链霉菌基因 bacB 和 bacC 的克隆和两者间的关系文献翻译

基因bacB和bacC的克隆和两者间的关系, bacB和bacC是链霉菌

Streptomyces sp. TÜ4128 中参与抗生素bagremycin的生物合成中两个

协同转录的基因.

摘要: 由链霉菌Streptomyces sp. TÜ4128生产的抗生素bagremycin A 和bagremycin B , 对人腺癌细胞[1][2]显示抗肿瘤活性.为了阐明bagremycins 的生物合成途径, 从bagremycin-生产菌株中克隆到了两个名为：bagB和bagC基因, 并分析了两者的关系. bagB和bagC 诱导表达蛋白展示了分别同醛缩酶和3-脱氢硫胺素合成酶有很高的序列同源性.

bagC 紧跟随在bagB 的下游位置, 并且随后的反转录和PCR分析发现两个基因是协同转录. BagB和bacC 两个任意一个沉默,都会使得发酵培养基中完全回收不到抗生素bagremycins , 这证明了两个基因都掺与了抗生素bagremycin的生物合成. 从本次的研究中, 获得了抗生素bagremycins整个生物合成簇基因, 近一步加深了我们对生物合成途径的理解以及bagremycins的活性机制.

关键词：Bagremycin ，醛缩酶，3-脱氢硫胺素，Streptomyces sp. TÜ4128

抗生素bagremycin A 和bagremycin B 是Streptomyces sp. TÜ4128生产的两种新型的-香豆酸衍生物, 对人腺癌细胞[1][2]显示抗肿瘤活性. Bagremycin A显示出对真菌病原菌: 白色念珠菌Candida albicans有活性, 而bagremycin B对病原体: 葡萄孢属-（脑脊髓）灰质炎病原体Botrytis cinerea[1][2]有直接活性。因此，抗生素bagremycins 在未来的医药和农业应用中具有潜在的价值。用X-射线和NMR光谱测量分析确定了bagremycin A 和bagremycin B的结构分别是：4-乙烯基·苯基醚-3-氨基-4-羟苯酸酯，4-乙烯基·苯基醚-3-N-乙酰基-4-羟苯酸酯，如图一[1][2]所示。

依据bagremycin A的结构，我们可以推测出bagremycin A 可能衍生于对-香豆酸和3-氨基-4-羟苯酸（3，4-AHBA）缩和反应产物的，在紧接着乙酰化反应就可以从bagremycin A得到bagremycin B （图一）。3，4-AHBA---Streptomyces生产的许多代谢物的前体物---很可能是由醛缩酶和3-脱氢硫胺素（DHQ）合成酶[15]共同催化L-天冬氨酸-4-半醛（ASA）和二羟基丙酮磷酸（DHQ）发生缩和反应所得产物。从Streptomyces griseus[15]克隆到负责上面所述及的反应的griI 和griH两个基因，并分析了两个基因在grixazone 生物合成途径中的关系。同时，3，4-AHBA又是4-羟基-3-亚硝基苯甲酰胺（4,3HNBAm)的前体物，是在Streptomyces murayamaensis[13]中由两个蛋白NspI 和NspH 催化产生。由此，我们可以猜测到，编码醛缩酶和3-脱氢硫胺素合酶的基因同样存在于bagremycins生物合成途径中。

在许多种微生物中，同样也发现了包含醛缩酶和3-脱氢硫胺素合酶的其它生物合成途径。经典的莽草酸生物合成通路包含7步酶促反应，并且普遍存在于各种各样的微生物生物合成芳香氨基酸，叶酸，泛醌及大部分源于生物的苯衍生物[15]中。第一步反应是由3-脱氧-D-阿拉伯-HEPTULOSONATE7-磷酸（DAHP）合成酶[16]催化发生的磷酸烯醇丙酮酸酯(PEP)和赤藓糖-4-磷酸（E4P）的缩合反应。第二步反应由3-脱氢硫胺素合成酶引导完成的，其中把7碳糖DAHP 转化成脱氢硫胺素，并涉及到五步反应：乙醇的氧化，磷酸基团消除，羰基还原，开环和分子内的丁间醇醛缩和反应[11]。然而，对于大多数的真核生物的基因组系列[14]中缺少经典合成通路的前两步反应所涉及到的同源系列。在两种

古生菌：Methanocaldococcus jannaschii和Methanococcus maripaludis[9]中，DHQ 实际上是由ASA和6-脱氧-5-酮果糖-1-磷酸（DKFP）产生而来的。

在过去的几十年里, DNA重组技术的发展, 通过生物合成途径的基因操作的方法,为改善抗生素的

产量和生物活性提供了新的工具. 为此, 第一步是分离和分析bagremycins生物合成基因簇,这样才能阐明它们的生物合成途径; 第二步是尽力提高产量, 并通过重组生物合成和代谢途径工程的手段来加强抗生素的抗细菌和抗肿瘤的活性. 在这篇论文里, 我们克隆并分析了两个基因bagB,bagC这两个基因在Streptomyces sp. TÜ4128里负责bagremycins的生物合成. 并且通过RT-PCR的分析, 发现bagB 及其下游基因bagC是共同转录的.

