噬菌体展示技术的原理及其应用-35页PPT资料
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7
M13噬菌体的生活史
其裂解周期为：
1)吸附(adsorption)
2)侵入(entory)
3)复制（生物合成biosynthesis）
4)成熟(maturation)
5)装配(assembly)
6)释放(release)
8
丝状噬菌体的基因及蛋白结构
• pIII (406aa, 5~8copies)
洗脱未结合 的噬菌体
铺盘分离单个克隆 测序分析插入序列
验证实验： 结合实验
16
Solid phase selection with immunotubes
Immunotube coated with antigen
coated with steptavidin and biotinylated antigen B
12
选择方法：
淘选（Panning)
而不是
筛选（Screening)
13
非展示系统
展示系统
14
淘选系统 淘选方法
固相 完整细胞
组织，器官
常规法 正负法 竞争法
15
实验流程
T7
噬 菌 体 展 示 筛 选 系 统
铺富集文库
将噬菌体文库铺在固定 的靶蛋白上
3~4轮筛选
加入大肠杆菌，扩增和 富集洗脱的噬菌体
概述
噬菌体展示技术（Phage Display techniques，
PDT）起源于1985年，是一种用于筛选和改造功能性多 肽、蛋白质强有力的生物技术，广泛应用于蛋白组学、 基因克隆等多个分子生物学领域。
目前噬菌体展示技术的研究进展非常迅速，在抗原 决定簇的定位、蛋白质相互作用位点的确定、特异调节 分子的分离和人工抗体和疫苗的制备、诊断技术、酶抑 制剂的研究开发、多肽药物的研制等生物技术研究的不 同领域得到了应用，并对这些领域产生了深远的影响。
2
基本原理
噬菌体展示技术是将外源蛋 白或多肽的DNA序列插入到噬 菌体外壳蛋白结构基因的适当 位置，使外源基因随外壳蛋白 的表达而表达，同时，外源蛋 白随噬菌体的重新组装而展示 到噬菌体表面的生物技术。到 目前为止，人们已开发出了单 链丝状噬菌体展示系统、λ噬菌 体展示系统、T4噬菌体展示系 统等数种噬菌体展示系统。
3
特点
该技术的主要特点是将特定分子的基因型和表型统一在 同一病毒颗粒内，即在噬菌体表面展示特定蛋白质，而在噬 菌体核心DNA中则含有该蛋白的结构基因。另外，这项技术 把基因表达产物与亲和筛选结合起来，可以利用适当的靶蛋 白将目的蛋白或多肽挑选出来。
4
Phages
•Filamentous phages
v v
B
B
B
BB
B
17
Bind to Streptavidin
coated microtitre wells
18
Wash to remove unbound phage particles
19
Elute bound phage
20
Amplify eluted phage
Repeat sBaidu Nhomakorabealection
without cell killing or lysis (lysogenic phage)
6
M13 噬菌体颗粒结构
(a) Adenovirus. (b) Rotavirus. (c) Influenza virus (courtesy of George Leser). (d) Vesicular stomatitis virus. (e) Tobacco mosaic virus. (f) Alfalfa mosaic virus. (g) T4 bacteriophage. (h) M13 bacteriophage.
11
实验设计思路
• Used for cloning foreign genes among other applications
• Proteins and peptides are fused to the Capsid (surface) of the phage
• The combination of the phage and peptide is known as a Fusion Protein
1
1985年Smith首次通过基因工程的手段，将外源基因 插入丝状噬菌体基因组中，从而使表达的外源肽或蛋白与 噬菌体外壳蛋白一起展示在噬菌体表面，由此建立了噬菌 体展示技术。
Smith GP. Filamentous fusion phage : novel expression vectors that display cloned antigens on the virion surface. Science, 1985, 228: 1315 - 1317.
Analyze
a) ELISA b) Specificity c) Sequencing d) Affinity e) Activity
感染 和扩增
E.coli
• pVIII (50aa, ~2700 copies) • pVI (112aa, 5~8copies)
scielo.br/scielo.php?pid=S1415-47572019000100001&script=sci_arttext
9
载体的插入位点
10
pIII 和pVIII 噬菌体展示系统
1990年Scott等首次将随机序列肽与丝状噬菌体表面蛋 白g 融合展示在噬菌体表面，建立了噬菌体展示随机肽库。
Scott J K, Smit h GP. Searching for peptide ligands with an epitope library. Science, 1990, 249: 386.
