His-Tag蛋白纯化步骤
[应用]His-GFP蛋白的纯化步骤
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以His-GFP为例简述His-tag蛋白的纯化His-tag是重组蛋白中最常用的融合标签之一。
使用镍柱纯化His-tag融合蛋白的原理为：组氨酸的咪唑侧链可亲和结合镍、锌和钴等金属离子，在中性和弱碱性条件下带组氨酸标签的目的蛋白与镍柱结合，在低pH下用咪唑竞争洗脱。
实验中一般选用6个组氨酸（His6-tag）的标签。
His6标签有许多优点：（1）由于只有6个氨基酸，分子量很小，对蛋白结构和活性的影响较小，一般不需要酶切去除；（2）可以在变性条件下纯化蛋白，在高浓度的尿素和胍中仍能保持结合力；（3）His6标签无免疫原性，重组蛋白可直接用来注射动物，也不影响免疫学分析。
His6标签也有一些不足，如目的蛋白易形成包涵体、难以溶解、稳定性差及错误折叠等。
镍柱纯化时金属镍离子容易脱落，混入蛋白溶液，不但会通过氧化破坏目的蛋白的氨基酸侧链，而且柱子也会非特异吸附蛋白质，影响纯化效果。
本实验将以His-GFP（绿色荧光蛋白）为例，阐述His-tag蛋白的纯化过程。
1. E. coli重组菌体破碎表达完成的E. coli重组菌体，经超声或细胞破碎仪进行破碎。
当需要破碎的细胞沉淀较少（＜ 1 g）时，通常在Eppendorf管中，用超声法完成细胞裂解。
而当细胞沉淀较多时，可选用细胞破碎仪进行破碎。
本实验采用细胞破碎仪法。
细胞破碎仪法：称量细胞沉淀的湿重，加入细胞湿重10倍体积的裂解缓冲液。
如，1 g细胞沉淀加入约10 ml的裂解缓冲液，使得细胞在溶液中的终浓度为10-15%，在此范围内细胞破碎的效果较好。
过浓或过稀的细胞浓度均不利于破碎效率。
裂解缓冲液的组成如下：Lysis buffer：20 mM Tris-HCl, pH 7.4100 mM NaCl10 mM imidazole0.1% Triton X-1001 × protease inhibitor将细胞沉淀在裂解buffer中充分搅拌至没有结块后，进行高压破碎。
His-Tag蛋白纯化步骤
变性条件下从大肠杆菌中纯化多聚组氨酸标签蛋白（主要以包涵体的形式表达）的样品制备1、用1× PBS重悬细胞沉淀（约每毫升沉淀加5ml 1× PBS），并按上述方法进行超声破菌。
2、12000 rpm离心10 min收集包涵体。
若有必要，用1 × PBS洗包涵体几次。
3、用Binding/Wash Buffer（约每毫升沉淀加5ml 1× PBS）溶解包涵体，并在室温下孵育30～60分钟。
若使沉淀充分溶解，有必要进行机械或超声均质。
4、12000rpm离心30min，取上清至一干净管中。
His标签蛋白的重力纯化流程1ml柱子的总体积为10ml，只需加入介质。
如果样品体积大于柱子体积，可重复利用，注意不要超过树脂的结合能力。
1、平衡柱子的工作温度。
应在室温或4℃下进行纯化。
2、取出底帽，倒出多余的液体，直立固定好柱子，让柱子顶部朝上。
3、用2倍树脂体积的Binding/Wash Buffer平衡柱子，以0.5～1 ml/min的流速过柱。
4、从柱子上部加入经Binding/Wash Buffer处理的大肠杆菌裂解物或蛋白提取物，收集流出液。
若需要，让流出液重新过柱一次，以最大限度地提高结合力。
5、用两倍树脂体积的Binding/Wash Buffer洗涤树脂并收集流出液。
重复该步骤，用一新的收集管收集流出液。
直到流出液的吸光度在280 nm基线处。
6、用两倍树脂体积的Elution Buffer将His标签蛋白从树脂上洗脱下来。
重复此步骤两次，并单独收集每次洗脱出来的液体。
7、用Modified Coomassie Bradford Assay Kit（No SK3041）。
洗脱的蛋白可直接进行SDS-PAGE分析。
注意：洗脱获得的蛋白可用凝胶过滤（如No BSP090 gravity Desalting Column）或透析去除咪唑以便后续应用。
SDS-PAGE分析前，含6M盐酸胍的样品必须用含8 M尿素的缓冲液透析。
His蛋白纯化原理、方法和问题分析
组氨酸(His)标签蛋白的纯化His-Tag融合蛋白是目前最常见的表达方式，而且很成熟，它的优点是表达方便而且基本不影响蛋白的活性，无论是表达的蛋白是可溶性的或者包涵体都可以用固定金属离子亲和色谱（IMAC）纯化。
IMAC(Immobilized Metal-ion affinity chromatography)是Porath et al.1975年用固定IDA作为配基的填料螯合过渡金属铜、镍、钴或锌离子，可以吸附纯化表面带组氨酸、色氨酸或半胱氨酸残基的蛋白，1987年Smith et al. 发现带有几个组氨酸或色氨酸小肽和螯合金属离子的IDA-sephadex G-25作用力更强，此前在1986年他和他的合作者用Ni2+-IDA-sephadex G-25亲和纯化在氨基端带组氨酸和色氨酸的胰岛素原。
