【CN109957008A】水蛭素突变体的提取纯化方法及其应用【专利】
天然水蛭素的提取和纯化
天然水蛭素的提取和纯化
陈曦;刘光明;胡强;钱旻
【期刊名称】《华东师范大学学报（自然科学版）》
【年(卷),期】2004(000)002
【摘要】水蛭素(hirudin)是存在于水蛭唾液中的一种酸性多肽类物质，是迄今为止世界上最强的凝血酶抑制剂．在治疗各种血栓性疾病及弥散性血管内凝血中均有很好的预防及治疗效果，并且没有副作用，因而它比肝素更有优越性。
研究表明，水蛭素还能防止肿瘤细胞的转移，用水蛭素配合化疗和放疗，可促进肿瘤中的血流而增强疗效，因而具有宽阔的临床应用前景。
【总页数】3页(P104-106)
【作者】陈曦;刘光明;胡强;钱旻
【作者单位】华东师范大学,生命科学学院,上海,200062;华东师范大学,生命科学学院,上海,200062;华东师范大学,生命科学学院,上海,200062;华东师范大学,生命科学学院,上海,200062
【正文语种】中文
【中图分类】Q516
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4.我国天然水蛭素提取和应用申请发明专利 [J], 邓宏鹰
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一种实验室使用活体水蛭提取水蛭素的装置及其方法[发明专利]
![一种实验室使用活体水蛭提取水蛭素的装置及其方法[发明专利]](https://img.taocdn.com/s3/m/a8120a2ec381e53a580216fc700abb68a982ad26.png)
(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201911230463.6(22)申请日 2019.12.05(71)申请人 昆明学院地址 650000 云南省昆明市经济技术开发区浦新路2号(72)发明人 刘子超 仝向荣 毕晓旭 苏源 袁永生 祝平 (74)专利代理机构 昆明普发诺拉知识产权代理事务所(特殊普通合伙)53209代理人 葛玉军(51)Int.Cl.C07K 14/815(2006.01)C07K 1/14(2006.01)(54)发明名称一种实验室使用活体水蛭提取水蛭素的装置及其方法(57)摘要本发明公开了一种实验室使用活体水蛭提取水蛭素的装置及其方法，涉及水蛭素提取技术领域。
所述装置包括顶部开口的箱体、中隔板、升降盖板和挤压板，中隔板设置于箱体中部，中隔板上均匀分布有条形凹槽，条形凹槽底部开设有若干出液孔；中隔板上方设置有升降盖板，升降盖板上设置有诱导液盛装槽，诱导液盛装槽与条形凹槽相适配；升降盖板上方设置有挤压板，挤压板底部设置有凸部，凸部与诱导液盛装槽相适配。
条形凹槽两侧设置有第一电极，诱导液盛装槽两侧设置有第二电极，第一电极和第二电极接触后导通。
条形凹槽和升降盖板可将水蛭活动范围进行限制，通过诱导液盛装槽有效对水蛭进行诱导，促使其分泌唾液；通过挤压、电刺激促使水蛭分泌腺液。
权利要求书1页 说明书5页 附图2页CN 110734489 A 2020.01.31C N 110734489A1.一种实验室使用活体水蛭提取水蛭素的装置，其特征在于：包括顶部开口的箱体(1)、中隔板(2)、升降盖板(3)和挤压板(4)，中隔板(2)设置于箱体(1)中部，中隔板(2)上均匀分布有条形凹槽(21)，条形凹槽(21)底部开设有若干出液孔；中隔板(2)上方设置有升降盖板(3)，升降盖板(3)上设置有诱导液盛装槽(31)，诱导液盛装槽(31)与条形凹槽(21)相适配；升降盖板(3)上方设置有挤压板(4)，挤压板(4)底部设置有凸部(41)，凸部(41)与诱导液盛装槽(31)相适配。
