自由基损伤学说及抗氧化剂
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5
Impact Factor Distributions
• IF>10.0 = 102 journals (1.6%) Elite • IF>5.0 = 228 journals (3.6%) Excellent • IF>3.0 = 597 journals (9.3%) Very Good • IF>2.0 = 869 journals (13.5%) Good • IF>1.0 = 2,020 journals (31.5%) Fair • IF<1.0 = 2,601 journals (40.5%) Poor
28
Role of ROS in EGF ReceptorMediated Signalling
29
MAPK信号级联反应
Stimulus MAPKKK
Growth factors, Mitogen, GPCR
Stress, GPCR, Inflammatory cytokines, Growth factors
以碳、氧、氮或硫原子为中心的自由基
11
活 性 氧（ROS）
O2·- SOD H2O2
Cat OH·
活 性 氮（RNS）
NO. + O2·- → ONOO-
过氧亚硝基阴离子
12
超氧阴离子 (O2·-)
化学性质：O2·-在细胞内可直接导致DNA损伤 ，并可使过氧化氢酶、谷胱甘肽过氧化物酶和 肌酸激酶失活，其细胞毒性作用主要通过衍生 产生H2O2和OH·。
37
Determination of ROS by DCFH-DA Staining
Br J Pharmacol. 2008;154(1):10358-13.
39
40
41
影响自由基的药物
43
影响自由基的药物
一． 抗氧化药物 二． 促氧化药物“以毒攻毒”
44
抗氧化药物
① 维生素类及内源性物质，如维生素E、维生素C、维 生素A、GSH等；
48
Stress, Growth factors, Mitogen, GPCR
Raf, Mos, Tpl2
MLK3, TAK, DLK
MEKK1, 4, MLK3, ASK1
MEKK2, 3, Tpl2
MAPKK
MEK1/2
MKK3/6
MKK4/7
MEK5
MAPK
Biological responses
Harman, D. J. Gerontol. 1956; 11: 298-300
氧化应激是由于氧自由基过量生成和(或) 细胞内抗氧化防御系统受损,导致氧自由基 及其相关代谢产物过量聚集, 从而对细胞产 生多种毒性作用的病理状态。
3
生成增加，消除减少
Physiol Rev. 2002; 82: 47–495.
Journals of impact factor
• Free Radical Biology & Medicine
(IF=5.423)
• Free Radical Res
(IF=2.878)
• Antioxid Redox Signal
(IF=8.456)
• Redox Report
(IF=1.732)
Mn-SOD (Mitochondria)
Cu/Zn-SOD (Cytosol)
Βιβλιοθήκη Baidu
GSH-Px (Mitochondria)
Catalase (Peroxosome)
O2.-
Cl- + H2O2
MPO
OH.
H2O+O2
Fenton reaction (Fe or Cu)
17
机体对自由基的防御
18
19
ERK1/2
p38 MAPK
JNK1,2,3
ERK5/BMK1
Growth, Differentiation, Development
Inflammation, Apoptosis, Growth, Differentiation
Growth, Differentiation, Development
45
46
促氧化药物
① 化学性直接产生自由基及活性氧； ② 通过作用于机体防御机制，促进机体内自
由基、活性氧产生。巨噬细胞、中性粒细 胞在对侵入机体的抗原通过吞噬作用而进 行消化分解的同时，产生超氧化物、过氧 化物以破坏抗原。
47
促氧化药物
莫特沙芬进入机体后可选择性定位并在癌细胞 中蓄积，破坏细胞代谢，产生ROS并促使细胞 凋亡。临床前研究显示莫特沙芬可加强放疗及 几种常用化疗药的疗效。
引起管壁增厚变硬、失去弹性和管腔缩小。
22
23
氧化应激与动脉粥样硬化
ATVB. 2005;25:2294-38.