同年1987年Hochuli et al.发现带有相连组氨酸的多肽和Ni2+-NTA填料作用力更强于普通的肽，1988年他第一次用这样的方法纯化了带六个组氨酸标签的多肽，无论是在天然还是变性条件下一次亲和纯化都得到很好效果，此后表达带六个组氨酸标签的蛋白配合IMAC变得非常普遍，相对而言，不带标签的蛋白纯化就非常困难，所以表达带六个组氨酸标签的蛋白配合IMAC纯化变成最常用而且最有效的研究蛋白结构和功能的有力手段。
1986年Porath et al.还发现Fe3+-IDA-sephadex G-25可以用于磷酸化蛋白的纯化，而后发现Ga3+-IDA也有同样的效果，这样螯合这两种金属离子的填料就有效用于磷酸化多肽的富集和纯化，同时IMAC也可以用于纯化各种和金属离子结合的多肽，应用非常广泛。
Ni柱中的氯化镍可以与有HIs（组蛋白）标签的蛋白结合，也可以与咪唑结合。
步骤是：过柱子前可以选择Ni柱重生，也就是往柱子里倒氯化镍，一个柱长体积就行了，然后平衡柱子，拿你自己的buffer，给蛋白提供最适的环境，我一般平衡4个柱长，然后蛋白上样，你可以让他自己挂，这样挂柱子的效果好一些，如果流速太慢，可以加个恒流泵，但是一定不能太快，太快挂柱效果差，当然你也可以选择循环挂柱，就是恒流泵的一头接你装蛋白的烧杯，从柱子中留下来的液体还用同一个烧杯接回去。
HisTag_融合蛋白纯化(默克新版)
默克生命科学服务热线：400 820 8872 bioteam@
高纯度包涵体的制备 以下操作可用于任何 BugBuster®系列产品抽提的包涵体纯化。 1. 如可溶蛋白抽提步骤1-4进行操作。 2. 将步骤“4”所得到的沉淀重悬于BugBuster（货号70584），BugBuster的量与当初重悬细胞糊的体积相同。
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一、亲和纯化样品的前处理
1. 菌液体积-起始目的蛋白量
纯化条件的优化需考虑多个因素，包括 His·Tag 融合蛋白表达水平和上样量。若目的蛋白未能高效表达，需要采 用一个较高的浓缩系数（concentration factor）进行菌的裂解，即在较大培养体系中，按一定比例加入一定体积 的裂解/结合缓冲液。浓缩系数定义为菌液体积与裂解/结合缓冲液体积之比。不同目的蛋白表达水平推荐使用的 裂解/结合缓冲液体积、对应的浓缩系数大小，请参考表 1。 例如，某蛋白表达水平约为 0.1mg/ml，需要在变性条件下进行小批提纯，则 100ml 的培养物离心获得的菌体， 按浓缩 100 倍比例重悬于含变性剂的 1ml 裂解/结合缓冲液中。 在非变性条件下进行纯化时，要准确预计裂解液中可溶蛋白的含量比较困难，一般建议采用 50-100 倍浓缩。
产品使用说明书
His·Tag 融合蛋白纯化操作手册
采用 pET 系统进行原核蛋白表达，蛋白的表达量达到 20mg/100ml 培养物并不是困难的事。 在大肠杆菌中表达的目的蛋白，其可溶性（可溶蛋白或包涵体）、细胞定位（细胞质、细胞周 质、培养基上清），都会对后续的纯化策略造成影响。我们建议研究者在蛋白表达后，首先进 行目的蛋白的细胞定位（请参考 pET 系统操作手册）；在进行大量纯化之前，小量纯化蛋 白，摸索确定适合于具体蛋白的纯化条件，也是值得推荐的好方法。外源蛋白在大肠杆菌中表 达，可能以可溶形式存在，也可能以包涵体形式存在。尤其在高水平表达的条件下，更容易形 成包涵体。包涵体的形成与外源蛋白本身性质、载体、宿主菌、以及表达水平都有关系，可以 通过选择不同表达载体和 E.coli 宿主菌组合，摸索生长条件和适宜诱导条件，达到优化蛋白表 达的目的。His·Tag®融合蛋白，可以在天然条件或变性条件下用 NTA His·Bind 树脂或 IDA His·Bind 树脂进行纯化。
His·Tag_融合蛋白纯化操作手册
可溶蛋白的制备 稀释 8×储液制成 1×结合缓冲液，或按照缓冲液成分列表自己配制（参考 Novagen 目录或树脂英文说明书）。 1. 10,000g 离心 10 分钟收集菌体。弃上清，尽量去除培养基。按每 100mI 培养基所得菌体加入 4ml (1:25 v/v)
缓冲液，重悬于冰浴预冷的 1×结合缓冲液或 1×Fractogel 结合缓冲液中。也可加入 NP-40 或其他非离子型 去污剂至终浓度 0.1％，以减少非特异性结合。若细菌菌体重悬困难，可使用匀浆器、搅拌器或超声仪帮助打 散菌体。 2. 将重悬菌液置于合适大小的容器中，超声破碎。超声过程中保持菌液处于冰浴或盐冰浴中。超声条件依赖于 所使用的超声仪功率、探头种类、容器的大小形状，须实验者自己摸索。应避免连续超声导致的大量产热， 可分成短时间、多次超声。通过一定的间隔时间避免溶液过热。若 DNA 未能被超声剪切，裂解液会十分粘 稠，可能阻塞色谱柱，降低流速，影响后续的纯化过程。大量的菌体可选用弗氏压碎法(French Press)。 可选做： （1）细胞悬液中加入 rLysozyme 溶液（货号 71110）至终浓度 45-60KU/g 菌体。上下吹打混匀。30℃孵育 15 分钟，再进行超声破碎。 （2）每 1ml 裂解液加入 1µI(25u) Benzonase 核酸酶（货号 70746 或 70664）用于重悬菌体。若需在无核酸酶条 件下操作，不建议使用 Benzonase。蛋白纯化过程可能无法完全除去 Benzonase 核酸酶。 