一种水蛭素的提取方法[发明专利]
![一种水蛭素的提取方法[发明专利]](https://img.taocdn.com/s3/m/588bd246f56527d3240c844769eae009581ba2ca.png)
(10)申请公布号(43)申请公布日 (21)申请号 201610234669.6(22)申请日 2016.04.16C07K 14/815(2006.01)C07K 1/14(2006.01)(71)申请人徐顺青地址255200 山东省淄博市博山区叠阳路西冶小区8号楼2单元203号申请人常传云 常越(72)发明人徐顺青 常传云 常越 徐茂林(74)专利代理机构淄博佳和专利代理事务所37223代理人张雯(54)发明名称一种水蛭素的提取方法(57)摘要一种水蛭素的提取方法，属于水蛭素提取技术领域。
包括如下步骤：1）饥饿处理；2）刺激分泌：保持环境温度23~40℃，在波长200nm ～275nm 紫外线照射下，向水蛭的体表喷洒诱导剂，紫外线照射时间为30~180秒，关闭紫外线，采用暖白光明灭闪烁的方式照射水蛭3~15分钟，或者采用暖白光和绿光交替明灭闪烁的方式照射水蛭3~15分钟，以刺激水蛭分泌分泌液；3）灭菌；4）浓缩。
本发明的一种水蛭素的提取方法对水蛭素的提取量大，且能够反复提取，最终所得粉末状水蛭素色泽浅、活性成分含量高。
(51)Int.Cl.(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请权利要求书1页 说明书7页CN 105693851 A 2016.06.22C N 105693851A1.一种水蛭素的提取方法，其特征在于，包括如下步骤：1）饥饿处理：将活的水蛭进行饥饿处理；2）刺激分泌：保持环境温度23~40℃，在波长200nm～275nm紫外线照射下，向水蛭的体表喷洒诱导剂，紫外线照射时间为30~180秒，关闭紫外线，采用暖白光明灭闪烁的方式照射水蛭3~15分钟，或者采用暖白光和绿光交替明灭闪烁的方式照射水蛭3~15分钟，以刺激水蛭分泌分泌液；暖白光色温为2000~4500K，绿光波长500nm ~560nm，暖白光闪烁频率和绿光的闪烁频率均为0.2~8Hz；3）灭菌：收集分泌液，采用波长200nm～275nm紫外线照射分泌液进行杀菌；4）浓缩：将分泌液采用25~40℃风干，或者采用冷冻干燥，获得固态粉末，即得。
一种吸血水蛭活体多次提取天然水蛭素方法[发明专利]
![一种吸血水蛭活体多次提取天然水蛭素方法[发明专利]](https://img.taocdn.com/s3/m/1014286f3a3567ec102de2bd960590c69ec3d8c3.png)
(10)申请公布号 CN 102964446 A(43)申请公布日 2013.03.13C N 102964446 A*CN102964446A*(21)申请号 201210493449.7(22)申请日 2012.11.28C07K 14/815(2006.01)(71)申请人周维官地址530007 广西壮族自治区南宁市西乡塘区大岭路98号申请人刘晶吴玉琴(72)发明人周维官 刘晶 吴玉琴(74)专利代理机构广西南宁汇博专利代理有限公司 45114代理人朱萍球(54)发明名称一种吸血水蛭活体多次提取天然水蛭素方法(57)摘要本发明提供一种吸血水蛭活体多次提取天然水蛭素方法，它包括先从吸血水蛭活体中提取天然水蛭素粗品，然后经过分离纯化得到天然水蛭素粉，所述天然水蛭素粗品的提取是先制备特异性诱导液，并将其灌入肠管中得到含特异性诱导液肠管；再将含特异性诱导液肠管投喂给吸血水蛭，然后提取吸血水蛭的唾液或将吸血水蛭磨浆，制得浆液，即得到天然水蛭素粗品；接着采用常规的生化分离方法进行分离纯化制得天然水蛭素粉。