NADPH氧化酶与动脉粥样硬化
AngII
Thrombin
PDGF
TNF-α
AT1 Receptor
NADPH Oxidase Acitvity
O2.-
AT1 Receptor Antagnoist
活性氧包括以自由基形式存在和不以自 由基形式存在的具有高活性的中间产物。
O2·- SOD H2O2
活性氧自由基
Cat OH·
GPX 活性氧自由基9
常见自由基的 理化性质
10
常见自由基
活性氧
（Reactive Oxygen Species, ROS）
活性氮
（Reactive Nitrogen Species，RNS）
自由基的检测
31
化学发光法
检测原理：活性氧、氧自由基与发光增效剂反应，释 放能量，产生化学发光。 检测对象：超氧阴离子、羟自由基、H2O2 和脂质过氧 化产生的自由基都可以产生化学发光。 优点：灵敏、快速、操作简单、价格低廉。 缺点：非特异性。另外，几乎所有的氧化剂，如次氯 酸、高锰酸钾等都可以与发光增效剂反应，产生化学 发光，严重干扰活性氧的检测。Fe2+也可以产生非常 强的化学发光。
自由基损伤学说及抗氧化剂
周四桂 广东药学院药理系
1
铁器在空气中暴露日久会生锈，洁白 的银器也会由于氧化变黑。人的机体与 金属一样也会受到氧化而导致“生锈”， 罪魁就是自由基。
2
1956 年英国分子生物学家Harman 首次提出： “氧化应激决定寿命”，即自由基衰老学说， 认为衰老是自由基引起的组织随机毒害的结果。
From a total of 6,417 SCI indexed journals as of March, 2008 6
自由基的概念
7
自由基（Free radicals）
是指外层电子轨道带有一个或多个未成 对电子的分子、原子、离子或者基团。
8
活性氧（ROS）
是指分子氧在还原过程中的一系列中间 产物。
氧化应激与心血管疾病
20
在生理情况下活性氧可维持在极低水平， 参与机体生长发育的调控，信号转导、诱导增 殖与分化、诱导凋亡，调节运动等多种生理过 程，在生物体内发挥着重要的功能。
生成增加，消除减少
机体损伤
21
动脉粥样硬化
• 是动脉硬化性血管病中最常见的一种。 • 动脉内膜积聚的脂质外观呈黄色粥样。
Circulation. 2008;117:1045-314054.
Lucigenin (光泽精)-Enhanced Chemiluminescence
检测原理：在碱性条件下，光泽精与超氧阴 离子等过氧化物作用形成激发态N2甲基吖啶 (N2methylacridan) 。并发出450nm的激发 光，测量此激发光的强度即可定量产生的超 氧阴离子的浓度。可以定量，但检测时间长， 并需要新鲜组织样本。
② 活性氧防御酶类，如SOD、过氧化氢酶、过氧化物 酶、Co-Q类等；
③ 化合物，如SOD模拟化合物、普罗布考以及一些传 统药物如硫酸锌、甘露醇、钙拮抗药、血管紧张素 转化酶抑制药、肼肽嗪、乙酰半胱氨酸、β2受体激 动药及阻断药等；
④ 中药及其有效成分，如银杏、丹参、云芝及其所含
的黄酮类、酚类、多糖类等.