注意：也可选用 LysonaseTM Bioprocessing Reagent(货号 71230)，此试剂为 rLysozyme 和 Benzonase 核酸酶 的混含物，可直接用于细菌裂解。每 1ml 裂解液加入 3µI 本试剂．即可实现高效裂解。 （3）加入蛋白酶抑制剂。蛋白酶抑制剂与 BugBuster 和 Benzonase 核酸酶兼容，可同时使用。如果目的蛋白后 续要用凝血酶（货号 69671），Xa 因子（货号 69036）或重组肠激酶（货号 69066）处理，就应该避免使用丝 氨酸蛋白酶抑制剂。尽管纯化过程可能去除活性抑制剂，建议在酶切前最好做透析或凝胶过滤。 3. 裂解物 14,000g 离心 20 分钟除去细胞碎片。离心后上清经 0.45um 滤膜过滤，防止上样后阻塞树脂(此步操 作使用注射器式滤器更方便)。 包涵体的制备 使用 1×结合缓冲液从大肠杆菌中分离、洗涤包涵体，除去杂质蛋白，再用含 6M 盐酸胍或 6M 尿素的 1×结合缓 冲液溶解包涵体。 1. 10,000g 离心 10 分钟收集菌体。弃上清，尽量去除培养基。按每 100mI 培养基所得菌体加入 40mI 1×结合 缓冲液比例重悬菌体。此步骤不加变性剂。 2. 按前述方法进行超声，重悬菌液，剪切降解核酸。 3. 5,000g 离心 15 分钟，包涵体和细胞碎片位于沉淀中。其他可溶蛋白部分位于上清中。 4. 移去上清，每 100ml 培养物的沉淀重悬于 20ml 1×结合缓冲液，重复第 3 步。可能需要超声以彻底重悬沉 淀。 注意： 本步操作可加入 rLysozymeTM 溶液（非必要）帮助处理包涵体。已证实溶菌酶可消化细胞壁，提高包涵体 纯度。将 rLysozyme 加入 1×结合缓冲液至终浓度 1KU/ml，轻柔混匀，孵育 5-10 分钟即可离心。 5. 移去上清，按每 100ml 培养物加 5mI 缓冲液比例，加入含 6 M 盐酸胍或 6 M 尿素的 1×结合缓冲液重悬沉 淀。 6. 冰浴孵育 1 小时，彻底溶解包涵体。16,000g 离心 30 分钟去除不溶成分，His·Bind 纯化之前用 0.45um 滤膜 过滤上清。
His-Tag可溶性蛋白纯化方法
可溶性蛋白VP60-N的纯化方法一、Ni2+琼脂糖吸附树脂处理：1.打开柱帽使酒精溶液完全流出；2.加入8ml灭菌水重悬树脂（缓慢颠倒纯化柱），4℃平放5分钟；3.沉淀树脂（垂直静置5~10min）,流出洗液，重复洗3次；4.加6ml binding buffer 重悬树脂；5.沉淀树脂（同3），流出洗液；6.重复步骤4、5共3次。
二、细菌细胞裂解：在菌泥中加入30ml 1×纯化buffer和500ul溶菌酶（10mg/ml）反复冻融4次（每次冻融各30min）;离心（11000rpm,30min）收集上清液到新管子准备纯化并取10ul（或更多）-20℃保存（for SDS-PAGE analysis）。
（在细胞裂解时可以进行步骤一，同时处理透析袋：将透析袋用50%酒精进行煮沸处理10min,之后用水将其洗净，最后用超纯水将透析袋里面冲洗5次，外面冲洗3次，放入超纯水中备用。
透析袋用完后用自来水冲洗干净，在用超纯水如上冲洗后放入50%酒精中室温保存。
）三、蛋白纯化：（整个过程都在4℃进行）1.在纯化柱中加入10ml上述获得的细胞裂解液，重悬树脂（同上），4℃平放2h,揭开上下两个帽子，收集流出物，待柱内液体流尽后再加入10ml裂解液（处理同前，直至加完裂解液），将收集的流出液再过同一根柱子三遍，并取流出物10ul(或更多)-20℃保存（for SDS-PAGE analysis）;2.加入8ml wash buffer 重悬树脂，静置平放在4℃5min,打开帽子使流尽洗液，同时收集10ul（或更多）流出物（for SDS-PAGE analysis）;3.重复步骤2 3~4次；4.在纯化柱内加入5ml Elution buffer,打开帽子，收集流出物并取10ul(或更多)-20℃保存（for SDS-PAGE analysis）;5.将步骤4收集的流出物装入透析袋在4℃PBS(pH7.4)溶液中透析过夜，收集透析后溶液(-20℃保存)同时取10ul(或更多)-20℃保存（for SDS-PAGE analysis）；6.在进行步骤5时进行纯化柱保存处理：向柱内加入0.5M NaOH 8ml重悬树脂，静置平放在4℃30min后使流出，用灭菌水重悬树脂3次（4℃），加入25%酒精水溶液，4℃保存。
融合his-tag蛋白质纯化步骤(英文翻译)
一：在自然条件下从大肠杆菌纯化带组氨酸的蛋白质1.推荐培养的大肠杆菌的体积：这是根据表达系统和组氨酸标记的蛋白质的性质来决定的。
Midi型号的养25-150mL的大肠杆菌。
2.收集菌的细胞：注：菌体不用的时候需要保存在-800C。
a.将过夜培养的细菌离心（6000g，40C，15min），然后小心的除掉上清。
b.制备1X LEW Buffer 和1X Elution Buffer。
3.悬浮细胞体：这步在冰上进行用1X LEW Buffer将上步离心过后的菌体吹悬，一般来说每150mL菌液加3mL的1X LEW Buffer（每湿重1g的菌体加5mL的1X LEW Buffer）。
