链霉菌基因 bacB 和 bacC 的克隆和两者间的关系文献翻译

基因bacB和bacC的克隆和两者间的关系, bacB和bacC是链霉菌
Streptomyces sp. TÜ4128 中参与抗生素bagremycin的生物合成中两个
协同转录的基因.
摘要: 由链霉菌Streptomyces sp. TÜ4128生产的抗生素bagremycin A 和bagremycin B , 对人腺癌细胞[1][2]显示抗肿瘤活性.为了阐明bagremycins 的生物合成途径, 从bagremycin-生产菌株中克隆到了两个名为：bagB和bagC基因, 并分析了两者的关系. bagB和bagC 诱导表达蛋白展示了分别同醛缩酶和3-脱氢硫胺素合成酶有很高的序列同源性.
bagC 紧跟随在bagB 的下游位置, 并且随后的反转录和PCR分析发现两个基因是协同转录. BagB和bacC 两个任意一个沉默,都会使得发酵培养基中完全回收不到抗生素bagremycins , 这证明了两个基因都掺与了抗生素bagremycin的生物合成. 从本次的研究中, 获得了抗生素bagremycins整个生物合成簇基因, 近一步加深了我们对生物合成途径的理解以及bagremycins的活性机制.
关键词：Bagremycin ，醛缩酶，3-脱氢硫胺素，Streptomyces sp. TÜ4128
抗生素bagremycin A 和bagremycin B 是Streptomyces sp. TÜ4128生产的两种新型的-香豆酸衍生物, 对人腺癌细胞[1][2]显示抗肿瘤活性. Bagremycin A显示出对真菌病原菌: 白色念珠菌Candida albicans有活性, 而bagremycin B对病原体: 葡萄孢属-（脑脊髓）灰质炎病原体Botrytis cinerea[1][2]有直接活性。

因此，抗生素bagremycins 在未来的医药和农业应用中具有潜在的价值。

用X-射线和NMR光谱测量分析确定了bagremycin A 和bagremycin B的结构分别是：4-乙烯基·苯基醚-3-氨基-4-羟苯酸酯，4-乙烯基·苯基醚-3-N-乙酰基-4-羟苯酸酯，如图一[1][2]所示。

依据bagremycin A的结构，我们可以推测出bagremycin A 可能衍生于对-香豆酸和3-氨基-4-羟苯酸（3，4-AHBA）缩和反应产物的，在紧接着乙酰化反应就可以从bagremycin A得到bagremycin B （图一）。

3，4-AHBA---Streptomyces生产的许多代谢物的前体物---很可能是由醛缩酶和3-脱氢硫胺素（DHQ）合成酶[15]共同催化L-天冬氨酸-4-半醛（ASA）和二羟基丙酮磷酸（DHQ）发生缩和反应所得产物。

从Streptomyces griseus[15]克隆到负责上面所述及的反应的griI 和griH两个基因，并分析了两个基因在grixazone 生物合成途径中的关系。

同时，3，4-AHBA又是4-羟基-3-亚硝基苯甲酰胺（4,3HNBAm)的前体物，是在Streptomyces murayamaensis[13]中由两个蛋白NspI 和NspH 催化产生。

由此，我们可以猜测到，编码醛缩酶和3-脱氢硫胺素合酶的基因同样存在于bagremycins生物合成途径中。

在许多种微生物中，同样也发现了包含醛缩酶和3-脱氢硫胺素合酶的其它生物合成途径。

经典的莽草酸生物合成通路包含7步酶促反应，并且普遍存在于各种各样的微生物生物合成芳香氨基酸，叶酸，泛醌及大部分源于生物的苯衍生物[15]中。

第一步反应是由3-脱氧-D-阿拉伯-HEPTULOSONATE7-磷酸（DAHP）合成酶[16]催化发生的磷酸烯醇丙酮酸酯(PEP)和赤藓糖-4-磷酸（E4P）的缩合反应。

