巯基化HA中巯基的取代度Ellman法详细步骤

首先制作半胱氨酸标准曲线，再用紫外分光光度法测定样品吸光度，计算出疏基含量，最终得出修饰率。

1、制作标准曲线：

缓冲液的配制：称取0.254gNaH2PO4与10.162gNa2HPO4于500ml容量瓶中，用

超纯水溶解，加入148.896mg的EDTA（乙二胺四乙酸），使其完全溶解，定容成500ml。Ellman试剂的配制：称取4mgDTNB溶解在1ml缓冲液中。

取7只试管，分别在每只试管内加入50μL Ellman试剂与2.5ml磷酸钠缓冲溶液，混匀后，再在各试管内加入50μL标准溶液，混合均匀，在室温放置15min，以溶液G为空白，于波长412nm处测定半胱氨酸标准液的吸光度值(A)，如表9所示:

制作标准曲线如图10所示。

得标准曲线方程为y=0.1692x-0.0001，R2=09994，满足要求。

2、测量半胱氨酸透明质酸结合物的修饰率：

配制样品溶液：称取10.5mg半胱氨酸透明质酸结合物（含0.0274mmol伯醇羟基）用缓冲液溶解并定容至5ml；

配制空白对照溶液：称取10.5mg透明质酸（含0.0274mmol伯醇羟基）用缓冲液溶解并定容至5ml；

取2只试管，分别在每支试管内加入50μL Ellman试剂与2.5ml磷酸钠缓冲溶液，混匀后，再在各试管内加入50μL待测样品，混合均匀，在室温放置15min，以透明质酸溶液做空白，于波长412nm处测定待测样品的吸光度值(A)，如表10所示：

利用标准曲线和测得的样品溶液吸光度，计算样品中巯基的含量。

带入标准曲线计算：0.0385=0.1692x-0.0001，得出修饰率为3.5%（巯基数相对于透明质酸的双糖单位数）。