如果菌体冻住，则需要在冰上用1X LEW Buffer将其溶解,溶解后转入15 ml的离心管中，便于进行超声裂解。
4.使裂解物澄清a.将溶菌酶添加到上面得到的溶液中（1mL的LEW混合液+20uL的50mg/mL的溶菌酶）。
然后将它放置在冰上30mins，可能的话中间偶尔混合一下。
b.超声裂解：工作2s，间歇2s，如此循环180次，总共18mins。
注：超声在冰浴上进行。
如果得到的溶液有粘着，可加入DNase1。
c.离心（13000rmp，40C，15mins），收集上清。
注：如果上清不是澄清的，进行第二次离心，是为了防止没有溶解的菌体堵塞柱子。
5.平衡PrepEase® Ni-NTA Columna.将柱子放在合适的离心管中，最好是15mL的离心管。
可以将15ml离心管插到冰上。
将柱子放到带圆孔的纸片中，放入15ml离心管中b.用2mL的1X LEW Buffer平衡柱子。
允许柱子在重力的作用下排干。
6.将样品结合到PrepEase® Ni-NTA Column将步骤4c得到的上清加到柱子里，并允许柱子在重力的作用下排干。
7.洗柱子:用1X LEW Buffer洗柱子，洗两次，每次用2mL的1X LEW Buffer。
His标签蛋白纯化实验步骤
His标签蛋白纯化实验通过实验，学习和了解 His-Tag 融合蛋白的表达、纯化原理和方法，掌握相关仪器设备的操作使用。
一、实验原理金属螯合离子亲和色谱（IMAC）是常见的亲和纯化方案之一，主要利用介质配体螯合的金属离子吸附纯化表面带组氨酸、色氨酸或半胱氨酸残基的蛋白。
His-tag 融合蛋白是目前最常见的表达方式，而且很成熟，它的优点是表达方便而且基本不影响蛋白的活性。
Ni IDA Beads 可以用于各种表达来源（如大肠杆菌、酵母、昆虫细胞和哺乳动物细胞）的组氨酸标签（6xHis-tagged）蛋白的纯化。
它是以 4%琼脂糖凝胶为基质，通过化学方法偶联了三配位的亚氨基二乙酸（IDA），螯合镍离子（Ni ）后，可以形成比较稳定的平面四边形结构，从而有更多的位点与组氨酸标签上的咪唑环继续配位，达到结合目的蛋白的效果（产品化学结构见图 1.1 所示）。
二、实验准备试剂菌种、LB 培养基、氨卞青霉素、异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)、His-Tag 蛋白纯化试剂盒实验仪器和设备移液器、恒温振荡箱、超声破碎仪、离心机、紫外检测仪、冰箱三、实验步骤第一步、菌体制备1、取 2 支 4ml LB 培养基试管，超净台中操作。
每管加入 4ul 菌种，4ul 氨卞青霉素。
放入 37 度恒温振荡箱 180rpm，过夜培养，16 小时。
2、将菌种加入 800ml LB 培养基，800ul 氨卞青霉素，放入 37 度恒温振荡箱 180rpm培养 4 小时，OD600 约 0.6-0.8。
3、加入 IPTG 800ul，放入 37 度恒温振荡箱 180rpm 培养 4 小时。
4、离心 8000rpm 离心 10min 收集菌体，-80 度保存菌体。
第二步、菌体破碎1、将菌体取出，加入 50ml Lysis Buffer 磁力搅拌悬浮，待无明显块状即可。
2、超声 4s 停 6s，36°保护温度，超声 30min。
3、将破碎好的裂解液离心取上清（11000rpm ,20min ,4℃），准备上样。
His·Tag_融合蛋白纯化操作手册
50ml培养液采用2.5ml抽提试剂。如果是小规模培养，则采用约1/5培养体积的抽提试剂重悬沉淀（例如， 1.5ml培养液采用300µl抽提试剂）。如果抽提试剂过量也没有什么副作用。 选做：加蛋白酶抑制剂。BugBuster Master Mix与蛋白酶抑制剂兼容。如果目的蛋白后续要用凝血酶（货号 69671），Xa因子（货号69036）或重组肠激酶（货号69066）处理，就应该避免使用丝氨酸蛋白酶抑制剂。尽 管纯化过程可能去除活性抑制剂，建议在酶切前最好做透析或凝胶过滤。 3. 室温下将重悬的细胞液在摇板或低速搅拌器上孵育10-20分钟。 注意：孵育后获得的抽提物不是粘稠的。 4. 4℃下16,000g离心20分钟以去除不溶的细胞碎片。如果需要，沉淀可以留作“包涵体纯化”（见以下说明） 的材料。 5. 将上清转入另一个新试管。这样抽提得到的可溶蛋白溶液可以直接上样于Novagen的纯化树脂（以及其它很 多类似纯化系统）。蛋白溶液在冰上可以短时存放（2-3小时），也可在-20℃长时间存放直至下步分析。蛋 白抽提液应该根据目的蛋白的活性要求的温度存放，有些蛋白经冻融会失活。
25µg
50×
0.1mg/ L
0.8%
100ml
10g
100×
天然条件
>1mg/ L
>1%
50ml
>50g
50×
<1mg/ L
<1%
100ml
<100g
100×
与其它亲和纯化介质一样，His·Bind 树脂在接近其结合载量时使用，可以获得最好蛋白分离效果。所以在蛋白纯化前估计细菌 抽提物中目的蛋白的含量，有利于确定上样量、选择合适体积的亲和树脂或预装柱。SDS-PAGE，Western blot，S·TagTM Rapid Assay，FRETWorksTM S·Tag Assay 等方法都可用于确定抽提物中目的蛋白的含量。
His标签蛋白纯化全攻略