本发明工艺简单、提取率高，且明显降低吸血水蛭提取天然水蛭素粗品后的死亡率，并可有效提高生物资源利用率，从而显著降低生产成本，为提取水蛭体内主要有效活性物质如天然水蛭素提供了一条便捷的途径。
(51)Int.Cl.权利要求书1页 说明书12页(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请权利要求书 1 页 说明书 12 页1/1页1.一种吸血水蛭活体多次提取天然水蛭素方法，它包括先从吸血水蛭活体中提取天然水蛭素粗品，然后经过分离纯化得到天然水蛭素粉，其特征在于：所述天然水蛭素粗品的提取是先制备特异性诱导液，并将其灌入肠管中得到含特异性诱导液肠管；再将含特异性诱导液肠管投喂给吸血水蛭，然后提取吸血水蛭的唾液或将吸血水蛭磨浆，制成浆液，即得到天然水蛭素粗品；所述特异性诱导液的制备为：在每1000ml 特异性诱导液中含有蚯蚓提取液10～300ml ，壳聚糖5～50g ，黄芪多糖1～20g ，葡萄糖粉1～30g ；先用适量水溶解上述粉状物质后，加入蚯蚓提取液，再用水加至1000ml ，即得到特异性诱导液，备用。
一种水蛭素的提取方法
一种水蛭素的提取方法水蛭素是一种具有多种药理活性的天然化合物，具有抗炎、镇痛、抗凝血等作用，被广泛应用于医药和美容领域。
本文将介绍一种简单高效的水蛭素提取方法，以供科研和产业生产的参考。
材料与仪器* 新鲜水蛭：选取健康、体型完整的水蛭。
* 太谷螺旋藻培养基：提供养分供给水蛭生长。
* 纯化水：用于制备培养基和药物溶液。
* 离心机：用于离心沉淀物。
* 氮气进样仪：用于干燥药物溶液。
* 恒温振荡器：用于混合反应液。
* 深冷冰箱：用于保存样品。
提取步骤第一步：养殖水蛭1. 选择健康的水蛭，放入适量的太谷螺旋藻培养基中。
2. 在25恒温振荡器中进行培养，光照条件为12小时光照和12小时黑暗。
第二步：药物制备1. 取适量新鲜的水蛭，洗净表面的杂质和细菌，切碎成细小的颗粒。
2. 将切碎的水蛭放入50mL的纯化水中，放入恒温振荡器中搅拌1小时。
3. 将搅拌后的液体进行离心，沉淀物收集。
4. 用纯化水洗涤沉淀物，重复此步骤3次，直至收集到纯净的水蛭提取物。
5. 将水蛭提取物通过氮气进样仪进行干燥，获得干燥的水蛭提取物。
第三步：提取与纯化1. 将干燥的水蛭提取物溶解于适量的纯化水中，形成水蛭提取液。
2. 将水蛭提取液通过滤纸进行过滤，去除大颗粒杂质。
3. 用离心机将液体进行离心，沉淀物收集。
4. 用纯化水洗涤沉淀物，重复此步骤3次，直至得到纯净的水蛭素。
5. 将水蛭素溶解于纯化水中，进行浓缩。
第四步：质量检测1. 采用高效液相色谱法（HPLC）检测水蛭素的含量和纯度。
2. 通过比对标准品，确定水蛭素的相对含量。
结论本文介绍了一种简单高效的水蛭素提取方法，通过养殖水蛭、药物制备、提取与纯化、质量检测等步骤，可以获得纯净的水蛭素。
这种方法操作简便，提取效果良好，为水蛭素的研究和生产提供了可靠的技术支持。
但需要注意的是，提取过程中应采取严格的无菌操作，以确保提取物的纯度和质量。
希望本文能为水蛭素的提取方法研究提供参考，为医药和美容领域的发展贡献力量。
水蛭素的分离纯化与检测方法研究进展
水蛭素的分离纯化与检测方法研究进展
杨立新;秦海娜;李晓晖;修志龙
【期刊名称】《水产科学》
【年(卷),期】2005(024)002
