马铃薯疮痂病高效拮抗菌的筛选及鉴定

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马铃薯疮痂病高效拮抗菌的筛选及鉴定
高同国，姜军坡，郭晓军，张冬冬，朱宝成
（ 河北农业大学生Leabharlann Baidu科学学院， 河北保定 ０ ７ １ ０ ０ １ ）
㊀㊀摘要： 为获得对马铃薯疮痂病（ ｐ ｏ ｔ ａ ｔ ｏｓ ｃ ａ ｂ ） 病原菌具有较强拮抗作用的优良菌株， 以笔者所在实验室保存的 ２ ３ ７ 株细菌为出发菌株， 采用十字交叉划线法和平板扩散法进行初筛和复筛。经筛选后得到 １株拮抗活性明显的菌株 １ ２－ ８ ２ ， 其抑菌圈直径达 ２ ６ ． ２ｍ ｍ 。经菌落菌体形态观察、 １ ６ Ｓｒ Ｒ Ｎ Ａ基因序列分析及生理生化试验， 将菌株 １ ２－ ８ ２初 步鉴定为解淀粉芽孢杆菌（ Ｂ ａ ｃ ｉ ｌ ｌ ｕ ｓ ａ ｍ ｙ ｌ ｏ ｌ ｉ ｑ ｕ ｅ ｆ ａ ｃ ｉ ｅ ｎ ｓ ） ， 该研究为开发防治马铃薯疮痂病的生物菌剂奠定了基础。 ㊀㊀关键词： 马铃薯疮痂病； 生物防治； 解淀粉芽孢杆菌； 菌种鉴定； 生物菌剂 ㊀㊀中图分类号：Ｓ ４ ３ ５ ． ３ ２ ㊀㊀文献标志码：Ａ ㊀㊀文章编号： １ ０ ０ ２－ １ ３ ０ ２ （ ２ ０ １ ６ ） １ ２－ ０ １ ５ ７－ ０ ３
江苏农业科学㊀２ ０ １ ６年第 ４ ４卷第 １ ２期
高同国， 姜军坡， 郭晓军， 等．马铃薯疮痂病高效拮抗菌的筛选及鉴定［ Ｊ ］ ．江苏农业科学， ２ ０ １ ６ ， ４ ４ （ １ ２ ） ： １ ５ ７－ １ ５ ９ ． ｄ ｏ ｉ ： １ ０ ． １ ５ ８ ８ ９ ／ ｊ ． ｉ ｓ ｓ ｎ ． １ ０ ０ ２－ １ ３ ０ ２ ． ２ ０ １ ６ ． １ ２ ． ０ ４ ６
７ ］ Ｐ ｏ ｎ Ｓ Ｓ Ｉ Ｉ 防治疮痂病， 症状 明 显 减 轻 ［ 。Ｈ ｉ ｌ ｔ ｕ ｎ ｅ ｎ等 ｍ ｏ ｇ ｅ ｎ ｅ ｓ ８－ １ ０ ］ 报道利用非致病性链霉菌也可以防治疮痂链霉菌 ［ 。刘
大群等采用生防拮抗链霉菌防治马铃薯疮痂病， 结果表明， 不 同的菌系有明显的防效差异， 单个拮抗菌的防效优于 ２个拮 抗菌的混合使用效果
㊀㊀马铃薯种植区域广泛， 仅次于水稻、 小麦和玉米。近年 ｐ ｏ ｔ ａ ｔ ｏ ｓ ｃ ａ ｂ ） 的发生逐渐加重， 已成为马铃 来， 马铃薯疮痂病（ 薯主要病害之一。该病主要由链霉菌引起， 可危害马铃薯块 茎， 感病的薯块表面形成痂状病斑， 影响马铃薯的外观品质，
１ － ２ ］ ， 严重时还会延迟马铃薯出苗， 从而降低薯块的商品价值 ［
［ １ １ ］
。另外， 利用微生物代谢产物防治疮
Ｈ ａ ｎ等报道利用芽孢杆菌产生的代 痂病也是有效手段之一， 谢物 ｍ ａ ｃ ｒ ｏ ｌ ａ ｃ ｔ ｉ ｎＡ有效地防治马铃薯疮痂病， 使疮痂病的发
１ ２ ］ ０ ％［ 。 病率降低了 ４