第二步反应由3-脱氢硫胺素合成酶引导完成的，其中把7碳糖DAHP 转化成脱氢硫胺素，并涉及到五步反应：乙醇的氧化，磷酸基团消除，羰基还原，开环和分子内的丁间醇醛缩和反应[11]。

然而，对于大多数的真核生物的基因组系列[14]中缺少经典合成通路的前两步反应所涉及到的同源系列。

在两种
古生菌：Methanocaldococcus jannaschii和Methanococcus maripaludis[9]中，DHQ 实际上是由ASA和6-脱氧-5-酮果糖-1-磷酸（DKFP）产生而来的。

在过去的几十年里, DNA重组技术的发展, 通过生物合成途径的基因操作的方法,为改善抗生素的
产量和生物活性提供了新的工具. 为此, 第一步是分离和分析bagremycins生物合成基因簇,这样才能阐明它们的生物合成途径; 第二步是尽力提高产量, 并通过重组生物合成和代谢途径工程的手段来加强抗生素的抗细菌和抗肿瘤的活性. 在这篇论文里, 我们克隆并分析了两个基因bagB,bagC这两个基因在Streptomyces sp. TÜ4128里负责bagremycins的生物合成. 并且通过RT-PCR的分析, 发现bagB 及其下游基因bagC是共同转录的.
1材料和方法
1.1 细菌菌株, 质粒, 生长条件.
Streptomyces sp. TÜ4128[1][2]是一野生型产抗生素bagremycins菌株, 并被用于属间结合受体.
含质粒pUZ8002[5]的甲基化缺陷型大肠杆菌Escherichia coli. ET12567用作结合供体. Escherichia coli. JM83 用作基因克隆宿主. pMD18-T被用于PCR产物的克隆载体.
在制备链霉菌孢子时,用培养基MS在28o C下培养; 当制备菌丝体1[5]时用培养基YEME培养. 在生产抗生素时, 野生型菌株TÜ4128和它的变异体在发酵液1[1][2]中用28o C培养15天. 含80mM MgCl2的ISP4用于结合时用的培养基1[6]. Escherichia coli菌株于37o C下连续12-16h培养于LB 肉汤或LB 琼脂,并根据需要添加氨苄青霉素(100ugml-1), 阿泊拉霉素(50ugml-1),卡那徽素(50ugml-1)及氯霉素(25ugml-1).
1.2 bagB,bagC基因的克隆.
通过结合保守区域克隆和MICHIELS ET AL.(2003)描述的HE-TAIL PCR 的方法,获取基因bagB,bagC的完整系列. 本研究用的引物列于表S1 . 变性的引物P1+P2和P9 +P10分别用于克隆保守区域的bagB,bagC. 在HE-TAIL PCR 中, 用到变性引物AD1-AD4作为随机引物, 同时用到还有P3-P8及P11-P16. 在PCR反应中Streptomyces sp. TU4128的基因组的DNA作为模板.
1.3 核苷酸系列登录号.
Streptomyces sp. TÜ4128的基因bagB,bagC的核苷酸系列已提交至GENBANK 数据库,登录号分别为JN981134,JN981135.
1.4 基因替换
用bagB基因替换的质粒pECU2B构建如下: 克隆来自于带P25+P26的PGM91[10]的新抗生素基因片段,插入到含有梅切位点HindIII-BamHI的pOJ2601[3]中构建出pECU2. bagB基因的两个同源臂,来自于野生型含P17 +P18 和P19+ P20 的基因组的DNA, 用PCR进行扩增, 并分别连接到pMD18-T. 来自于上面构建的质粒中的HindIII 和BamHI 片段被成功地克隆到pECU2 中, 并构建出pECU2B, pECU2B以最小修饰方式被转化到先前由Flett et al. (1997) 描述的Streptomyces sp. TU4128中. 转化混合物涂布于转化培养基中, 并在37o C中培养16-18h. 然后, 在每个培养平板上用1ml含1mg 卡那徽素和0.5mg萘啶酮酸的水溶液覆盖. 得到对卡那徽素敏感的克隆, 近一步用复制平板法在筛选出对阿泊拉霉素敏感的克隆. 双交叉突变(Km r,Am s) bagB基因, 获得所要的ΔbagB突变体, 近一步被PCR 和RT-PCR验实. 类似于ΔbagB的方法, 用P21-24获得ΔbagC的突变体.
1.5 RNA 分离和RT-PCR
从发酵培养基中收集处于不同周期的Streptomyces sp. TÜ4128的菌丝体, 并投放于液氮中保存. 用EASY spin RNA Bacteria Mini KIT ( Aidlab, Beijing, China) 提取经预处理样本的总RNA. 用等同于
总RNA量的DNase I (Takara) 处理样品,以除去所污染的DNA ; 然后用生产厂家推荐的反转录酶M-MLV(Takara)配上9-mer随机引物,再用处理过的样品RNA为模板启动合成第一条cDNA. 以cDNA 作为模板, 用三对特定的引物来做PCR: bagB基因用引物P29+P30, bagC基因用引物P15+P20, bagB,bagC之间的系列用引物P7+P31. 16S rRNA 用引物P27+P28来检测以作为阳性对照组.
1.6 HPLC分析
参照Bertasso et al.(2001,2004)的方法以最微小的影响来提取抗生素和HPLC分析. 把过滤后的培养液调至pH5, 在用等量的乙酸乙酯提取三次. 浓缩有机物层并干燥, 在把干燥物溶解于甲醇. 接下来在30o C下用HPLC(Model1100系列,Agilent Technologies , Wilmington, DE) 分析样品, HPLC 是以丙腈-0.1%磷酸(40%:60%, v/v)作为流动相, 用一种Eclipse XDB-C18(4.6*250mm)控制流速1ml min-1 , 并在280nm处检测样品.
2 结果
2.1 BagB, BagC的克隆和系列分析
根据醛缩酶和3-脱氢硫胺素合成酶的高度保守区域, 设计了两对变性的引物并用于克隆来自于Streptomyces sp. TÜ4128的同源基因部分. TAIL-PCR(Liu and Whittier 1995; Michiels et al. 2003) ----一种用于分离已知染色体组的系列的侧边系列的基本PCR---用来获取两个假定的开放阅读框的整个系列. 如图Fig 2a 所示, 包含保守区域(F1)和两个侧边片段（F2，F3）的三个部分片段是交叠的并被切开产生了一个名为bagB假定的开放阅读框命。