【摘要】天然水蛭素是从水蛭的唾液腺中分离出来的一种多肽，分子量7000道尔顿，由64-66个氨基酸组成。
水蛭素N端由二硫键形成的紧密结构能与凝血酶活性位点结合，其C端富含酸性氨基酸残基，则与凝血酶的纤维蛋白原结合位点结合，从而对凝血酶有高度特异的抑制作用，起到抑制凝血酶的抗凝血作用。
在临床上多用于治疗不稳定性心绞痛(USA)，
【总页数】3页(P37-39)
【作者】杨立新;秦海娜;李晓晖;修志龙
【作者单位】鞍山科技大学,生物工程系,辽宁,鞍山,114044;大连理工大学,环境与生命学院生物科学与工程系,辽宁,大连,116024;大连理工大学,环境与生命学院生物科学与工程系,辽宁,大连,116024;大连理工大学,环境与生命学院生物科学与工程系,辽宁,大连,116024
【正文语种】中文
【中图分类】S968
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一种中药水蛭提取物及其用途[发明专利]
![一种中药水蛭提取物及其用途[发明专利]](https://img.taocdn.com/s3/m/7ba31b8e48d7c1c709a145aa.png)
专利名称：一种中药水蛭提取物及其用途专利类型：发明专利
发明人：柴永海,杨培民,刘国飞,邱学伟,代龙申请号：CN201310097031.9
申请日：20130326
公开号：CN103251926A
公开日：
20130821
专利内容由知识产权出版社提供
摘要：本发明公开了一种中药水蛭提取物及其用途，属中药领域。
其特征是水蛭以双酶连续酶解法酶解(水蛭先在酸性条件下以胃蛋白酶酶解，酶解混悬液再在碱性条件下以胰蛋白酶酶解)，再经过超滤、纳滤、阳离子交换凝胶等精制、纯化，得到水蛭提取物，其纯度90％以上，可加制剂辅料按常规方法制成冻干粉针剂。
本发明具有良好的活血作用，用于治疗心脑血管疾病，特别是用于治疗缺血性中风效果较好。
申请人：代龙
地址：250002 山东省济南市市中区阳光舜城中六区2-903室
国籍：CN
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水蛭素突变体的提取纯化方法及其应用[发明专利]
![水蛭素突变体的提取纯化方法及其应用[发明专利]](https://img.taocdn.com/s3/m/cf123eff5f0e7cd1842536ee.png)
专利名称：水蛭素突变体的提取纯化方法及其应用
专利类型：发明专利
发明人：陈杰鹏,段丽丽,陈鸿锐,胡留松,陈煜藩,洪琳,许志锴,叶红林,纪烨瑜,蔡春丽
申请号：CN201910301614.6
申请日：20190416
公开号：CN109957008A
公开日：
20190702
专利内容由知识产权出版社提供
摘要：本申请公开了一种从大肠杆菌发酵生产水蛭素突变体HV2‑Lys47的发酵液中提取纯化水蛭素突变体HV2‑Lys47的方法，所述方法采用膜技术及一次柱层析技术，从而获得高纯度的水蛭素突变体HV2‑Lys47。
本申请还公开了由此制备的水蛭素突变体HV2‑Lys47在抗凝采血管中的应用及包含水蛭素突变体HV2‑Lys47的抗凝采血管。
申请人：广东双骏生物科技有限公司
地址：515071 广东省汕头市汕头保税区C03地块双骏生物科技园
国籍：CN
代理机构：北京安信方达知识产权代理有限公司
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一种中药水蛭提取物的制备方法[发明专利]
![一种中药水蛭提取物的制备方法[发明专利]](https://img.taocdn.com/s3/m/072465e1eff9aef8941e06ff.png)
