制2L透析液（配方见附件1）,并放于-20度冰箱预冷但不要结冰。

2）透析袋（剪10cm即可）用透析袋处理液煮沸10min,用MILIQ H20充分洗净。

3）用透析夹将透析袋夹住（将透析袋折叠一下会夹的更牢）, 将洗脱的蛋白样品加入其
中，置入提前预冷的500ml透析液（20mM PBS+50 mM NaCI）中。

冰浴下轻微磁力搅拌20min 后置入4°冰箱后换液。

透析3 次即可。

注意：用广口瓶装透析液，将广口瓶置于装有冰的2L大烧杯中。

冰浴以防活性降低。

17、浓缩。

1）将透析好的样品连同透析袋一起放在白色盒子中,用预冷的聚乙二醇2000固体包埋。

2）30min 后将吸水后呈浆糊状的聚乙二醇去除, 加入新的固体聚乙二醇。

3）每隔10min观察一次，一旦出现浑浊立即停止浓缩。

4）透析袋用完后, 洗净, 保存于20%乙醇中4°存放。

注意：浓缩过度后会有白色小颗粒或絮状晶体出现，由于透析袋使溶液成薄层状，透明度较高不易发现小颗粒或絮状沉淀，要看仔细。

如果看不到，可根据自己估计的蛋白量留1-2ml 体积。

用透析液将透析袋表面的聚乙二醇洗掉，吸取其中的溶液分装后-20 度保存。

18、超滤法浓缩、透析蛋白。

使用超滤法就可省去16、17 两步。

1）将4ml Elution 得到的蛋白溶液加入超滤管中。

2）配平。

3）7400g,30min,4 。

离心，结束时4ml变为1ml左右。

浓缩4倍。

可根据需要选择不同的离心时间，以达到不同的浓缩倍数。

可以几次的Elution 液一起浓缩。

4）加入需要的蛋白储存液至4ml, 离心。

重复操作可以使Elution 液逐渐换为所需的蛋
白储存液。

蛋白储存液一般用20mM PBS+*mM NaO或适当浓度和pH的tris-HCI 溶液。

如果蛋白有沉淀达不
到预定浓度可以添加适当的甘油（1%-5%即可）助溶。

5）收集。

将溶液从超滤管中收集到EP管中,标记好储存液的成分，蛋白名称，蛋白
浓度（测量后）, 制备日期。

注: 超滤管的使用方法见附件 4
19、蛋白浓度测定。

见附件 3
20、蛋白活性测试。

转染细胞测量荧光。

21、抗原处理。

蛋白与弗氏佐剂混合成油包水状。

22、注射兔子。

选择合适的注射方式和合适的免疫程序。

23、收集免疫血清。

提取抗体。

24、抗体效价评定。

附件1
所需溶液配方:
1）20 mM PBS: 20 mM sodium phosphate, 300 mM NaCI pH
试剂名称NaH2PO4-2H2O Na2HPO4-12H2O NaCI
用量（g）1L
2）EquiIibration Buffer（平衡缓冲液）: PBS with 10 mM 咪唑pH
3）Wash Buffer（清洗缓冲液）: PBS with 25 mM/50 mM/75 mM 咪唑pH
4）EIution Buffer（洗脱缓冲液）: PBS with 250 mM 咪唑pH
5）MES（再生缓冲液）:20 mM 2-（N-morpholine）-ethanesulfonic acid, M sodium chIoride; pH 。

即MES+
NaCI.
6)透析袋处理液: 2%(w/v) 碳酸氢钠和1 mmol/L EDTA 7)透析液:20mM PBS+50 mM NaCl
试剂名称NaH2PO4-2H2O Na2HPO4-12H2O NaCl
用量(g)1L
TIPS:1 —4的溶液可以一起配制。

先配10ml 8M的咪唑。

再配1L的PBS用500ml水将
试剂溶解,取两个50ml 和一个150ml 分别加到两个100ml 瓶子和一个500ml 瓶子中,作为Wash Buffer 、Elution Buffer 和Equilibration Buffer, 再向其分别加入适当体积的8M 咪唑。