His标签蛋白纯化全攻略作为重组蛋白构建过程中最常用的标签，相信奋战在实验室中的小伙伴对His标签并不陌生。
His标签可通过Ni2+柱进行简单有效的纯化，不过纯化容易想要纯化好却并不那么容易。
爱纯派助力His标签纯化，马上为大家送上His标签纯化全攻略。
His标签蛋白的纯化原理组氨酸（His）的残基上带有1个咪唑基团，可以和Ni2+、Co2+等过渡金属离子形成配位键而选择性的结合在金属离子上，这些金属离子能够用鳌合配体固定在层析介质上，因此带有组氨酸标签的蛋白在经过装配了金属离子的层析介质时可以选择性的结合在介质上，而其他的杂质蛋白则不能结合或仅能微弱结合。
结合在介质上的His标签蛋白可以通过提高缓冲液中的咪唑浓度进行竞争性洗脱，从而得到较高纯度的His标签蛋白。
His标签蛋白纯化说起来简单做起来难。
小编也常常收到小伙伴们类似于“His标签重组蛋白Ni2+柱纯化后纯度不够”、“His标签蛋白挂不到Ni2+柱上”等等之类的抱怨。
其实呢，不怕做不到，就怕没想到。
His标签蛋白纯化是有很大的优化空间哦~His标签纯化优化策略His标签蛋白纯化的所有优化策略都是基于改变标签蛋白和金属离子之间配位结合作用力的强弱，而这种作用力主要和一下因素相关：1） 标签长度及暴露程度：最常用的His标签时6个重复的组氨酸，但在实际操作过程中，根据实际情况可控制组氨酸的数目从四到十个不等。
较短的标签与金属离子的结合更弱，较长的标签与金属离子的结合更强；而标签的暴露程度也很容易理解，金属离子只能和蛋白表面的His结合，所以His标签暴露程度越高，结合能力越强。
2） 金属离子半径：除最常用的Ni2+以外，但 Cu2+、Zn2+、Co2+等金属离子都可用于标签蛋白的纯化，不同金属离子区别在于离子半径不同，离子半径越小，离子半径越小，与与His His标签蛋白的纯化，不同金属离子区别在于离子半径不同，离子半径越小，的结合能力也就越强。
histag蛋白纯化步骤
histag蛋白纯化步骤
His-tag 蛋白纯化是一种常用的蛋白质纯化方法，其基本步骤如下：
1. 表达和收集：通过基因工程技术在目标蛋白的 N 端或 C 端添加 His-tag 序列，并在适合的宿主细胞中表达目标蛋白。
收集表达后的细胞或细胞培养上清液。
2. 破碎细胞：使用适当的方法破碎表达细胞，以释放出目标蛋白。
3. 离心和过滤：对破碎后的细胞裂解液进行离心，去除细胞碎片和不溶性物质。
然后，通过过滤去除残留的固体杂质。
4. 结合：将离心和过滤后的上清液与含有镍离子的亲和层析树脂混合，使 His-tag 与树脂上的镍离子结合。
5. 洗涤：用适当的缓冲液洗涤树脂，以去除未结合的杂质。
6. 洗脱：使用含有咪唑或其他竞争配体的缓冲液洗脱结合在树脂上的目标蛋白。
7. 浓缩和透析：对洗脱下来的目标蛋白进行浓缩和透析，以去除残留的咪唑和其他杂质。
8. 纯度鉴定：通过 SDS-PAGE、Western blotting 等方法鉴定纯化后的目标蛋白的纯度。
9. 保存：根据需要，将纯化后的目标蛋白保存于适当的条件下，如缓冲液、冷冻保存等。
His-Tag蛋白纯化步骤
变性条件下从大肠杆菌中纯化多聚组氨酸标签蛋白（主要以包涵体的形式表达）的样品制备1、用1X PBS重悬细胞沉淀（约每毫升沉淀加5ml 1 MBS）,并按上述方法进行超声破菌。
2、12000 rpm离心10 min收集包涵体。
若有必要，用1 >PBS洗包涵体几次。
3、用Binding/Wash Buffer （约每毫升沉淀加5ml 1 XPBS）溶解包涵体，并在室温下孵育30〜60分钟。
若使沉淀充分溶解，有必要进行机械或超声均质。
4、12000rpm离心30min,取上清至一干净管中。
His 标签蛋白的重力纯化流程1ml柱子的总体积为10ml，只需加入介质。
如果样品体积大于柱子体积，可重复利用，注意不要超过树脂的结合能力。
1、平衡柱子的工作温度。
应在室温或4C下进行纯化。
2、取出底帽，倒出多余的液体，直立固定好柱子，让柱子顶部朝上。
3、用2 倍树脂体积的Binding/Wash Buffer 平衡柱子，以0.5〜1 ml/min 的流速过柱。
4、从柱子上部加入经Binding/Wash Buffer 处理的大肠杆菌裂解物或蛋白提取物，收集流出液。
若需要，让流出液重新过柱一次，以最大限度地提高结合力。
5、用两倍树脂体积的Binding/Wash Buffer洗涤树脂并收集流出液。
重复该步骤，用一新的收集管收集流出液。
直到流出液的吸光度在280 nm基线处。
6、用两倍树脂体积的Elution Buffer 将His 标签蛋白从树脂上洗脱下来。
重复此步骤两次，并单独收集每次洗脱出来的液体。
7、用Modified Coomassie Bradford Assay Kit （No SK3041）。
洗脱的蛋白可直接进行SDS-PAGE 分析。
注意：洗脱获得的蛋白可用凝胶过滤（如No BSP090 gravity Desalting Column）或透析去除咪唑以便后续应用。
SDS-PAGE分析前，含6M盐酸胍的样品必须用含8 M 尿素的缓冲液透析。
非变性条件下纯化带His标签蛋白的步骤