专利名称：一种中药水蛭提取物的制备方法
专利类型：发明专利
发明人：裴福成,刘景国,隋艳君,解黎雯,李文军,郑玥,肇静静,李文春,单钰毓,王英新
申请号：CN201210504304.2
申请日：20121130
公开号：CN102920736A
公开日：
20130213
专利内容由知识产权出版社提供
摘要：一种中药水蛭提取物的制备方法，它涉及一种水蛭提取物的制备方法。
本发明是要解决现有方法制备的中药水蛭提取物中水蛭活性成分的生物活性破坏较大的问题。
制备方法：一、取水蛭粗粉加入纯化水，搅拌浸渍，离心后取上清液；二、对上清液进行超滤，收集滤过液A；三、对滤过液A 进行超滤，收集截留液和滤过液B，截留液作为提取物I；取滤过液B过树脂柱，收集水洗液；四、对水洗液进行减压浓缩，冷却后加入乙醇调节含醇量，搅拌，静置，过滤，收集上清液；五、对上清液进行浓缩，得提取物II，将提取物I和II合得提取物III，将提取物I、II、III进行冷冻干燥，即得中药水蛭提取物。
本发明的提取物均具有抗凝、抗血栓活性。
本发明应用于中药领域。
申请人：哈药集团中药二厂
地址：150078 黑龙江省哈尔滨市道里区机场路243号
国籍：CN
代理机构：哈尔滨市松花江专利商标事务所
代理人：金永焕
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一种肿瘤特异性重组水蛭素及其制备方法和用途[发明专利]
![一种肿瘤特异性重组水蛭素及其制备方法和用途[发明专利]](https://img.taocdn.com/s3/m/cd4dc4e4f12d2af90342e69b.png)
专利名称：一种肿瘤特异性重组水蛭素及其制备方法和用途专利类型：发明专利
发明人：何向锋,施文
申请号：CN201710362102.1
申请日：20170519
公开号：CN107098964A
公开日：
20170829
专利内容由知识产权出版社提供
摘要：本发明公开了一种肿瘤特异性重组水蛭素，所述重组水蛭素的N末端含有可被基质金属蛋白酶9(MMP9)识别并裂解的寡肽序列PLGI，用于重组的水蛭素为水蛭素异构体、水蛭素突变体、截短的水蛭肽、基因修饰的水蛭素或水蛭素融合蛋白。
相应地，本发明还提供了肿瘤特异性重组水蛭素的制备方法及其在制备防治肿瘤的药物中的应用，还提供了表达肿瘤特异性重组水蛭素的过继免疫细胞的制备方法和用途。
本发明的重组水蛭素，使水蛭素抗凝活性进行肿瘤靶向性释放，营造不易形成血栓的微环境，甚至溶解已形成的微小栓子以达到抗凝、溶栓、防止肿瘤细胞转移的功能，这就克服了野生型水蛭素全身用药引起系统性出血的风险。
申请人：何向锋
地址：226000 江苏省南通市崇川区晨苑小区7栋205
国籍：CN
代理机构：北京商专永信知识产权代理事务所(普通合伙)
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(19)中华人民共和国国家知识产权局
(12)发明专利申请
(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201910301614.6
(22)申请日 2019.04.16
(71)申请人 广东双骏生物科技有限公司
地址 515071 广东省汕头市汕头保税区C03
地块双骏生物科技园
(72)发明人 陈杰鹏 段丽丽 陈鸿锐 胡留松
陈煜藩 洪琳 许志锴 叶红林
纪烨瑜 蔡春丽
(74)专利代理机构 北京安信方达知识产权代理
有限公司 11262
代理人 凌翠 张奎燕
(51)Int.Cl.