1材料和方法

1.1 细菌菌株, 质粒, 生长条件.

Streptomyces sp. TÜ4128[1][2]是一野生型产抗生素bagremycins菌株, 并被用于属间结合受体.

含质粒pUZ8002[5]的甲基化缺陷型大肠杆菌Escherichia coli. ET12567用作结合供体. Escherichia coli. JM83 用作基因克隆宿主. pMD18-T被用于PCR产物的克隆载体.

在制备链霉菌孢子时,用培养基MS在28o C下培养; 当制备菌丝体1[5]时用培养基YEME培养. 在生产抗生素时, 野生型菌株TÜ4128和它的变异体在发酵液1[1][2]中用28o C培养15天. 含80mM MgCl2的ISP4用于结合时用的培养基1[6]. Escherichia coli菌株于37o C下连续12-16h培养于LB 肉汤或LB 琼脂,并根据需要添加氨苄青霉素(100ugml-1), 阿泊拉霉素(50ugml-1),卡那徽素(50ugml-1)及氯霉素(25ugml-1).

1.2 bagB,bagC基因的克隆.

通过结合保守区域克隆和MICHIELS ET AL.(2003)描述的HE-TAIL PCR 的方法,获取基因bagB,bagC的完整系列. 本研究用的引物列于表S1 . 变性的引物P1+P2和P9 +P10分别用于克隆保守区域的bagB,bagC. 在HE-TAIL PCR 中, 用到变性引物AD1-AD4作为随机引物, 同时用到还有P3-P8及P11-P16. 在PCR反应中Streptomyces sp. TU4128的基因组的DNA作为模板.

1.3 核苷酸系列登录号.

Streptomyces sp. TÜ4128的基因bagB,bagC的核苷酸系列已提交至GENBANK 数据库,登录号分别为JN981134,JN981135.

1.4 基因替换

用bagB基因替换的质粒pECU2B构建如下: 克隆来自于带P25+P26的PGM91[10]的新抗生素基因片段,插入到含有梅切位点HindIII-BamHI的pOJ2601[3]中构建出pECU2. bagB基因的两个同源臂,来自于野生型含P17 +P18 和P19+ P20 的基因组的DNA, 用PCR进行扩增, 并分别连接到pMD18-T. 来自于上面构建的质粒中的HindIII 和BamHI 片段被成功地克隆到pECU2 中, 并构建出pECU2B, pECU2B以最小修饰方式被转化到先前由Flett et al. (1997) 描述的Streptomyces sp. TU4128中. 转化混合物涂布于转化培养基中, 并在37o C中培养16-18h. 然后, 在每个培养平板上用1ml含1mg 卡那徽素和0.5mg萘啶酮酸的水溶液覆盖. 得到对卡那徽素敏感的克隆, 近一步用复制平板法在筛选出对阿泊拉霉素敏感的克隆. 双交叉突变(Km r,Am s) bagB基因, 获得所要的ΔbagB突变体, 近一步被PCR 和RT-PCR验实. 类似于ΔbagB的方法, 用P21-24获得ΔbagC的突变体.

1.5 RNA 分离和RT-PCR

从发酵培养基中收集处于不同周期的Streptomyces sp. TÜ4128的菌丝体, 并投放于液氮中保存. 用EASY spin RNA Bacteria Mini KIT ( Aidlab, Beijing, China) 提取经预处理样本的总RNA. 用等同于

总RNA量的DNase I (Takara) 处理样品,以除去所污染的DNA ; 然后用生产厂家推荐的反转录酶M-MLV(Takara)配上9-mer随机引物,再用处理过的样品RNA为模板启动合成第一条cDNA. 以cDNA 作为模板, 用三对特定的引物来做PCR: bagB基因用引物P29+P30, bagC基因用引物P15+P20, bagB,bagC之间的系列用引物P7+P31. 16S rRNA 用引物P27+P28来检测以作为阳性对照组.