QIAexpress Ni-NTA Fast Start Handbook非变性条件下纯化带His标签蛋白的步骤准备工作使用前，非变性裂解缓冲液（native Lysis Buffer）必须添加溶菌酶(lysozyme)和全能核酸酶(Benzonase Nuclease)。
先将瓶内的溶菌酶粉末溶解于600µl非变性裂解缓冲液（native Lysis Buffer）。
取100µl溶菌酶溶液加到10ml非变性裂解缓冲液（native Lysis Buffer）。
剩余的溶菌酶溶液—20℃保存。
再融化小瓶内的全能核酸酶(Benzonase Nuclease)溶液，取10µl加到10ml已添加溶菌酶的非变性裂解缓冲液（native Lysis Buffer）。
用户提供的材料E.coli细胞菌体(250ml LB液体培养基培养收集)2×SDS-PAGE 上样缓冲液步骤1.冰上放置15min使菌体解冻，重悬细胞于10ml非变性裂解缓冲液（native Lysis Buffer）。
确保裂解缓冲液已经加入溶菌酶和全能核酸酶。
2.冰上放置30min。
期间温和振荡2~3次使细胞悬液混匀。
3.溶菌产物4℃、14000 xg、离心30min，沉淀细胞碎片。
收集上清液。
上清液含有可溶性重组蛋白。
4.取5µl上清液，加入5µl 2×SDS-PAGE样品缓冲液，—20℃保存，用于后续的SDS-PAGE电泳分析。
5.轻柔倒转几次层析柱(柱内自装树脂悬液)。
6.除去柱下端出口的封条，打开螺帽，排出柱中缓冲液。
7.将步骤3的上清液加到层析柱。
8.收集流出的液体。
取5µl流出液，加入5µl 2×SDS-PAGE样品缓冲液，—20℃保存，用于SDS-PAGE电泳分析。
9.用4ml天然漂洗缓冲液漂洗层析柱2次，收集漂洗组分。
取5µl漂洗液，加入5µl 2×SDS-PAGE样品缓冲液，—20℃保存，用于SDS-PAGE 电泳分析。
（14）可溶蛋白及包涵体的HIS-TAG纯化前处理
（14）可溶蛋白及包涵体的HIS-TAG纯化前处理
一．可溶蛋白处理：
1.每升菌用10—15ml 无8M 尿素的1*binding buffer重悬，此过程要求在冰上
进行，而且动作一定要柔和，尽量避免产生气泡。
2.冰浴超声，时间5min，2s间4s，功率27—28%W总
3.13000g离心20min，4℃
4.将上清转到一个清洁的离心管中待上样。
二．包涵体蛋白处理：
1．每升菌用10—15ml 无8M 尿素的1*binding buffer重悬，此过程要求在冰上进行，而且动作一定要柔和，尽量避免产生气泡。
2. 冰浴超声，时间5min，2s间4s，功率27—28%W总
3. 13000g离心20min，4℃取出一部分上样验证
4. 去上清，在沉淀里加入15ml 含8M 尿素的1*binding buffer 重悬，置冰上1h
5. 13000g离心20min，4℃
6. 将上清转到一个清洁的离心管中待上样。
注：（1）如样品在变性状态下，则应在Binding，Elute，Wash 溶液中加入4~8M 的尿素。
（2）PH的调节应在加完尿素和稀释完储液后调节。
“His-tag蛋白的亲和层析纯化及检测”生化实验报告
His-tag蛋白的亲和层析纯化及检测操作人：XXX 时间：XXXX 地点：XXXXX 温度：16℃一、实验目的：1.了解亲和层析纯化蛋白的原理；2.了解6xHis-tag标签蛋白的的亲和层析纯化原理；3.学会亲和层析的操作方法和超滤管的使用方法和原理。
二、试验方法与过程：1.清洗凝胶：向已经装柱并使用过的层析柱中加入20mlddHO（沿层析柱壁加2入，避免使凝胶不平衡）。
2.平衡：沿壁旋转加入10ml 0mM咪唑溶液，打开开关，释放缓冲液，用烧杯接废液，凝胶上保留0.3cm溶液，使凝胶处于一定的盐浓度和pH。
3.上样：将细胞裂解上清液3ml缓慢加入柱子中，将开关打开，让未结合的蛋白随液体缓慢流出，收集流穿液。
4.洗涤及洗脱：分别用0mM咪唑缓冲液洗脱10ml；20mM咪唑缓冲液洗脱10ml；200mM咪唑缓冲液洗脱5ml；1M咪唑缓冲液洗脱5ml。
每个浓度的流出液都收集在试管中，每次洗脱都保持凝胶上保留0.3cm高度的溶液，流速大约30-40滴/分钟，收集下一浓度洗脱液前先释放20滴于上一管中。
5.观察：各取100ul于紫外灯下观察，比较哪个浓度的咪唑缓冲液下的洗脱液荧光最亮。
6.离心：将紫外灯下最亮的洗脱液转入浓缩管中8000rpm离心10min，将浓缩液吹打后收集，至于-20℃冰箱保存。
7.清洗凝胶：用20ml蒸馏水冲洗凝胶，将凝胶保留在蒸馏水中。
三、原始数据：图一紫外灯下观察结果，从左到右咪唑缓冲液浓度依次增加四、结果处理与分析：使用200mM咪唑缓冲液洗脱的溶液荧光最亮，蛋白含量最高。
五、讨论：1.心得与体会：向层析柱加入蒸馏水、洗脱液时，一定要沿管壁缓慢加入，防止加入时压力太大，使凝胶柱表面不平整。
2.思考题：（1）纯化蛋白质时引入标签蛋白的优缺点：优点：简单亲和纯化、可实现；增加蛋白表达量和稳定性；增加外源蛋白的可溶性及正确折叠。
缺点：如果蛋白不可溶，很难纯化；有些蛋白分子量较大又不能用专门的亲和基质纯化，会影响蛋白质的功能和下游实验；不是所有标签蛋白都具有很好的特异性，尤其是一些分子量小的标签蛋白。
融合his-tag蛋白质纯化步骤(英文翻译)
