胰岛素
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胰 岛 素
（三）胰岛素（Insulin） 胰岛素（ ） 胰岛素广泛存在于人和动物的胰脏 动物的胰脏中，正常人的 动物的胰脏 胰脏约含有200万个胰岛，胰岛由α-、β-和δ-三种细胞 万 、 和 三种细胞 组成，其中β-细胞制造胰岛素 胰岛素，α-细胞制造胰高血糖 组成 胰岛素 胰高血糖 胰抗脂肝素，δ-细胞制造生长激素抑制因子 生长激素抑制因子。胰 素和胰抗脂肝素 胰抗脂肝素 生长激素抑制因子 岛素在β-细胞中开始时是以活性很弱的前体胰岛素原 前体胰岛素原 存在的，进而分解 分解为胰岛素进入血液循环。 分解 (1) 结构和性质 胰岛素由51个氨基酸组成。
（四）生长素 ① 人生长素对人肝细胞有增加核分裂作用，对人红 细胞有抑制葡萄糖利用的作用，对人白细胞或淋 巴细胞有促进蛋白质和核酸合成的作用，有促进 骨骼，肌肉，结缔组织和内脏增长的作用。 ② 动物生长素能促进家禽生长，增加产量，在畜牧 业领域有很好的应用前景。 ③ 不同种属的哺乳动物的生长激素之间有明显的种 属特异性，只有灵长类的生长素对人有活性。 ④ 目前，人和动物生长素基因都已在大肠杆菌中表 达成功，产品已投向市场。
2、传统生产工艺 、 （1）工艺路线： ）工艺路线：
4、基因工程IL-2的制备 （1）IL-2基因结构 （2）cDNA克隆的制备 ① 从ConA激活的人白细胞 T细胞株提取高活性IL2mRNA作为模板。逆转 录单链cDNA。 ② 经末端脱氧核苷酸转移 酶催化，在cDNA末端连 接若干dCMP残基，引物 存在下，利用DNA聚合 酶成双链cDNA。 ③ 分离cDNA片段，G-C加 尾法基因重组
（2百度文库工艺过程
（五）白细胞介素-2和白细胞介素 ① 白细胞介素是介导白细胞间相互作用的一类细胞因子，是 淋巴因子家族的一员。 ② 目前已有IL-1—18，目前对IL-1—6研究较多。 ③ 目前上市的白细胞介素只有IL-2。 ④ IL-2是由辅助T细胞经抗原或丝裂原等刺激，在巨噬细胞 或单核细胞分泌的IL-1参与下，产生并分泌的糖蛋白。 ⑤ IL-2能诱导T细胞增殖与分化，刺激T细胞分泌γ-干扰素， 增强杀伤细胞的活性，在调节免疫功能上具有重要意义。 临床上用于治疗一些免疫功能不全以及癌症的综合治疗， 另IL-2对创伤修复也有一定的作用。
4、胰岛素制剂 新剂型：眼用膜剂、鼻腔给药的气雾剂、直肠用 栓剂以及口服的脂质体、微囊、乳剂等。 5、酶促半合成人胰岛素
6、重组DNA技术
另一种方法是用分泌型载体表达胰岛素原，再用 酶法转化为人胰岛素。 • 蛋白质工程 ① 胰岛素分子中取代一个氨基酸残基，防止单体二 聚化，由此合成的新型胰岛素在药物浓度下基本 上保持单体，注射后吸收速度比正常胰岛素快23倍。 ② 胰岛素B链第10位His变为Asp，受体结合能力和 离体生物活力分别为猪胰岛素的262%和235%。
（3）IL-2的表达和纯化 ① 利用大肠杆菌、酵母和哺乳动物细胞已经成功 表达了重组人IL-2。 ② 工程菌经发酵培养和诱导表达，收集裂解菌体， 离心沉淀收集包涵体。包涵体主要含由IL-2单体 分子聚合而成的多聚体，不溶于水，且其中的 重组IL-2无活性。 ③ 重组IL-2可用6 mol/L盐酸胍或8 mol/L尿素使包 涵体变性解聚成单分子，再利用空气氧化或用 1.5 mol/L还原型谷胱甘肽复性。恢复IL-2二硫键 和正常分子结构，获得生物活性。