用克隆基因BagB的方法来克隆基因bagC的基因系列。

检索GENBANK 的蛋白数据库，基因bagB编码的一段257个残基蛋白同醛缩酶同源（38-72%同源），而bagC编码的一段368个氨基酸蛋白显示同3-脱氢硫胺素合成酶（Figs. S1，S2）系列类似（39-79%同源）。

2.2 bagB,bagC是共同转录基因。

在实验的开始阶段，bagB,bagC是各自从它们自己的保守区域中克隆得到。

结果是，用HE-TAIL跑染色体组的电泳展示两条邻近的开放阅读框，并且转录方向一致。

这意味着bagB,bagC 是以一个双顺反子mRNA或多顺反子mRNA 以及还不清楚的下游基因共同转录的。

因此，使用来自于培养3到15天不同相的菌丝体所提取的总RNA 反转录得来的cDNA做RT-PCR来研究bagB,bagC的共同转录情况。

有如图Fig3 所示的，在前面11天里，bagB,bagC大量的转录。

同时，还监测两个基因间的转录情况，结果同两基因内的确定结论一致。

所有观察到的阳性条带同以染色体组的DNA作为模板所获得的条带一样，在没有反转录酶和不加RNase酶条件下，使用处理过的RNA 作为模板的总RNA来做电泳检测不到任何条带信号。

