His-Tag蛋白纯化步骤
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变性条件下从大肠杆菌中纯化多聚组氨酸标签蛋白(主要以包涵体的形式表达)的样品制备
1、用1× PBS重悬细胞沉淀(约每毫升沉淀加5ml 1× PBS),并按上述方法进行超声破菌。
2、12000 rpm离心10 min收集包涵体。若有必要,用1 × PBS洗包涵体几次。
3、用Binding/Wash Buffer(约每毫升沉淀加5ml 1× PBS)溶解包涵体,并在室温下孵育30~60分钟。若使沉淀充分溶解,有必要进行机械或超声均质。
4、12000rpm离心30min,取上清至一干净管中。
His标签蛋白的重力纯化流程
1ml柱子的总体积为10ml,只需加入介质。如果样品体积大于柱子体积,可重复利用,注意不要超过树脂的结合能力。
1、平衡柱子的工作温度。应在室温或4℃下进行纯化。
2、取出底帽,倒出多余的液体,直立固定好柱子,让柱子顶部朝上。
3、用2倍树脂体积的Binding/Wash Buffer平衡柱子,以0.5~1 ml/min的流速过柱。
4、从柱子上部加入经Binding/Wash Buffer处理的大肠杆菌裂解物或蛋白提取物,收集流出液。若需要,让流出液重新过柱一次,以最大限度地提高结合力。
5、用两倍树脂体积的Binding/Wash Buffer洗涤树脂并收集流出液。重复该步骤,用一新的收集管收集流出液。直到流出液的吸光度在280 nm基线处。
6、用两倍树脂体积的Elution Buffer将His标签蛋白从树脂上洗脱下来。重复此步骤两次,并单独收集每次洗脱出来的液体。
7、用Modified Coomassie Bradford Assay Kit(No SK3041)。洗脱的蛋白可直接进行SDS-PAGE分析。
注意:洗脱获得的蛋白可用凝胶过滤(如No BSP090 gravity Desalting Column)或透析去除咪唑以便后续应用。SDS-PAGE分析前,含6M盐酸胍的样品必须用含8 M尿素的缓冲液透析。
就地清洗方案
如果背压增加或观察到树脂明显污染,通常进行完全性能恢复流程。由于所有的NI-IDA树脂的高螯合强度和低金属浸出率,就地清洗前不需要进行stripping。我们建议使用下面的方法,以清除污染物,如沉淀的蛋白、疏水结合蛋白和脂蛋白。
程序
1、用15倍树脂体积的0.5 M NaOH清洗柱子。考虑到需要30min的接触时间,因此需相应地调整流量(如用0.5 M NaOH溶液以0.5ml/min的流速洗1ml的NI-IDA柱,需要相当于15ml总体积的量)。
2、用10倍树脂体积的1 × PBS重新平衡后,树脂可马上使用。若要保存柱子,可加入20~30%乙醇或10~100mM氢氧化钠进行4℃保存。
通过洗脱(stripping)和离子重填装进行再生
NI-IDA柱的洗脱(stripping)和再填装通常是没有必要的。如果背压增加或观察到树脂明显污染,就地清洗过程通常可恢复性能。但若性能仍不令人满意,柱子内的NI-IDA树脂可用下面的程序进行洗脱(stripping)和离子重填装。
程序
1、用10倍树脂体积的洗脱缓冲液(Stripping Buffer)(50 mM磷酸钠;300 mM NaCl;100 mM EDTA,pH值8.0)洗涤树脂。
2、用20倍树脂体积的去离子水清洗树脂。
3、用2倍树脂体积的100mM NiSO4(用去离子水配制)进行离子再填装。
4、10倍树脂体积的去离子水清洗,并用10倍树脂体积的1 × PBS重新平衡树脂,树脂可马上使用。若要保存柱子,可加入20~30%乙醇或10~100mM氢氧化钠进行4℃保存。
问题解答
问题可能的原因建议
流速太慢样品太黏
●如果纯化是在4℃进行,那改为在室温下进行。
●超声破菌前或超声破菌后增加细胞裂解物的稀释度。
●继续超声破菌,直到黏度下降;和/或额外加入DNAse和
Mg2+。
●如果用很黏稠的溶液,将柱子连接到真空管以增加流速
纯化过程中目
的蛋白难溶或
沉淀
●添加去垢剂或其他物质,缓慢混合30min以增加目的蛋白
的可溶性。注意:Triton X-100和NP-40(不是Tween)在
280nm具有高吸光度,此外,去垢剂不能通过缓冲液置
换而轻易去除。
●包涵体:用常规变性剂如4~6 M盐酸胍、4~8 M尿素或
强变性剂,蛋白很容易从包涵体中溶解(和去折叠)。
缓慢混合30min或更长时间以助溶目的蛋白。
His-Tag蛋白产量低His-Tag蛋白没
有完全被洗脱
●额外增加几毫升的elution buffer进行洗脱
样品制备和洗
涤过程中发现
流出液中存在
His-Tag蛋白
●样品和结合缓冲液中咪唑浓度太高,使用低浓度的咪唑。
●确定样品中螯合剂或强还原剂的浓度不要太高。
●组氨酸标签可能暴露不充分;对包涵体,可用尿素或盐
酸胍对去折叠的蛋白进行纯化。减少样品的稀释,增加
固体尿素或盐酸胍。
●组氨酸标签丢失。检查结构的序列。
纯化过程中
His-Tag蛋白没
有被洗脱下来
●His-Tag蛋白仍然被结合。洗脱液中用高浓度的的咪唑进
行洗脱
●目的蛋白沉淀在柱子中,减少样品的量;
●洗脱过程中降低咪唑的量。尝试去垢剂或改变NaCl的浓
度或在变性(去折叠)条件下洗脱。非特异性疏水或其
它互作。
●在洗脱缓冲液中加入非离子去垢剂或增加NaCl的浓度。
洗脱的His-Tag蛋样品和缓冲液
中咪唑的浓度
●样品和缓冲液中使用高浓度的咪唑以阻止杂蛋白结合。
推荐使用20~40mM,但更高浓度可能也适合。