④ 重组IL-2的进一步纯化有如下几种方法 • 利用IL-2的疏水性，经超滤浓缩后利用反相高效 液相层析和较高浓度的乙腈（60%）的流动相进 行梯度洗脱，可得高纯度的IL-2。 • 通过受体亲和层析一步纯化，可得到纯度为95% 以上的IL-2。 • 用7 mol/L尿素溶解IL-2包涵体得到上清夜，上清 液经Sephadex G-100凝胶过滤和W650蛋白质 纯化洗脱DEAE离子交换层析，最终得到均一的 IL-2，纯度达到98%。
1、IL-2结构与性质 ① 人IL-2前体由153个氨基酸残基组成，在分泌出细胞时， 含有20个氨基酸的信号肽被切除，产生成熟的IL-2分子。 ② IL-2分子质量为15420，不同来源的IL-2分子不均一。 ③ 在人IL-2的第58、105、125位是Cys，其中第58、105形 成分子内二硫键，这对保持其生物活性是必不可少的。 ④ IL-2在pH=2-9范围内稳定，对各种蛋白酶均敏感，对 DNA、RNA酶不敏感。 ⑤ 重组IL-2因细菌缺少翻译后的修饰功能都不是糖蛋白，相 对分子质量为14000，PI大部分为7.7。 ⑥ 应用蛋白质工程技术在IL-2中125位的Cys分别由Ser或 Ala取代，可制成生物活性、热稳定性和复性效果都比原 IL-2强的新型白介素。
⑥ 在pH=2的酸性水溶液中加热至80-100度，可发生聚合而 转变为无活性的纤维状胰岛素，如及时用冷0.05mol/L氢 氧化钠处理，仍可恢复为有活性的胰岛素结晶。 ⑦ 具有蛋白质的各种特殊反应；胰岛素能被胰岛素酶、胃 蛋白酶、糜蛋白酶等蛋白水解酶水解而失活。 ⑧ 多种还原剂如硫化氢、甲酸、醛、醋酐、硫代硫酸钠、 维生素C及多种重金属等都能使胰岛素分子中二硫键被 还原、游离氨基被酰化游离羧基被酯化和肽键水解而导 致胰岛素失活。 ⑨ 胰岛素对高能辐射非常敏感；能被活性炭、白陶土、氢 氧化铝、磷酸钙、CMC等吸附。
不同种属动物的胰岛素分子结构大致相同 分子结构大致相同，主要差 分子结构大致相同 别在A链二硫桥中间的第 、9和10位上的三个氨基酸 链二硫桥中间的第8、 和 位上的三个氨基酸 链二硫桥中间的第 末端人的是苏氨酸， 及B链C末端人的是苏氨酸， 猪的是丙氨酸 抗原性比 链 末端人的是苏氨酸 猪的是丙氨酸,抗原性比 其他来源的胰岛素要低。
2、生产工艺 、 （1）工艺流程： ）工艺流程：
（2）工艺过程及控制要点 ）
3、质量检验 （1）原料质量控制 ① 不同种类和年龄的动物，胰脏中胰岛素的含量有差别。 ② 采摘胰岛素要保持腺体组织的完整；离体后要立即深冻，先在-30度 以下急冻后转入-20度保存备用。 （2）生产过程质量控制 浓缩工序的条件对胰岛素收率影响很大，尽量缩短浓缩液受热时间 （3）产品性状 （4）产品纯度要求 ① 常规的结晶胰岛素纯度不够高，需进一 步层析纯化。采用超细Sephadex G-50 凝胶过滤。 ② 美、英药典主要控制两个指标，即相对 分子质量大于胰岛素的蛋白质和胰岛素 原。国外一般要求胰岛素原核脱酰胺胰 岛素含量在10*10-6，1000*10-6以下。