➢M13 ➢Fd ➢F1
• Others
➢T4 ➢λ
5
Filamentous phages
Infect many gram-negative bacteria Circular single stranded DNA genome About 6.4kb.p. Long, flexible tube structure about 1µm long and 6.5nm in diameter Reproduced and secreted from infected bacteria
M13噬菌体的生活史
其裂解周期为：
1)吸附(adsorption)
2)侵入(entory)
3)复制（生物合成biosynthesis）
4)成熟(maturation)
5)装配(assembly)
6)释放(release)
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丝状噬菌体的基因及蛋白结构
• pIII (406aa, 5~8copies)
洗脱未结合 的噬菌体
铺盘分离单个克隆 测序分析插入序列
验证实验： 结合实验
16
Solid phase selection with immunotubes
Immunotube coated with antigen
coated with steptavidin and biotinylated antigen B
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选择方法：
淘选（Panning)
而不是
筛选（Screening)
13
非展示系统
展示系统
14
淘选系统 淘选方法
固相 完整细胞
组织，器官
常规法 正负法 竞争法
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实验流程
T7
噬 菌 体 展 示 筛 选 系 统
铺富集文库
将噬菌体文库铺在固定 的靶蛋白上
3~4轮筛选
加入大肠杆菌，扩增和 富集洗脱的噬菌体
概述
噬菌体展示技术（Phage Display techniques，
PDT）起源于1985年，是一种用于筛选和改造功能性多 肽、蛋白质强有力的生物技术，广泛应用于蛋白组学、 基因克隆等多个分子生物学领域。
目前噬菌体展示技术的研究进展非常迅速，在抗原 决定簇的定位、蛋白质相互作用位点的确定、特异调节 分子的分离和人工抗体和疫苗的制备、诊断技术、酶抑 制剂的研究开发、多肽药物的研制等生物技术研究的不 同领域得到了应用，并对这些领域产生了深远的影响。
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基本原理
噬菌体展示技术是将外源蛋 白或多肽的DNA序列插入到噬 菌体外壳蛋白结构基因的适当 位置，使外源基因随外壳蛋白 的表达而表达，同时，外源蛋 白随噬菌体的重新组装而展示 到噬菌体表面的生物技术。到 目前为止，人们已开发出了单 链丝状噬菌体展示系统、λ噬菌 体展示系统、T4噬菌体展示系 统等数种噬菌体展示系统。
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特点
该技术的主要特点是将特定分子的基因型和表型统一在 同一病毒颗粒内，即在噬菌体表面展示特定蛋白质，而在噬 菌体核心DNA中则含有该蛋白的结构基因。另外，这项技术 把基因表达产物与亲和筛选结合起来，可以利用适当的靶蛋 白将目的蛋白或多肽挑选出来。
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Phages
•Filamentous phages
v v
B
B
B
BB
B
17
Bind to Streptavidin
coated microtitre wells
18
Wash to remove unbound phage particles
19
Elute bound phage
20
Amplify eluted phage
Repeat sBaidu Nhomakorabealection
without cell killing or lysis (lysogenic phage)
6
M13 噬菌体颗粒结构
(a) Adenovirus. (b) Rotavirus. (c) Influenza virus (courtesy of George Leser). (d) Vesicular stomatitis virus. (e) Tobacco mosaic virus. (f) Alfalfa mosaic virus. (g) T4 bacteriophage. (h) M13 bacteriophage.
11
实验设计思路
• Used for cloning foreign genes among other applications
• Proteins and peptides are fused to the Capsid (surface) of the phage
• The combination of the phage and peptide is known as a Fusion Protein
1
1985年Smith首次通过基因工程的手段，将外源基因 插入丝状噬菌体基因组中，从而使表达的外源肽或蛋白与 噬菌体外壳蛋白一起展示在噬菌体表面，由此建立了噬菌 体展示技术。
Smith GP. Filamentous fusion phage : novel expression vectors that display cloned antigens on the virion surface. Science, 1985, 228: 1315 - 1317.
Analyze
a) ELISA b) Specificity c) Sequencing d) Affinity e) Activity
感染 和扩增
E.coli
• pVIII (50aa, ~2700 copies) • pVI (112aa, 5~8copies)
scielo.br/scielo.php?pid=S1415-47572019000100001&script=sci_arttext
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载体的插入位点
10
pIII 和pVIII 噬菌体展示系统
1990年Scott等首次将随机序列肽与丝状噬菌体表面蛋 白g 融合展示在噬菌体表面，建立了噬菌体展示随机肽库。
Scott J K, Smit h GP. Searching for peptide ligands with an epitope library. Science, 1990, 249: 386.
➢M13 ➢Fd ➢F1
• Others
➢T4 ➢λ
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Filamentous phages
Infect many gram-negative bacteria Circular single stranded DNA genome About 6.4kb.p. Long, flexible tube structure about 1µm long and 6.5nm in diameter Reproduced and secreted from infected bacteria