化学性质：OH·是已知活性最强的氧化剂，化 学性质极为活泼，几乎可以与所有细胞成分 发生反应，对机体危害极大。但是由于其作 用范围小，仅能与它的邻近的分子反应。
清除：主要通过抗坏血酸、GSH（或其他的 硫醇）、褪黑色素、NADPH等活性物质及细 胞色素P450体系降解和清除。
15
过氧亚硝基阴离子（ONOO-）
35
Determination of ROS by Lucigenin-Enhanced Chemiluminescence
36
2’, 7’-二氢二氯荧光黄双乙酸钠(DCFH-DA)
检测原理：DCFH-DA本身没有荧光，可以自由 穿过细胞膜，进入细胞内后，可以被细胞内的酯 酶水解生成DCFH。而DCFH不能通透细胞膜， 从而使探针很容易被装载到细胞内。细胞内的活 性氧可以氧化无荧光的DCFH生成有荧光的DCF， 检测DCF的荧光就可以得到细胞内活性氧的水平。
Lack of p47phox
25
氧化应激与高血压
26
自由基的信号转导途径
27
氧自由基参与信号转导通路
EGF Receptor Protein Tyrosine Phosphatases Insulin Receptor Kinase Activity Cytoplasmic Protein Kinases MAPK Cascades Protein Kinase C Isoforms Cytosolic Ca2+ Concentrations Transcription Factor
清除：细胞内有SOD起清除作用。
13
过氧化氢 (H2O2)
“长效”“稳定”
化学性质：H2O2的性质较稳定，半衰期最长 ，可以穿透大部分细胞膜，因而可以发挥重要 的信使功能，但这一特性也增加了其细胞毒作 用。 清除：H2O2在体内可经过氧化氢酶作用降解 为水和氧气。
14
羟自由基 (OH·)
“寿命短”“稳定差”
化学性质：ONOO-作为一种强氧化剂， 可以介导蛋白巯基和非蛋白巯基的氧化， 并可氧化细胞膜脂、蛋白及DNA，导致细 胞损伤和疾病的发生或介导信号转导。
降解：在碱性条件下，ONOO-比较稳定 。一旦质子化，立即分解产生类羟基和 NO2自由基。
16
eNOS
L-arginine NO.
ONNOH
ONNO. ONNO.+H+
32
二氢乙啶(Dihydroethidium, DHE)
检测原理：可自由透过活细胞膜进入细胞内， 并被细胞内的超氧阴离子氧化，形成氧化乙啶； 氧化乙啶可掺入染色体DNA中，产生红色荧光。 用流式细胞仪或荧光显微镜可直接观察，是一种 快速简便的组织或培养活细胞中ROS经典检测方 法。
33
Determination of ROS by DHE Staining
Impact Factor Distributions
• IF>10.0 = 102 journals (1.6%) Elite • IF>5.0 = 228 journals (3.6%) Excellent • IF>3.0 = 597 journals (9.3%) Very Good • IF>2.0 = 869 journals (13.5%) Good • IF>1.0 = 2,020 journals (31.5%) Fair • IF<1.0 = 2,601 journals (40.5%) Poor
28
Role of ROS in EGF ReceptorMediated Signalling
29
MAPK信号级联反应
Stimulus MAPKKK
Growth factors, Mitogen, GPCR
Stress, GPCR, Inflammatory cytokines, Growth factors
以碳、氧、氮或硫原子为中心的自由基
11
活 性 氧（ROS）
O2·- SOD H2O2
Cat OH·
活 性 氮（RNS）
NO. + O2·- → ONOO-
过氧亚硝基阴离子
12
超氧阴离子 (O2·-)
化学性质：O2·-在细胞内可直接导致DNA损伤 ，并可使过氧化氢酶、谷胱甘肽过氧化物酶和 肌酸激酶失活，其细胞毒性作用主要通过衍生 产生H2O2和OH·。
37
Determination of ROS by DCFH-DA Staining
Br J Pharmacol. 2008;154(1):10358-13.
39
40
41
影响自由基的药物
43
影响自由基的药物
一． 抗氧化药物 二． 促氧化药物“以毒攻毒”
44
抗氧化药物
① 维生素类及内源性物质，如维生素E、维生素C、维 生素A、GSH等；
48
Stress, Growth factors, Mitogen, GPCR
Raf, Mos, Tpl2
MLK3, TAK, DLK
MEKK1, 4, MLK3, ASK1
MEKK2, 3, Tpl2
MAPKK
MEK1/2
MKK3/6
MKK4/7
MEK5
MAPK
Biological responses
Harman, D. J. Gerontol. 1956; 11: 298-300
氧化应激是由于氧自由基过量生成和(或) 细胞内抗氧化防御系统受损,导致氧自由基 及其相关代谢产物过量聚集, 从而对细胞产 生多种毒性作用的病理状态。
3
生成增加，消除减少
Physiol Rev. 2002; 82: 47–495.