1、结构和性质 ① 人的生长素是由一条191个氨基酸的多肽链所构成的蛋 白质，分子中有两个二硫键，相对分子量21700.等电点 4.9. ② 胰岛素N端的1-134氨基酸肽链段位活性所必需，C端的 一段可能起保护作用，使生长素在血液循环中不致被酶 所破坏。 ③ 人生长激素分子相对稳定，冰冻下活性可保持数年。 2、生产工艺
(2) 胰岛素的性质
白色或类白色结晶粉末，晶形为扁斜形六面体。 ① 白色或类白色结晶粉末，晶形为扁斜形六面体。 ② 牛胰岛素的分子量为5733，猪为5764，人为5784。胰岛素 的等电点为 等电点为5.3~5.4。 等电点为 ③ 胰岛素在pH4.5～6.5范围内几乎不溶于水 易溶于稀酸 ～ 范围内几乎不溶于水 范围内几乎不溶于水，易溶于稀酸 或稀碱溶液； 以下乙醇或丙酮中溶解；在 或稀碱溶液；在80%以下乙醇或丙酮中溶解 在90%以上 以下乙醇或丙酮中溶解 以上 乙醇或80%以上丙酮中难溶 以上丙酮中难溶；在乙醚中不溶。 乙醚中不溶。 乙醇或 以上丙酮中难溶 乙醚中不溶
在弱酸性水溶液或混悬在中性缓冲液中较为稳定。 ④ 在弱酸性水溶液或混悬在中性缓冲液中较为稳定。 水溶液中胰岛素分子受pH、温度、 ⑤ 水溶液中胰岛素分子受 、温度、离子强度的影响产生聚 合和解聚现象。在低胰岛素浓度的酸性溶液时呈单体状态。 合和解聚现象。在低胰岛素浓度的酸性溶液时呈单体状态。 锌胰岛素在pH=2的水溶液中呈二聚体，聚合作用随 升 的水溶液中呈二聚体， 锌胰岛素在 的水溶液中呈二聚体 聚合作用随pH升 高而增加， 时聚合成不溶性无定形沉淀。 高浓 高而增加，在pH=4-7时聚合成不溶性无定形沉淀。在高浓 时聚合成不溶性无定形沉淀 度锌的溶液中，pH6～8时胰岛素溶解度急剧下降 ，pH大 度锌 ～ 于9时解聚并由于单体结构改变而失活。
（三）胰岛素（Insulin） 胰岛素（ ） 胰岛素广泛存在于人和动物的胰脏 动物的胰脏中，正常人的 动物的胰脏 胰脏约含有200万个胰岛，胰岛由α-、β-和δ-三种细胞 万 、 和 三种细胞 组成，其中β-细胞制造胰岛素 胰岛素，α-细胞制造胰高血糖 组成 胰岛素 胰高血糖 胰抗脂肝素，δ-细胞制造生长激素抑制因子 生长激素抑制因子。胰 素和胰抗脂肝素 胰抗脂肝素 生长激素抑制因子 岛素在β-细胞中开始时是以活性很弱的前体胰岛素原 前体胰岛素原 存在的，进而分解 分解为胰岛素进入血液循环。 分解 (1) 结构和性质 胰岛素由51个氨基酸组成。
（四）生长素 ① 人生长素对人肝细胞有增加核分裂作用，对人红 细胞有抑制葡萄糖利用的作用，对人白细胞或淋 巴细胞有促进蛋白质和核酸合成的作用，有促进 骨骼，肌肉，结缔组织和内脏增长的作用。 ② 动物生长素能促进家禽生长，增加产量，在畜牧 业领域有很好的应用前景。 ③ 不同种属的哺乳动物的生长激素之间有明显的种 属特异性，只有灵长类的生长素对人有活性。 ④ 目前，人和动物生长素基因都已在大肠杆菌中表 达成功，产品已投向市场。
2、传统生产工艺 、 （1）工艺路线： ）工艺路线：
4、基因工程IL-2的制备 （1）IL-2基因结构 （2）cDNA克隆的制备 ① 从ConA激活的人白细胞 T细胞株提取高活性IL2mRNA作为模板。逆转 录单链cDNA。 ② 经末端脱氧核苷酸转移 酶催化，在cDNA末端连 接若干dCMP残基，引物 存在下，利用DNA聚合 酶成双链cDNA。 ③ 分离cDNA片段，G-C加 尾法基因重组