１ ． ３ ． ２ ㊀ 拮抗菌筛选 ㊀ 初筛： 取１ ０ ０μ Ｌ孢子悬浮液均匀涂抹 在Ｏ Ｍ Ａ平板上， 将已活化的待筛选菌种以十字划线方式接 种于培养皿中。２ ８ħ培养 ７ｄ ， 观察抑菌圈的大小。 Ａ培养基上活化好的待筛选细菌接种于 Ｎ Ｂ培 复筛： 将Ｎ 养基， ３ ７ħ、 ２ ０ ０ｒ ／ ｍ ｉ ｎ发酵 ４ ８ｈ ， １ ００ ０ ０ｒ ／ ｍ ｉ ｎ离心 １ ０ｍ ｉ ｎ ， 收集上清液， 并经细菌滤器（ ０ ． ２ ２μ ｍ ） 过滤， 即得无菌发酵 液， 待用。取 １ ０ ０μ Ｌ孢子悬浮液均匀涂抹在 Ｏ Ｍ Ａ平板上， 将 在扇形中央用打孔器打 １个 培养皿平均分为 ４个扇形区域， ． ０ｍ ｍ的孔， 用移液器取 ５ ０μ Ｌ无菌发酵液滴于孔内， 直径 ６ ２ ８ħ培养 ７ｄ ， 测量抑菌圈的直径（ ｍ ｍ ） 。每处理重复 ３次。 １ ． ３ ． ３ ㊀１ ６ Ｓｒ Ｒ Ｎ Ａ基因 Ｐ Ｃ Ｒ扩增 ㊀ 用十六烷基三甲基溴化 铵（ ｈ ｅ ｘ ａ ｄ ｅ ｃ ｙ ｌ ｔ ｒ ｉ ｍ ｅ ｔ ｈ ｙ ｌ ａ ｍ ｍ ｏ ｎ ｉ ｕ ｍｂ ｒ ｏ ｍ ｉ ｄ ｅ ， 简称 Ｃ Ｔ Ａ Ｂ ） 提取菌
［ ４－ ５ ］
。目前缺乏有效手段防治马铃薯疮痂病， 而
利用生物防治方法越来越多地引起人们的重视。 Ｂ ｅ ａ ｕ ｓ é ｊ ｏ ｕ ｒ 等利用生物制剂与壳聚糖结合用于防治疮痂病取得良好效 果
［ ６ ］
。Ｎ ｅ ｅ ｎ ｏ － Ｅ ｃ ｋ ｗ ａ ｌ ｌ 等在田间试验 中 使 用 Ｓ ． ｄ ｉ ａ ｓ ｔ ａ ｔ ｏ ｃ ｈ ｒ ｏ
马铃薯疮痂病病原菌： 疮痂链霉菌， 来源于河北农业大学 ３ ７株细菌来源于河北农业 植物保护学院植物病理实验室。２ 大学生命科学院制药工程系。 １ ． ２ ㊀供试培养基 牛肉膏 蛋 白 胨 培 养 基 （ Ｎ Ａ ） ： 牛肉膏 ３ ． ０ｇ 、 蛋白胨 １ ０ ． ０ｇ 、 Ｎ ａ Ｃ ｌ ５ ． ０ｇ 、 琼脂 １ ５ ． ０ ２ ０ ． ０ｇ ， 加Ｈ Ｏ至 １Ｌ ， ｐ Ｈ值 ２ ７ ． ０ ７ ． ２ ； Ｎ Ａ培养基中不添加琼脂为 Ｎ Ｂ培养基； 燕麦琼脂 培养基（ Ｏ Ｍ Ａ ） ： 琼脂 １ ８ ． ０ｇ ， 加２ ％燕麦汁至 １Ｌ ， 调ｐ Ｈ值至 ７ ． ２ 。以上培养基在 １ ２ １ħ高压灭菌 ３ ０ｍ ｉ ｎ 。 １ ． ３ ㊀方法 １ ． ３ ． １ ㊀制备病原菌孢子悬浮液㊀将病原菌接种于 Ｏ Ｍ Ａ固体 培养基中， 置于 ２ ８ħ培养箱中培养 ３ ５ｄ 。取 １ ０ｍ Ｌ无菌水 于长满疮痂病病原菌的培养皿中， 用玻璃棒轻刮培养物表面 Ｌ无菌注射器筒过滤除去菌丝 的孢子， 再用装有脱脂棉的 ５ｍ 团， 滤液倒入离心管中， ４ħ、 ６０ ０ ０ｒ ／ ｍ ｉ ｎ 离心 １ ５ｍ ｉ ｎ ， 使孢子 沉淀， 离心完毕后倒掉上清， 将离心管在漩涡混合器上振荡， 使孢子沉淀物分散于残存的无菌水中。在无菌条件下， 将制 备好 的 菌 种 用 无 菌 水 稀 释，孢 子 悬 浮 液 的 浓 度 不 低
７ 于１ ０ Ｃ Ｆ Ｕ／ ｍ Ｌ 。
甚至减少产量
［ ３ ］
。在我国， 引起疮痂病的病原菌有疮痂链霉
Ｓ ｔ ｒ ｅ ｐ ｔ ｏ ｍ ｙ ｃ ｅ ｓ ｓ ｃ ａ ｂ ｉ ｅ ｓ ） 、 酸性疮痂链霉菌（ Ｓ ．ａ ｃ ｉ ｄ ｉ ｓ ｃ ａ ｂ ｉ ｅ ｓ ） 、 肿 菌（ 痂链霉菌（ Ｓ ．ｔ ｕ ｒ ｇ ｉ ｄ ｉ ｓ ｃ ａ ｂ ｉ ｅ ｓ ） 和加利利链霉菌（ Ｓ ．ｇ ａ ｌ ｉ ｌ ａ ｅ ｕ ｓ ） 等 多种病原菌