Journals of impact factor
• Free Radical Biology & Medicine
(IF=5.423)
• Free Radical Res
(IF=2.878)
• Antioxid Redox Signal
(IF=8.456)
• Redox Report
(IF=1.732)
Mn-SOD (Mitochondria)
Cu/Zn-SOD (Cytosol)
Βιβλιοθήκη Baidu
GSH-Px (Mitochondria)
Catalase (Peroxosome)
O2.-
Cl- + H2O2
MPO
OH.
H2O+O2
Fenton reaction (Fe or Cu)
17
机体对自由基的防御
18
19
ERK1/2
p38 MAPK
JNK1,2,3
ERK5/BMK1
Growth, Differentiation, Development
Inflammation, Apoptosis, Growth, Differentiation
Growth, Differentiation, Development
45
46
促氧化药物
① 化学性直接产生自由基及活性氧； ② 通过作用于机体防御机制，促进机体内自
由基、活性氧产生。巨噬细胞、中性粒细 胞在对侵入机体的抗原通过吞噬作用而进 行消化分解的同时，产生超氧化物、过氧 化物以破坏抗原。
47
促氧化药物
莫特沙芬进入机体后可选择性定位并在癌细胞 中蓄积，破坏细胞代谢，产生ROS并促使细胞 凋亡。临床前研究显示莫特沙芬可加强放疗及 几种常用化疗药的疗效。
引起管壁增厚变硬、失去弹性和管腔缩小。
22
23
氧化应激与动脉粥样硬化
ATVB. 2005;25:2294-38.
NADPH氧化酶与动脉粥样硬化
AngII
Thrombin
PDGF
TNF-α
AT1 Receptor
NADPH Oxidase Acitvity
O2.-
AT1 Receptor Antagnoist
活性氧包括以自由基形式存在和不以自 由基形式存在的具有高活性的中间产物。
O2·- SOD H2O2
活性氧自由基
Cat OH·
GPX 活性氧自由基9
常见自由基的 理化性质
10
常见自由基
活性氧
（Reactive Oxygen Species, ROS）
活性氮
（Reactive Nitrogen Species，RNS）
自由基的检测
31
化学发光法
检测原理：活性氧、氧自由基与发光增效剂反应，释 放能量，产生化学发光。 检测对象：超氧阴离子、羟自由基、H2O2 和脂质过氧 化产生的自由基都可以产生化学发光。 优点：灵敏、快速、操作简单、价格低廉。 缺点：非特异性。另外，几乎所有的氧化剂，如次氯 酸、高锰酸钾等都可以与发光增效剂反应，产生化学 发光，严重干扰活性氧的检测。Fe2+也可以产生非常 强的化学发光。
自由基损伤学说及抗氧化剂
周四桂 广东药学院药理系
1
铁器在空气中暴露日久会生锈，洁白 的银器也会由于氧化变黑。人的机体与 金属一样也会受到氧化而导致“生锈”， 罪魁就是自由基。
2
1956 年英国分子生物学家Harman 首次提出： “氧化应激决定寿命”，即自由基衰老学说， 认为衰老是自由基引起的组织随机毒害的结果。
From a total of 6,417 SCI indexed journals as of March, 2008 6
自由基的概念
7
自由基（Free radicals）
是指外层电子轨道带有一个或多个未成 对电子的分子、原子、离子或者基团。
8
活性氧（ROS）
是指分子氧在还原过程中的一系列中间 产物。
氧化应激与心血管疾病
20
在生理情况下活性氧可维持在极低水平， 参与机体生长发育的调控，信号转导、诱导增 殖与分化、诱导凋亡，调节运动等多种生理过 程，在生物体内发挥着重要的功能。
生成增加，消除减少
机体损伤
21
动脉粥样硬化
• 是动脉硬化性血管病中最常见的一种。 • 动脉内膜积聚的脂质外观呈黄色粥样。
Circulation. 2008;117:1045-314054.