C07K 14/815(2006.01)
C07K 1/36(2006.01)
C07K 1/34(2006.01)
C07K 1/16(2006.01)C12P 21/02(2006.01)A61J 1/05(2006.01)A61J 1/14(2006.01)C12R 1/19(2006.01)
(54)发明名称
水蛭素突变体的提取纯化方法及其应用
(57)摘要
本申请公开了一种从大肠杆菌发酵生产水
蛭素突变体HV2-Lys47的发酵液中提取纯化水蛭
素突变体HV2-Lys47的方法，所述方法采用膜技
术及一次柱层析技术，从而获得高纯度的水蛭素
突变体HV2-Lys47。
本申请还公开了由此制备的
水蛭素突变体HV2-Lys47在抗凝采血管中的应用
及包含水蛭素突变体HV2-
Lys47的抗凝采血管。
权利要求书2页 说明书15页 附图2页CN 109957008 A 2019.07.02
C N 109957008
A
权 利 要 求 书1/2页CN 109957008 A
1.一种从大肠杆菌发酵生产水蛭素突变体HV2-Lys47(SEQ ID NO.:1)的发酵液中提取纯化水蛭素突变体HV2-Lys47的方法，包括以下步骤：
在升高的温度下处理大肠杆菌发酵液，以灭菌且去除杂蛋白；
通过陶瓷膜或通过离心机来处理灭菌的发酵液，以去除菌体；
可选地，通过超滤膜来处理通过陶瓷膜或离心机的发酵液，以去除杂蛋白；
通过纳滤膜来处理通过陶瓷膜或离心机的发酵液、或通过超滤膜的发酵液，以获得粗分离的浓缩液；
将盐添加到所述粗分离的浓缩液中作为辅料，喷雾干燥，得到干粉；
将所述干粉溶解在水中并过滤除杂，可选地通过滤纸、砂芯漏斗或膜设备来进行过滤；
使滤液仅通过分子筛柱层析1次，用水洗脱，浓缩收集液，得到水蛭素突变体HV2-Lys47粗品；
将所述水蛭素突变体HV2-Lys47粗品溶解到水中，然后向其中添加盐或有机溶剂，以沉淀出水蛭素突变体HV2-Lys47，干燥即得水蛭素突变体HV2-Lys47纯品，可选地进行真空干燥，更可选地进行冷冻真空干燥。
2.根据权利要求1所述的方法，其中，通过离心机来处理高温灭菌的发酵液，可选地所述离心机为管式离心机或碟式离心机。
3.根据权利要求1所述的方法，其中，所述高温处理是在65℃-67℃下保持5-20分钟，可选地10分钟。
4.根据权利要求1所述的方法，其中，所述盐选自氯化钠、氯化钾、硫酸铵、硫酸钠、硫酸钾中的一种或更多种。
5.根据权利要求1所述的方法，其中，所述分子筛柱层析选自由sephadex G25、sephadex G50、sephadex G75和sephadex G100组成的组。
6.根据权利要求1所述的方法，其中，浓缩经由分子筛柱层析得到的收集液是通过减压真空浓缩、纳滤膜浓缩或反渗透膜浓缩来进行的。
7.根据权利要求1所述的方法，其中，所述有机溶剂选自乙醇、甲醇、丙酮、异丙醇或乙腈中的一种或更多种。
8.根据权利要求1-7中任一项所述的方法，其中，作为辅料添加的盐的以克计的重量为粗分离的浓缩液的以毫升计的体积的5％或更大。
9.根据权利要求1-7中任一项所述的方法，其中，用于溶解所述干粉的水的以毫升计的体积为所述干粉的以克计的重量的10倍以上。
10.根据权利要求1-7中任一项所述的方法，其中，为了使水蛭素突变体HV2-Lys47沉淀，所添加的盐的以克计的重量为溶解有水蛭素突变体HV2-Lys47粗品的水溶液的以毫升计的体积的20％-30％，所添加的有机溶剂的体积为溶解有水蛭素突变体HV2-Lys47粗品的水溶液的体积的5-9倍。
11.根据权利要求1-7中任一项所述的方法，其中所述大肠杆菌发酵液是通过以pBH-2为表达载体的菌株大肠埃希氏菌(Escherichia coli)pBH2CGMCC No0908培养生产的，可选地，所述培养包括在需氧条件下，在25℃-35℃的温度下培养至对数生长期结束，然后升温至35℃-45℃继续培养至水蛭素突变体HV2-Lys47的产量达到峰值。
12.一种水蛭素突变体HV2-Lys47，所述水蛭素突变体HV2-Lys47根据权利要求1-11中
2。