（2百度文库工艺过程
（五）白细胞介素-2和白细胞介素 ① 白细胞介素是介导白细胞间相互作用的一类细胞因子，是 淋巴因子家族的一员。 ② 目前已有IL-1—18，目前对IL-1—6研究较多。 ③ 目前上市的白细胞介素只有IL-2。 ④ IL-2是由辅助T细胞经抗原或丝裂原等刺激，在巨噬细胞 或单核细胞分泌的IL-1参与下，产生并分泌的糖蛋白。 ⑤ IL-2能诱导T细胞增殖与分化，刺激T细胞分泌γ-干扰素， 增强杀伤细胞的活性，在调节免疫功能上具有重要意义。 临床上用于治疗一些免疫功能不全以及癌症的综合治疗， 另IL-2对创伤修复也有一定的作用。
4、胰岛素制剂 新剂型：眼用膜剂、鼻腔给药的气雾剂、直肠用 栓剂以及口服的脂质体、微囊、乳剂等。 5、酶促半合成人胰岛素
6、重组DNA技术
另一种方法是用分泌型载体表达胰岛素原，再用 酶法转化为人胰岛素。 • 蛋白质工程 ① 胰岛素分子中取代一个氨基酸残基，防止单体二 聚化，由此合成的新型胰岛素在药物浓度下基本 上保持单体，注射后吸收速度比正常胰岛素快23倍。 ② 胰岛素B链第10位His变为Asp，受体结合能力和 离体生物活力分别为猪胰岛素的262%和235%。
（3）IL-2的表达和纯化 ① 利用大肠杆菌、酵母和哺乳动物细胞已经成功 表达了重组人IL-2。 ② 工程菌经发酵培养和诱导表达，收集裂解菌体， 离心沉淀收集包涵体。包涵体主要含由IL-2单体 分子聚合而成的多聚体，不溶于水，且其中的 重组IL-2无活性。 ③ 重组IL-2可用6 mol/L盐酸胍或8 mol/L尿素使包 涵体变性解聚成单分子，再利用空气氧化或用 1.5 mol/L还原型谷胱甘肽复性。恢复IL-2二硫键 和正常分子结构，获得生物活性。
④ 重组IL-2的进一步纯化有如下几种方法 • 利用IL-2的疏水性，经超滤浓缩后利用反相高效 液相层析和较高浓度的乙腈（60%）的流动相进 行梯度洗脱，可得高纯度的IL-2。 • 通过受体亲和层析一步纯化，可得到纯度为95% 以上的IL-2。 • 用7 mol/L尿素溶解IL-2包涵体得到上清夜，上清 液经Sephadex G-100凝胶过滤和W650蛋白质 纯化洗脱DEAE离子交换层析，最终得到均一的 IL-2，纯度达到98%。
1、IL-2结构与性质 ① 人IL-2前体由153个氨基酸残基组成，在分泌出细胞时， 含有20个氨基酸的信号肽被切除，产生成熟的IL-2分子。 ② IL-2分子质量为15420，不同来源的IL-2分子不均一。 ③ 在人IL-2的第58、105、125位是Cys，其中第58、105形 成分子内二硫键，这对保持其生物活性是必不可少的。 ④ IL-2在pH=2-9范围内稳定，对各种蛋白酶均敏感，对 DNA、RNA酶不敏感。 ⑤ 重组IL-2因细菌缺少翻译后的修饰功能都不是糖蛋白，相 对分子质量为14000，PI大部分为7.7。 ⑥ 应用蛋白质工程技术在IL-2中125位的Cys分别由Ser或 Ala取代，可制成生物活性、热稳定性和复性效果都比原 IL-2强的新型白介素。