2.3 对于抗生素BAGREMYCINS的生物合成，bagB,bagC是必需的。

为了证实bagB,bagC是否参与到bagremycins的生物合成途径中，以pECU2为出发质粒,用含有NEO抗性的基因来取代目标基因构建出pECU2B, pECU2C , 然后, 用属间结合分别转入野生型的菌株. 为了证实是否发生了两次同源重组, 采用PCR 和RT-PCR 进一步验证来自于克隆(含Km r, Am s)的染色体组的DNA. 如图Fig 2b 所示, 用四个特定的引物来做PCR , 其中只有pECU2B含有P25+P26, 而P32+P33只存在于野生型菌株TU4128的染色体组的DNA. 结果是使用来自于bagB缺失菌株的染色体组的DNA作为模板进行PCR扩增, 存在含有P32+P26 的2839bp的片段,以及含有P33+P25的2174bp片段, 但是野生型菌株和pECU2B没有扩增产物(Fig.2c). 这些结果证实了bagB基因成功被NEO抗性基因替换. 采用bagB缺失变异一样的操作方法, 用P34+P26和P35+P25(数据没有
发表)来验证bagC缺失菌株. 并进一步用RT-PCR来监测变异株中bagB,bagC的转录情况. 结果是在bagC缺失变异株里能够正常转录bagB, 然而, 在bagB缺失的变异株(Fig 2d)中, 由于bagB基因的删除造成的可能极性影响, bagC基因的转录明显减少. bagB基因的转录并不受下游基因删除的影响, 意味着bagB基因的转录比bagC基因早. 这样的结果更进一步证实: 在Streptomyces sp. TU4124中,bagB基因同bagC基因是共同转录的.
2.4 3,4 AHBA和BAGREMYCINS产物的HPLC分析
为确定次级代谢产物, 采用HPLC来分析野生型菌株的有机提取物, ΔbagB变异体和ΔbagC 变异体的操作方法已在前面的材料和方法部分描述过. 同野生型菌株相比, HPLC结果显示ΔbagB 或ΔbagC变异体中失去了产bagremycin A, bagremycin B的能力, 但是依旧产3,4-AHBA(Fig. 4) . 虽然3,4-AHBA产生没有停止, 然而基因取代的结果显示bagB,bagC同bagremycins生物合成有关联, 同时也验证了我们早期的推测.
3 讨论
为了分离bagremycins的生物合成基因簇, 结合并分析了醛缩酶和3-脱氢硫胺素合成酶的保守氨基酸系列, 并用来设计了变性引物,并用此变性引物克隆来自于Streptomyces sp. TU4128的部分同源基因片段. 如预期的,在产bagremycins菌株中, 找到了分别同griI/nspI , griH/nspH基因同源的两个基因bagB,bagC.氨基酸系列搜索结果显示BagB蛋白同GriI, NspI有72%同源, 并BagC 分别同GriH, NspH 有78% 和79%同源. 这意味着这些酶在生物合成的次级代谢途径中可能有类似的酶催化功能.
为了证实bagB,bagC3,4-AHBA 和bagremycin生物合成的相互关系, 用二次同源重组的手段,用NEO抗性基因来取代bagB,bagC. HPLC分析表明, bagB,bagC的失活会导致发酵培养基中检测不到bagremycinA, bagremycin B; 然而意想不到的是,3,4-AHBA依然产生. 在各种各样的微生物中, bagB,bagC的诱导蛋白产物可以催化不同的四碳和三碳底物转变成七碳的产物. 最普遍的例子是, 在普遍的莽草酸通路[15]中,通过DAHP可以从PEP E4P合成出DHQ. 在古生菌中,存在另外一条DKFP通路, 在有基因Mj0400/Mmp0686 , Mj1249/Mmp006产物[9]存在的情况下, 可以从ASA和DKFP 合成出DHQ. 而且如前面[13]提到的, GriI/NspI , GriH/NspH 可以指导从ASA 和DHAP 生物合成出3,4 -AHBA. 这意味着,这些酶涉及多种机制发挥着多种功能, 因此在bagremycin生物合成途径中,对这两个酶的催化机制和功能的进一步研究是很有必要的.。