Lucigenin (光泽精)-Enhanced Chemiluminescence
检测原理：在碱性条件下，光泽精与超氧阴 离子等过氧化物作用形成激发态N2甲基吖啶 (N2methylacridan) 。并发出450nm的激发 光，测量此激发光的强度即可定量产生的超 氧阴离子的浓度。可以定量，但检测时间长， 并需要新鲜组织样本。
② 活性氧防御酶类，如SOD、过氧化氢酶、过氧化物 酶、Co-Q类等；
③ 化合物，如SOD模拟化合物、普罗布考以及一些传 统药物如硫酸锌、甘露醇、钙拮抗药、血管紧张素 转化酶抑制药、肼肽嗪、乙酰半胱氨酸、β2受体激 动药及阻断药等；
④ 中药及其有效成分，如银杏、丹参、云芝及其所含
的黄酮类、酚类、多糖类等.
化学性质：OH·是已知活性最强的氧化剂，化 学性质极为活泼，几乎可以与所有细胞成分 发生反应，对机体危害极大。但是由于其作 用范围小，仅能与它的邻近的分子反应。
清除：主要通过抗坏血酸、GSH（或其他的 硫醇）、褪黑色素、NADPH等活性物质及细 胞色素P450体系降解和清除。
15
过氧亚硝基阴离子（ONOO-）
35
Determination of ROS by Lucigenin-Enhanced Chemiluminescence
36
2’, 7’-二氢二氯荧光黄双乙酸钠(DCFH-DA)
检测原理：DCFH-DA本身没有荧光，可以自由 穿过细胞膜，进入细胞内后，可以被细胞内的酯 酶水解生成DCFH。而DCFH不能通透细胞膜， 从而使探针很容易被装载到细胞内。细胞内的活 性氧可以氧化无荧光的DCFH生成有荧光的DCF， 检测DCF的荧光就可以得到细胞内活性氧的水平。
Lack of p47phox
25
氧化应激与高血压
26
自由基的信号转导途径
27
氧自由基参与信号转导通路
EGF Receptor Protein Tyrosine Phosphatases Insulin Receptor Kinase Activity Cytoplasmic Protein Kinases MAPK Cascades Protein Kinase C Isoforms Cytosolic Ca2+ Concentrations Transcription Factor
清除：细胞内有SOD起清除作用。
13
过氧化氢 (H2O2)
“长效”“稳定”
化学性质：H2O2的性质较稳定，半衰期最长 ，可以穿透大部分细胞膜，因而可以发挥重要 的信使功能，但这一特性也增加了其细胞毒作 用。 清除：H2O2在体内可经过氧化氢酶作用降解 为水和氧气。
14
羟自由基 (OH·)
“寿命短”“稳定差”
化学性质：ONOO-作为一种强氧化剂， 可以介导蛋白巯基和非蛋白巯基的氧化， 并可氧化细胞膜脂、蛋白及DNA，导致细 胞损伤和疾病的发生或介导信号转导。
降解：在碱性条件下，ONOO-比较稳定 。一旦质子化，立即分解产生类羟基和 NO2自由基。
16
eNOS
L-arginine NO.
ONNOH
ONNO. ONNO.+H+
32
二氢乙啶(Dihydroethidium, DHE)
检测原理：可自由透过活细胞膜进入细胞内， 并被细胞内的超氧阴离子氧化，形成氧化乙啶； 氧化乙啶可掺入染色体DNA中，产生红色荧光。 用流式细胞仪或荧光显微镜可直接观察，是一种 快速简便的组织或培养活细胞中ROS经典检测方 法。
33
Determination of ROS by DHE Staining