甘蓝型油菜黄籽高含油量育种资源遗传多样性分析二审通过后改

甘蓝型油菜黄籽高含油量育种资源遗传多样性分析范志雄1,2，雷伟侠1，江莹芬1，李强生1，吴新杰1，陈凤祥1，王汉中2（1安徽省农业科学院作物研究所，230031，安徽合肥；2 中国农业科学院油料作物研究所，430062，湖北武汉）摘要以2份白菜型油菜为对照，我们用SRAP标记研究了57份甘蓝型油菜黄籽高油育种资源的遗传关系。

在遗传相似系数0.682处，可将59份材料分为3类：两份白菜型油菜聚为一类；甘蓝型油菜除选系Y58单独聚为一类外，其它所有选系归为另一类，显示黄籽高油育种资源遗传基础较窄。

在遗传相似性系数0.738处，又可将57份甘蓝型油菜分为6个亚类，其中53份材料归为两个大的亚类，系谱或亲缘关系较近的材料一般聚在同一亚类，且按系谱关系比地理来源划分明显，提示地理来源配制强优势黄籽高油杂交组合可靠性可能不如按系谱来源。

关键词甘蓝型油菜黄籽高含油量遗传多样性SRAP标记长期以来，我国油菜育种主要追求单纯的产籽量，对含油量则未予足够重视，导致我国菜籽的平均含油量在过去20年中仅提高了1-2%，占我国油菜生产面积90%的长江流域主产区菜籽含油量长期徘徊在40%左右[1]，而加拿大和欧洲等各国菜籽的含油量可达45％甚至50％。

另一个问题是育种实践中利用的强优势材料一般都是先配制大量杂交组合，再经多年多点比较、鉴定才获得，该育种过程太繁琐耗时[2]。

一般来说，亲本间遗传差异越大，杂种优势越强[3]。

因此，利用分子标记研究高油育种资源间的遗传差异，可为选配高含油量强优势组合提供依据，减少配组合时的盲目性。

由于同一遗传背景甘蓝型油菜黄籽含油量比黑籽高1.52% -4.26%，因此现有甘蓝型油菜高含油量的遗传改良多集中于黄籽育种途径上[4-6]。

然而自然界中并不存在天然的甘蓝型黄籽油菜，目前培育出的黄籽甘蓝型油菜品种黄籽性状来源十分复杂，原始亲本多为白菜型油菜等近缘种，如宁油10号[7]，渝黄1号[8，9]等。

通过田间育种施加一定选-----------------------------------------作者简介：范志雄，博士后在站，从事甘蓝型油菜高含油量分子育种。

陈凤祥，通讯作者，博士后指导老师，研究方向为油菜遗传育种；王汉中，通讯作者，博士后指导老师，研究方向为油菜遗传育种。

基金项目：安徽省自然科学基金（090411021），安徽省农科院院长创新基金（11B0201），“863计划”课题（2011AA10A104）择压（抗逆、高含油量等）获得的黄籽高油育种资源，其遗传基础是否丰富，将直接影响到杂种优势利用的效果。

本研究利用SRAP标记分析了57份甘蓝型油菜黄籽高含油育种资源的亲缘关系和遗传距离，为高油杂交油菜亲本选配和杂种优势预测提供参考。

1材料与方法1．1材料所用甘蓝型油菜选系Y41、Orca、Terra、Campino、Y52-8、Y84、YF406为常规品种或自交系，PolCMS805、PolCMS804和PolCMS1923为温敏型波里马(polima)不育系，人工辅粉自交保存。

Y204是204-F14中发现的黄籽选系；Y204B为Y204两型系（A、B系）用沙网袋人工兄妹交中的可育株系；Y204A为Y204AB制种棚繁时选出的黄籽不育系。

11个Y9012BDH株系为Y9012B高油黄籽株经小孢子培养后获得的双单倍体选系。

其它材料为杂交种（如油研9号5个选系）或杂交组合（包括回交，如Y204A//Y204A/12-12-148）自交分离出的后代。

具体选育过程如下：2007年夏观察收获的5054个甘蓝型油菜单株的粒色，挑出黄籽材料用近红外光谱仪（NIR）分析含油量（以下简称粗测），筛选标准不追求高黄籽度和黄籽率，只需具备黄籽背景即可。

340份粗测含油量≥47%的单株继续用索氏抽提法精测含油量（以下简称精测），每单株测两次重复。

226份精测含油量≥47%的单株继续种植，田间选择按长势好、双低（低芥酸、低硫苷）、抗倒、抗（耐）菌核病、可育株散粉习性好且结实率高等育种标准施加选择压，保留的材料按上述分析方法测定含油量，留下精测含油量≥47%的材料继续下年种植，如此循环，直至2010年经4轮选择后，留下57份高油（≥47%）且总体农艺性状优良的材料构成育种资源谱。