一：在自然条件下从大肠杆菌纯化带组氨酸的蛋白质1.推荐培养的大肠杆菌的体积：这是根据表达系统和组氨酸标记的蛋白质的性质来决定的。
Midi型号的养25-150mL的大肠杆菌。
2.收集菌的细胞：注：菌体不用的时候需要保存在-800C。
a.将过夜培养的细菌离心（6000g，40C，15min），然后小心的除掉上清。
b.制备1X LEW Buffer 和1X Elution Buffer。
3.悬浮细胞体：这步在冰上进行用1X LEW Buffer将上步离心过后的菌体吹悬，一般来说每150mL菌液加3mL的1X LEW Buffer（每湿重1g的菌体加5mL的1X LEW Buffer）。
如果菌体冻住，则需要在冰上用1X LEW Buffer将其溶解,溶解后转入15 ml的离心管中，便于进行超声裂解。
4.使裂解物澄清a.将溶菌酶添加到上面得到的溶液中（1mL的LEW混合液+20uL的50mg/mL的溶菌酶）。
然后将它放置在冰上30mins，可能的话中间偶尔混合一下。
b.超声裂解：工作2s，间歇2s，如此循环180次，总共18mins。
注：超声在冰浴上进行。
如果得到的溶液有粘着，可加入DNase1。
c.离心（13000rmp，40C，15mins），收集上清。
注：如果上清不是澄清的，进行第二次离心，是为了防止没有溶解的菌体堵塞柱子。
5.平衡PrepEase® Ni-NTA Columna.将柱子放在合适的离心管中，最好是15mL的离心管。
可以将15ml离心管插到冰上。
将柱子放到带圆孔的纸片中，放入15ml离心管中b.用2mL的1X LEW Buffer平衡柱子。
允许柱子在重力的作用下排干。
6.将样品结合到PrepEase® Ni-NTA Column将步骤4c得到的上清加到柱子里，并允许柱子在重力的作用下排干。
7.洗柱子:用1X LEW Buffer洗柱子，洗两次，每次用2mL的1X LEW Buffer。
His标签融合蛋白纯化步骤
His标签融合蛋白纯化步骤（Ni-NTA琼脂糖凝胶亲和层析纯化法）1. 缓冲液配制◆L ysis Buffer 1 (under native condition)0.5mM Tris.HCl0.5M NaCl5%(w/v) glycerol10mM Imidazol100mg(1mg/ml)lysozyme (Purification of 6xHis-tagged proteinsfrom E.coli)1% Nonidet P40 (NP40 = Igepal CA-630 )0.25% Tween 20 （or Triton 100）0.02% NaN3 (Optional)2 tablets of protease inhibitor cocktail (EDTA free，Recommended)200 µg(2µg/ml) RNase A (Optional)1mg (10µg/ml) DNase1 (Optional)50 mM NaF (Optional)1mM Na3VO4 (Optional)+ ddH2O to 100ml, Adjust pH to 8.0 using NaOH此lysis buffer 适用于从E.coli、哺乳动物细胞和昆虫细胞中纯化带His标签的蛋白质。
仅在用于裂解E.coli细菌时，加入溶菌酶。
Na3VO4是磷酸酶抑制剂，保护磷酸化的蛋白不被磷酸酶还原。
NaF是酯酶抑制剂，保护脂蛋白不被酯酶降解。
注意：当使用镍琼脂糖凝胶纯化带His标签的蛋白时，缓冲液中不能加EDTA，因EDTA能使镍从螯合物上脱离，从而使分离介质失去效果。
◆L ysis Buffer 2(under denature condition)50 mM Tris-Cl8 M Urea (or 6 M Gu-HCl)10mM Imidazole0.05% Tween 20Adjust pH to 8.0 using NaOH◆D ialysis/Tev cleavage Buffer50 mM Tris-Cl,pH8.0100 mM NaCl (depends on solubility of protein)2.5% glycerol0.5mM EDTA0.5mM DTT or TCEP◆缓冲液A：50mM Tris.HCl0.5M NaCl5% glycerol0.05% Tween 20用高浓度HCl调节pH值至8.0。
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变性条件下从大肠杆菌中纯化多聚组氨酸标签蛋白（主要以包涵体的形式表达）的样品制备
1、用1× PBS重悬细胞沉淀（约每毫升沉淀加5ml 1× PBS），并按上述方法进行超声破菌。
2、12000 rpm离心10 min收集包涵体。
若有必要，用1 × PBS洗包涵体几次。
3、用Binding/Wash Buffer（约每毫升沉淀加5ml 1× PBS）溶解包涵体，并在室温下孵育30～60分钟。
若使沉淀充分溶解，有必要进行机械或超声均质。
4、12000rpm离心30min，取上清至一干净管中。
His标签蛋白的重力纯化流程
1ml柱子的总体积为10ml，只需加入介质。
