DNA电泳实验报告 杨家庆

浙江农林大学

实验室开放项目

DNA和蛋白质的电泳技术

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班级：测绘工程151班

学号：************

指导老师：***

完成时间：2016 年11月23日

一、实验名称：DNA的电泳技术

二、实验目的：琼脂糖凝胶电泳是常用的检测核酸的方法，学习DNA 琼脂糖凝胶电泳的使用技术，掌握有关的技术和识读电泳图谱的方法。

三、实验原理：琼脂糖凝胶电泳是常用的用于分离、鉴定DNA、RNA 分子混合物的方法，这种电泳方法以琼脂凝胶作为支持物，利用DNA分子在泳动时的电荷效应和分子筛效应，达到分离混合物的目的。DNA分子在高于其等电点的溶液中带负电，在电场中向阳极移动。在一定的电场强度下，DNA分子的迁移速度取决于分子筛效应，即分子本身的大小和构型是主要的影响因素。DNA分子的迁移速度与其相对分子量成反比。不同构型的DNA分子的迁移速度不同。

四、实验器材：

仪器：制胶模具、电泳槽、电泳仪、烧杯、锥形瓶、移液枪、手套、微波炉、凝胶成像仪、分析天平、钥匙、离心机、紫外线透射仪、干式恒温器等。

试剂：琼脂糖（白色粉末）、TAE缓冲液、EB（溴化乙锭-致癌剂，操作中要严格戴手套）；

五、实验步骤：

（一）DNA电泳实验

1.模板胶的制作：

①.称取1g琼脂糖加入盛有100mL的1*TAE溶液中，混合均匀后用微波炉加热至沸腾，加热2-3次，每次沸腾之后取出摇匀，直至混合均匀；

②.待溶液冷却至40-50℃时，倒入制胶模具内（注意要快速倒入，以防倒入的过程中溶液凝胶），凝固后，上DNA样品；

③.上样后，将模具移入电泳槽，将样品端上到负极，通电，恒压120V，25-30min；

④.将胶移入凝胶成像仪，用紫外光观察，拍照存档，保存图片；

⑤.清理实验相关物品，整理实验器材，实验结束。

2.DNA凝胶回收：

①.称量凝胶重量，按质量：体积=1:1换算，再按凝胶：Buffer G=1:3加入3倍的Buffer G溶液放入干湿恒温机中加热融化；

②.将溶液转入2ml离心管中，离心30s（13200rmp/min）；

③.在离心管中再加入500微升的Buffer WS溶液，离心30s；

④.加入700微升的WG溶液，离心30s；

⑤.离心结束后，倒掉废液，将空的离心管放入离心机空转30s或1min，将DNA中的残留液体甩干净；

⑥．离心结束后，将含有DNA的薄片快速取出（为防止剩余的酒精再次挥发进入）；

⑦.在放置DNA薄片的离心管中加入20微升的水（水要从中间加入，打在DNA薄片上，待DNA溶于水），静置1min，离心；

⑧．清理实验相关物品，整理实验器材，实验结束。

3.凝胶回收后DNA片段的电泳：

①.将胶从凝胶成像仪中取出，在相对黑暗的条件下用紫外光照射，看到清晰地六条条带之后，将相应的条带逐条切下（切的时候尽可能

薄，每个条带的重量不要超过0.3g），做凝胶回收，得到相应的DNA 分子；

②．重复制胶过程，在得到的模具中重复上样过程，在第一个孔内上标准DNA样品，其余孔内加入相应波长DNA样品；

③.上样后，将模具移入电泳槽，将样品端上到负极，通电，恒压120V，25-30min；

④.将胶移入凝胶成像仪，用紫外光观察，拍照存档，保存图片；

⑤.清理实验相关物品，整理实验器材，实验结束。

（二）PCR（Polymerase chain reaction,聚合酶链式反应）实验：１、配置反应所需试剂：反应体系为20微升，首先加入14微升水，然后依次加入2微升10*Ｂ（buffer）、0.8微升DNTPs（四种脱氧核苷酸混合物）、１微升cDNA（模板DNA）、１微升引物１、1微升引物２（引物1、２方向相反）、以及0.2微升Taq（DNA聚合酶）；

２、溶液配置好之后，对溶液溶液进行预变性处理，条件95℃，时间2-5min；

３、预处理过后，进行变性操作，条件94℃，时间30ｓ，之后，进行退活，条件58℃时间30s，然后延长反应，72℃、30ｓ；

４、重复步骤３，共循环35次；

５、循环过程结束，在72℃下保存８min；

６、制作琼脂糖凝胶，将样品与５微升loading buffer溶液混合，上样，进行电泳；

７、将胶移入凝胶成像仪，用紫外光观察，拍照存档，保存图片；

８、清理实验相关物品，整理实验器材，实验结束。

六、实验结果：

标准DNA上样后成像为（如下左图）：从上到下六条分带分别代表不同大小的DNA分子片段，带的粗细表现该片段的含量的多少，如图，从上到下每个条带一次对应的DNA分子片段的大小为:2000bp、

1000bp、750bp、500bp、250bp、100bp。凝胶回收后，各个不同片段的条带与MARKER带的对比成像为（如下右图），其中，最亮的条带对应的DNA量是150ng,其余的均为50ng

PCR实验结果成图为

七、结果讨论:

影响实验结果的因素有：

1.实验过程中仪器操作不当；

2.实验过程中液体漏加或加错；

3.电泳时电场强度以及电泳液的导电性能的影响；

4.实验中所需溶液不同浓度所带来的影响；

5.上样时在注入样品的过程中没有成功注入；

6.凝胶成像仪使用不当等。

八、实验感想和建议:

1.通过一学期的实验，我越发的明白实验操作对于结果的重要性。实验操作可以说是实验成功与否的关键部分，可是马虎不得。对于需要团队合作的实验，个人认为要有强势的人员搭档，不说是精通实验操作规程，最少也得知道实验的基本操作，掌握要做实验的操作方法，这对于后续的实验无疑是与决定性作用的。对于个人的实验能力，关键还是要看平时的积累，有些实验操作繁琐复杂，需要极大的耐心，这些都应该是逐渐培养起来的。

2.通过这次实验的学习，使我学到了不少实用的知识,更重要的是,做实验的过程,思考问题的方法,这与做其他的实验是通用的，加强了我的动手能力，并且培养了我的独立思考能力，使我受益匪浅.

3.通过这次实验的学习，我学到了很多，得到了很多，有些是书本上学不到的，只有自己参与了，操作了，才会知道。也要感谢老师对我们的照顾。