⑥ 在pH=2的酸性水溶液中加热至80-100度，可发生聚合而 转变为无活性的纤维状胰岛素，如及时用冷0.05mol/L氢 氧化钠处理，仍可恢复为有活性的胰岛素结晶。 ⑦ 具有蛋白质的各种特殊反应；胰岛素能被胰岛素酶、胃 蛋白酶、糜蛋白酶等蛋白水解酶水解而失活。 ⑧ 多种还原剂如硫化氢、甲酸、醛、醋酐、硫代硫酸钠、 维生素C及多种重金属等都能使胰岛素分子中二硫键被 还原、游离氨基被酰化游离羧基被酯化和肽键水解而导 致胰岛素失活。 ⑨ 胰岛素对高能辐射非常敏感；能被活性炭、白陶土、氢 氧化铝、磷酸钙、CMC等吸附。
不同种属动物的胰岛素分子结构大致相同 分子结构大致相同，主要差 分子结构大致相同 别在A链二硫桥中间的第 、9和10位上的三个氨基酸 链二硫桥中间的第8、 和 位上的三个氨基酸 链二硫桥中间的第 末端人的是苏氨酸， 及B链C末端人的是苏氨酸， 猪的是丙氨酸 抗原性比 链 末端人的是苏氨酸 猪的是丙氨酸,抗原性比 其他来源的胰岛素要低。
2、生产工艺 、 （1）工艺流程： ）工艺流程：
（2）工艺过程及控制要点 ）
3、质量检验 （1）原料质量控制 ① 不同种类和年龄的动物，胰脏中胰岛素的含量有差别。 ② 采摘胰岛素要保持腺体组织的完整；离体后要立即深冻，先在-30度 以下急冻后转入-20度保存备用。 （2）生产过程质量控制 浓缩工序的条件对胰岛素收率影响很大，尽量缩短浓缩液受热时间 （3）产品性状 （4）产品纯度要求 ① 常规的结晶胰岛素纯度不够高，需进一 步层析纯化。采用超细Sephadex G-50 凝胶过滤。 ② 美、英药典主要控制两个指标，即相对 分子质量大于胰岛素的蛋白质和胰岛素 原。国外一般要求胰岛素原核脱酰胺胰 岛素含量在10*10-6，1000*10-6以下。
1、结构和性质 ① 人的生长素是由一条191个氨基酸的多肽链所构成的蛋 白质，分子中有两个二硫键，相对分子量21700.等电点 4.9. ② 胰岛素N端的1-134氨基酸肽链段位活性所必需，C端的 一段可能起保护作用，使生长素在血液循环中不致被酶 所破坏。 ③ 人生长激素分子相对稳定，冰冻下活性可保持数年。 2、生产工艺
(2) 胰岛素的性质
白色或类白色结晶粉末，晶形为扁斜形六面体。 ① 白色或类白色结晶粉末，晶形为扁斜形六面体。 ② 牛胰岛素的分子量为5733，猪为5764，人为5784。胰岛素 的等电点为 等电点为5.3~5.4。 等电点为 ③ 胰岛素在pH4.5～6.5范围内几乎不溶于水 易溶于稀酸 ～ 范围内几乎不溶于水 范围内几乎不溶于水，易溶于稀酸 或稀碱溶液； 以下乙醇或丙酮中溶解；在 或稀碱溶液；在80%以下乙醇或丙酮中溶解 在90%以上 以下乙醇或丙酮中溶解 以上 乙醇或80%以上丙酮中难溶 以上丙酮中难溶；在乙醚中不溶。 乙醚中不溶。 乙醇或 以上丙酮中难溶 乙醚中不溶
在弱酸性水溶液或混悬在中性缓冲液中较为稳定。 ④ 在弱酸性水溶液或混悬在中性缓冲液中较为稳定。 水溶液中胰岛素分子受pH、温度、 ⑤ 水溶液中胰岛素分子受 、温度、离子强度的影响产生聚 合和解聚现象。在低胰岛素浓度的酸性溶液时呈单体状态。 合和解聚现象。在低胰岛素浓度的酸性溶液时呈单体状态。 锌胰岛素在pH=2的水溶液中呈二聚体，聚合作用随 升 的水溶液中呈二聚体， 锌胰岛素在 的水溶液中呈二聚体 聚合作用随pH升 高而增加， 时聚合成不溶性无定形沉淀。 高浓 高而增加，在pH=4-7时聚合成不溶性无定形沉淀。在高浓 时聚合成不溶性无定形沉淀 度锌的溶液中，pH6～8时胰岛素溶解度急剧下降 ，pH大 度锌 ～ 于9时解聚并由于单体结构改变而失活。