如果样品体积大于柱子体积，可重复利用，注意不要超过树脂的结合能力。
1、平衡柱子的工作温度。
应在室温或4℃下进行纯化。
2、取出底帽，倒出多余的液体，直立固定好柱子，让柱子顶部朝上。
3、用2倍树脂体积的Binding/Wash Buffer平衡柱子，以0.5～1 ml/min的流速过柱。
4、从柱子上部加入经Binding/Wash Buffer处理的大肠杆菌裂解物或蛋白提取物，收集流出液。
若需要，让流出液重新过柱一次，以最大限度地提高结合力。
5、用两倍树脂体积的Binding/Wash Buffer洗涤树脂并收集流出液。
重复该步骤，用一新的收集管收集流出液。
直到流出液的吸光度在280 nm基线处。
6、用两倍树脂体积的Elution Buffer将His标签蛋白从树脂上洗脱下来。
重复此步骤两次，并单独收集每次洗脱出来的液体。
7、用Modified Coomassie Bradford Assay Kit（No SK3041）。
洗脱的蛋白可直接进行SDS-PAGE分析。
注意：洗脱获得的蛋白可用凝胶过滤（如No BSP090 gravity Desalting Column）或透析去除咪唑以便后续应用。
SDS-PAGE分析前，含6M盐酸胍的样品必须用含8 M尿素的缓冲液透析。
就地清洗方案
如果背压增加或观察到树脂明显污染，通常进行完全性能恢复流程。
由于所有的NI-IDA树脂的高螯合强度和低金属浸出率，就地清洗前不需要进行stripping。
我们建议使用下面的方法，以清除污染物，如沉淀的蛋白、疏水结合蛋白和脂蛋白。
程序
1、用15倍树脂体积的0.5 M NaOH清洗柱子。
考虑到需要30min的接触时间，因此需相应地调整流量（如用0.5 M NaOH溶液以0.5ml/min的流速洗1ml的NI-IDA柱，需要相当于15ml总体积的量）。
2、用10倍树脂体积的1 × PBS重新平衡后，树脂可马上使用。
若要保存柱子，可加入20～30%乙醇或10～100mM氢氧化钠进行4℃保存。
通过洗脱（stripping）和离子重填装进行再生
NI-IDA柱的洗脱（stripping）和再填装通常是没有必要的。
如果背压增加或观察到树脂明显污染，就地清洗过程通常可恢复性能。
但若性能仍不令人满意，柱子内的NI-IDA树脂可用下面的程序进行洗脱（stripping）和离子重填装。
程序
1、用10倍树脂体积的洗脱缓冲液（Stripping Buffer）（50 mM磷酸钠；300 mM NaCl；100 mM EDTA，pH值8.0）洗涤树脂。
2、用20倍树脂体积的去离子水清洗树脂。
3、用2倍树脂体积的100mM NiSO4（用去离子水配制）进行离子再填装。
4、10倍树脂体积的去离子水清洗，并用10倍树脂体积的1 × PBS重新平衡树脂，树脂可马上使用。
若要保存柱子，可加入20～30%乙醇或10～100mM氢氧化钠进行4℃保存。
问题解答
问题可能的原因建议
流速太慢样品太黏
●如果纯化是在4℃进行，那改为在室温下进行。
●超声破菌前或超声破菌后增加细胞裂解物的稀释度。
●继续超声破菌，直到黏度下降；和/或额外加入DNAse和
Mg2+。
●如果用很黏稠的溶液，将柱子连接到真空管以增加流速
纯化过程中目
的蛋白难溶或
沉淀
●添加去垢剂或其他物质，缓慢混合30min以增加目的蛋白
的可溶性。
注意：Triton X-100和NP-40（不是Tween）在
280nm具有高吸光度，此外，去垢剂不能通过缓冲液置
换而轻易去除。
●包涵体：用常规变性剂如4～6 M盐酸胍、4～8 M尿素或
强变性剂，蛋白很容易从包涵体中溶解（和去折叠）。
缓慢混合30min或更长时间以助溶目的蛋白。
His-Tag蛋白产量低His-Tag蛋白没
有完全被洗脱
●额外增加几毫升的elution buffer进行洗脱
样品制备和洗
涤过程中发现
流出液中存在
His-Tag蛋白
●样品和结合缓冲液中咪唑浓度太高，使用低浓度的咪唑。
●确定样品中螯合剂或强还原剂的浓度不要太高。
●组氨酸标签可能暴露不充分；对包涵体，可用尿素或盐
酸胍对去折叠的蛋白进行纯化。
减少样品的稀释，增加
固体尿素或盐酸胍。
●组氨酸标签丢失。
检查结构的序列。
纯化过程中
His-Tag蛋白没
有被洗脱下来
●His-Tag蛋白仍然被结合。
洗脱液中用高浓度的的咪唑进
行洗脱
●目的蛋白沉淀在柱子中，减少样品的量；
●洗脱过程中降低咪唑的量。
尝试去垢剂或改变NaCl的浓
度或在变性（去折叠）条件下洗脱。
非特异性疏水或其
它互作。
●在洗脱缓冲液中加入非离子去垢剂或增加NaCl的浓度。
洗脱的His-Tag蛋样品和缓冲液
中咪唑的浓度
●样品和缓冲液中使用高浓度的咪唑以阻止杂蛋白结合。
推荐使用20～40mM，但更高浓度可能也适合。
白不纯太低
未结合物质洗
涤不充分
样品制备后重复洗涤步骤以获得最佳纯度
His-Tag蛋白被蛋白酶部分降解增加蛋白酶抑制剂（避免含EDTA）。
在4℃进行进行裂解和纯化。
His-Tag蛋白有关的污染超声破菌前，洗涤缓冲液中增加去垢剂的量（如增加到2%的Triton X-100或2%的Tween），或增加甘油（到50%）的量，
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