白菜型油菜（Brassica rapa）2份：“关中蔓菁”来自陕西合阳，籽粒棕红色；“巢湖黄籽”来自安徽巢湖，籽粒纯黄且黄籽率达100%。

两份资源自交不亲和，每年手工剥蕾自交保存，粒色遗传稳定。

所有育种资源见表1。

表1 供试材料系谱及来源田间编号材料系谱来源及习性1 Y204B 安徽，冬性2 油研9号F5 贵州，半冬性3油研9号F5贵州，半冬性4油研9号F5贵州，半冬性5油研9号F5贵州，半冬性6Y41浙江，冬性7（Y204A//Y204A/12-148）F5安徽，冬性8(Y204A/12-148) F5安徽，冬性9（Y204A//Y204A/12-148）F5安徽，冬性10(Y204A/12-148）F5安徽，冬性11（Y204A/12-148）F5安徽，冬性12（Y204A//Y204A/12-148）F5安徽，冬性13Y420/宁10B//12-148/204-F14安徽，冬性14（12-148/204-F14//Y204AB）F5安徽，冬性15（Y204A/204-F14) F5安徽，冬性16油85 F5贵州，半冬性177633 F5陕西，冬性187633 F5陕西，冬性19驰丰1号F5陕西，冬性20驰丰1号F5陕西，冬性212005G203 F5不详，半冬性22瑞油1号F5四川，冬性23DH1708 F5陕西，冬性24杂79 F5陕西，冬性253378 F5陕西，冬性26ORCA欧洲，春性27(Y204A/ 204-F14/// Y420/宁10A// 12-148/204-F14) F5安徽，冬性28(Y420/宁10B//12-148/204-F14///12-宁10B) F8安徽，冬性29(Y204A/12-148) F5安徽，冬性30(Y204A/12-148) F5安徽，冬性31（Y420/宁10B//12-148/204-F14）F8安徽，冬性329012A/宁油10号F5安徽/江苏，冬性33Y58 安徽/欧洲，亲本不详，冬性34双低白花安徽，冬性35Terra欧洲，春性36油研9号F5贵州，半冬性37Campino 欧洲，春性38PolCMS 805辅粉湖北，冬性39Y52-8欧洲，春性40Y84欧洲，冬性41Y9012BDH安徽，冬性42Y9012BDH安徽，冬性43Y9012BDH安徽，冬性44Y9012BDH安徽，冬性45Y9012BDH安徽，冬性46Y9012BDH安徽，冬性47Y9012BDH安徽，冬性48Y9012BDH安徽，冬性49Y9012BDH安徽，冬性50Y9012BDH安徽，冬性51Y9012BDH安徽，冬性52YF406安徽，冬性53PolCMS804辅粉湖北，半冬性54YP9012A棚选安徽，冬性55PolCMS1923辅粉湖北，半冬性56Y204A 棚选安徽，冬性5703HF096 F8河南，冬性58巢湖黄籽安徽，白菜型，冬性59关中蔓菁陕西，白菜型，冬性表2SRAP标记的正向引物、反向引物的序列(5’- 3’)及引物对组合正向引物反向引物引物组合Me1 TGAGTCCAAACCGGA TA Em1 GACTGCGTACGAATTA TT Me1/Em1, Me2/Em2,Me2 TGAGTCCAAACCGGAGC Em2 GACTGCGTACGAATTTGC Me3/Em3, Me4/Em4Me3 TGAGTCCAAACCGGAAT Em3 GACTGCGTACGAATTGAC Me5/Em4,Me6/Em5Me4 TGAGTCCAAACCGGACC Em4 GACTGCGTACGAATTAAC Me7/Em6, Me8/Em7Me5 TGAGTCCAAACCGGAAT Em5 AGGCGGTTGTCAATTGAC Me9/Em8, Me10/Em9Me6 TTCAGGGTGGCCGGATG Em6 TGTGGTCCGCAAATTTAG Me11/Em10, Me12/Em11 Me7 TGGGGACAACCCGGCTT Em7 GACTGCGTACGAATTTAT Me13/Em12Me8CTGGCGAACTCCGGATG Em8 GACTGCGTACGAATTTGCMe9 GGTGAACGCTCCGGAAG Em9 GACTGCGTACGAATTGACMe10 AGCGAGCAAGCCGGTGG Em10 GACTGCGTACGAATTTGAMe11GAGCGTCGAACCGGATG Em11 GACTGCGTACGAATTCATMe12TACGACGAATCCGGACT Em12 GACTGCGTACGAATTCTAMe13CACAGTCATGCCGGAAT1、2 基因组DNA提取2010年收获的57份甘蓝型油菜黄籽高油育种资源与2份白菜型油菜种籽置发芽盒中25℃暗培养，取子叶参照CTAB法[10]提取基因组DNA。

纯化后的DNA加适量TE 缓冲液回悬DNA，电泳检测其质量，-20℃储存备用。

1、3 SRAP标记的扩增与检测扩增反应参照Li和Quiros[11]，扩增产物电泳分离与检测参照陆光远等[12]。

Taq DNA聚合酶、dNTPs和DNA Marker购自北京全式金生物技术有限公司。

SRAP引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成，引物及其组合见表2。

1、4 数据统计与分析仅读取100-800bp之间清晰易于识别的条带，有带记为1，无带记为0，缺失记为2。

采用Nei和Li的公式计算相似性系数(GS)和遗传距离(GD) [13]：GSij = 2Nij/(Ni+Nj+Nij) GDij = 1–GSij其中Nij为共有带数, Ni、Nj分别为第i个材料和第j个材料各自的特有条带数。

运用NTSYSpc2.10e软件对数据进行分析，按照非加权成对算术平均法(UPGMA)以相似系数对参试材料进行聚类作图。

2 结果与分析2、1 SRAP标记多态性在所有59份材料中，13对SRAP引物组合全部能扩增出多态性位点，清晰易读的多态性位点达103个，平均每对约8个。

扩出多态性最多的为Me12/Em11引物组合，达13个；最少为Me7/Em6，仅1个多态性位点。

在这103个位点中，甘蓝型油菜能扩出而2份白菜型油菜均未扩出的位点为55个，占53.4%；甘蓝型油菜未能扩出而2份白菜型油菜均能扩出的位点为2个，提示这2个位点可能为白菜型油菜A基因组所特有。