最后, 定容。

Wash Buffer 、Elution Buffer 各配了100ml,Equilibration Buffer 配了300ml。

PBS配了500ml。

附件2
包涵体检测
1.摇10ml菌，加％葡萄糖和相应抗性。

培养至0D600后离心加入新的培养基和相
应浓度的IPTG低温(16-25度)诱导过夜(也可不离心，在原来LB中直接加IPTG)。

在离心前取500卩l菌液作为负对照，诱导完成后取500微升作为正对照。

正负对照不用超声波裂解，直接煮沸10min 跑胶。

2.诱导完成后，用2ml EP管6000rpm,2min,4 度，收集10ml菌液。

PBS (50m M
PBS，300m M NaCl ) 重悬细菌。

3.裂解细胞。

用超声波破碎细胞直到悬液变清亮，一般15到30min。

裂解3s,停止6s,
裂解时冰上放置。

4.分离上清。

5000rpm，4min，4 °除去未裂解的细菌和大的细菌碎片。

然后，10000rpm，
10min,4度。

取上清于新的管中。

取其中的20微升于200微的EP管中，加5*SDS loading
buffer 混匀，煮沸10min。

5.重悬包涵体。

用1000震荡重悬包涵体，取20微于200微的EP管中加5微
5*SDSloading buffer，煮沸10min。

6.正负对照的收集。

离心收集正负对照菌体，上清留下40卩l,加入10卩l5*SDSIoading buffer, 煮沸10min 裂解。

7.跑聚丙烯酰胺凝胶。

将正负对照及实验样品一起跑胶。

一般顺序是: -,+, 上清, 包涵体. 附件3
蛋白浓度定量测试方案
1. 将染色剂稀释。

稀释5倍,取4ml染色剂于50ml离心管中,加16ml miliq H2O.充分溶解后用卩m的滤膜过
滤于另50ml离心管中。

（此剂量可测4个样品。

）
2.牛血清白蛋白（BSA）标准品的制备
1）将冻干的BSA溶于去离子水中，溶解成浓度为1mg/ml,分装为400-500卩1/支（可以
室温放置60天,-20 度长期保存）。

2）将1mg/ml的BSA分别稀释成、、、ml,各180卩l,另外加一管水为
3.染色。

1）取已过滤的染色剂分别加入13支（其中4支为待测样品）管中。

4个
梯度各做一个重复，共8支,另外加1个样品（或1+n个样品）和1个blank,共10支EP管（或10+n 支）, 分别对应标记。

2）将30卩l样品和30卩l标准BSA及30卩l H2O分别加入上述EP管中。

涡旋混匀。

3）室温孵育5min 到60min 。

5min 后即开始测量, 在60min 内测完, 越快越好, 因为Absorbance wil increase over time 。

4.吸光度的测量。

600nm处测量，并记录吸光度。

注意:1. blank 是染色液加30微升的水。

2. 从低浓度测量到高浓度。

根据混合液的颜色大致判断sample 的浓度范围, 据此决定sample 的测量顺序。

5.比色皿的洗涤。

用100%乙醇浸泡洗涤。

6.标准曲线的制作。

利用excel 工具取标准品的平均值制作线性回归标准曲线。

附件4.
4ml millipore 超滤离心管使用注意事项
1. 用前用miliq 水润湿。

度预冷。

3.离心力不能超过7500g。

加速度设定为8.
4.离心时将离心管的两膜片竖直到与地面垂直的角度后开始离心, 以使两膜所受的压力一
致。

5.使用完毕后,用miliq水洗净，加入1ml NaOH泡24h,后加入1ml20%乙醇保存。

如果要短期保存几天, 也可加水浸泡。

附件5
聚丙烯酰胺凝胶的制备及使用方法
附件6.
包涵体蛋白的提纯
与提上清中所用试剂不同之处:在Equilibration Buffer 、Wash Buffer 、Elution Buffer
中各加了6M 尿素或盐酸胍。

尿素或盐酸胍用来溶解包涵体蛋白。

在裂解完后, 离心时先3000rpm3min去除未裂解的细胞和大的碎片，再10000rpm15min离心,沉淀就是包涵体。

用加了6M尿素或盐酸瓜的Equilibration Buffer 溶解包涵体。

后面的步骤跟提上清蛋白一致，只是所用Equilibration Buffer 、Wash Buffer、Elution Buffer 中都含有6M尿素或盐酸胍。

另外盐酸胍会与SDS结合形成沉淀，影响跑胶。

这里采用乙醇沉淀法来除去盐酸胍后跑胶。

如果要做包涵体, 建议用尿素做, 因为盐酸胍的毒性较大, 必须除去, 除去后蛋白可能就析出了。

尿素毒性相对较小, 可以不用除去。

这样可以省去很多麻烦。

尿素对包涵体的溶解性不如盐酸胍好，较难溶解，可以用超声波破碎仪帮助溶解:6mm变幅杆,15%功率，3s/6s,10min
左右即可。

也可以加上1%---5%的甘油助溶。

甘油是加在Equilibration Buffer 中的。

另外，做包涵体可以直接37度快速摇菌，无需低温，加IPTG的时间可以提前到0。

=左右。

乙醇法淀蛋白跑SDS-PAGE 1、管中加150卩l蛋白溶液和1350 l 100%乙醇，乙醇要-20度预冷，涡旋。

见蛋白沉淀。

3、向管中加30卩I *SDS-loading buffer 。

（这里蛋白溶液已经浓缩了5倍）。

4、上样, 跑胶。

如有错误, 敬请批评指正。

血清的提取
动物血采集后,室温自然凝固后立即4500g,10min 离心,分离出血清。

抗血清保存有三种方法:
第一种是4 C保存，通常可保存3个月~半年，效价高时可保存一年左右；第二种是-20 C
2、-20度放置10min。

4度,15000rpm,10min,小心弃去上清,尽量去干净。

此时管底可~-40 C低温保存，可保存5年左右，但需防止反复冻融；
第三种是真空冰冻干燥保存, 可保存5~10年。

注: 耳缘静脉采血, 为防止溶血请勿吸取流到外面的血, 直接从静脉吸取的血液不会溶血。