大肠菌群计数

主要修改内容
将原标准拆分为大肠菌群、粪大肠菌群和大 肠杆菌计数三个独立的标准方法，标准名称 变化。 大肠菌群的MPN法中乳糖胆盐等培养基改为 月桂基硫酸盐胰蛋白胨(LST)肉汤为主的培养 基； 增加了对样品匀液的pH范围要求； 增加了大肠菌群的平板计数法和纸片检测法； MPN法的结果报告由原“每100g（mL）大肠 菌群的MPN值”，修改为“每1 g（mL）大 肠菌群的MPN值”；
使用MPN检索表的注意点
这个MPN检索表是ISO、FDA、AOAC、 USDA/FSIS、北欧等标准通用的。 表里的数字是有小数点的。 报告单位不同。现报告单位为g/ml，而原报告 单位是100g/ml。 原标准MPN表有64个组合，而现标准MPN表 只有40个组合。
当实验结果在MPN表中无法查找到MPN值 时，如：阳性管数为122，123，232，233 等时，建议增加稀释度(可做4~5个稀释度)， 使样品的最高稀释度能达到获得阴性终点， 然后再遵循相关的规则进行查找，最终确 板计数法相对于MPN法来说，检验结果更 精确。 适合用于污染比较严重的样品，但对于污 染菌量太少的样品，还是MPN法更有优势。 所用培养基：VRBA琼脂、BGLB培养基。
平板计数法的检验程序
检样25g(ml)+225ml稀释液，均质 检样25g(ml)+225ml稀释液，均质 10倍系列稀释 10倍系列稀释 选择2~3个适宜稀释度的样液，接种VRBA平板 选择2~3个适宜稀释度的样液，接种VRBA平板 36℃ 36℃±1℃ 18~24h 注：VRBA(结晶紫中性 注：VRBA(结晶紫中性 红胆盐琼脂) 红胆盐琼脂)又称为： VRB或 VRB或VRBL
月桂基磺酸盐胰蛋白胨（LST） 月桂基磺酸盐胰蛋白胨（LST）
月桂基磺酸钠能抑制革兰氏阳性菌的生长， 同时比胆盐的选择性和稳定性好。由于胆盐 与酸产生沉淀，沉淀有时候会使对产气情况 的观察变得有些困难； 乳糖是大肠菌群可利用发酵的糖类。有利于 大肠菌群的生长繁殖并有助于鉴别大肠菌群 和肠道致病菌； 胰蛋白胨提供基本的营养成分； LST肉汤是国际上通用的培养基，与乳糖胆盐 肉汤的作用和意义相同，但具有更多的优越 性。
分布： • 广泛分布于自然环境。 • 来源于人和温血动物的粪便。 卫生学意义 • 大肠菌群作为粪便污染的指标菌评价样 品中是否受到粪便的污染。 • 大肠菌群计数的高低，直接反映了样品 受粪便污染的程度。 • 表示对人体健康是否具有潜在的危险性。
大肠菌群是理想的粪便污染的指标菌 • 是人类和温血动物肠道菌群，在数量上 占优势。 • 随粪便排出体外后，在外界环境影响下， 其存活时间应与肠道致病菌大致相似或 稍长。 • 检验方法简便，易于检出与计数。 • 对消毒剂的抵抗力应不低于肠道致病菌。
大肠菌群计数
马德良
大肠菌群的定义
指一群在36℃条件下培养48h能发酵乳糖、 产酸产气的需氧和兼性厌氧革兰氏阴性无 芽胞杆菌。 该菌群主要来源于人畜粪便, 作为粪便污染 指标评价食品的卫生状况, 推断食品中肠道 致病菌污染的可能。 大肠菌群不是细菌学上分类命名，而是一 组与粪便污染有关的细菌。这群细菌包括： 大肠埃希氏菌、柠檬酸杆菌、产气克雷伯 氏菌和阴沟肠杆菌等。 生化特征及血清学反应并非完全一致。
结果报告
经最后证实为大肠菌群阳性的BGLB管的百分 比乘以计数的平板菌落数，再乘以稀释倍数， 即为每g (mL)样品中大肠菌群数 。 例：10-4样品稀释液1ml在VRBA平板上有100 个典型和可疑菌落，挑取10个接种BGLB肉汤， 证实6个为阳性。则样品大肠菌群数为： 100×6/10×104/g(mL)=6.0×105cfu/g(mL)
发酵试验判定原则：产气为阳性。 检测步骤减少（不必分离培养），检测时 间缩短24h。 注：如接种量超过1mL，则应用双料LST肉 1mL LST 汤
煌绿乳糖胆盐肉汤（BGLB） 煌绿乳糖胆盐肉汤（BGLB）
胆盐可抑制革兰氏阳性菌。 煌绿是抑菌抗腐剂，可增强对革兰氏阳性菌的 抑制作用。 乳糖是大肠菌群可利用发酵的糖类。有利于大 肠菌群的生长繁殖并有助于鉴别大肠菌群和肠 道致病菌。 发酵试验判定原则：产气为阳性。由于配方里 有胆盐，胆盐遇到大肠菌群分解乳糖所产生的 酸形成胆酸沉淀，培养基可由原来的绿色变为 黄色，同时可看到管底通常有沉淀。
记录在24h和48h内产气的LST肉汤管数。未 产气者为大肠菌群阴性；对产气者，则进 行复发酵试验。 注意：以48h±2h为最终观察结果时限。结 果也以此时为最终结果。
第二步：复发酵
用接种环从所有48h±2h内发酵产气的LST肉 汤管中分别取培养物1环，移种于煌绿乳糖胆 盐(BGLB)肉汤管中，置36℃±1℃温箱内， 培养48h±2h，观察产气情况。产气者，计为 大肠菌群阳性管。
结晶紫中性红胆盐琼脂(VRBA)
VRBA的主要成分：乳糖、胆盐、结晶紫、中 性红及细菌生长所必需的营养成分如:蛋白胨、 酵母膏等。 中性红为VRBA的指示剂系统，在酸性条件下 为紫红色。 大肠菌群分解乳糖所产生的酸与胆盐结合， 可形成沉淀。
第三法 大肠菌群PetrifilmTM测试片法
TM 大肠菌群Petrifilm
结果报告
根据大肠菌群阳性管数, 查MPN检索表，报告 每 g (mL)样品中大肠菌群的MPN值。
MPN检索表的应用
MPN（最可能数）是表示样品中活菌密度的估 测。因此MPN值只是活菌密度的估算值，并不 是样品中活菌数的真值。
1g(mL)检样中最大可能数（MPN）表
阳性管数 0.10 0 0 0 0 0 0 1 1 1 1 1 1 1 1 2 2 2 2 2 2 0.01 0 0 1 1 2 3 0 0 0 1 1 2 2 3 0 0 0 1 1 1 0.001 0 1 0 1 0 0 0 1 2 0 1 0 1 0 0 1 2 0 1 2 MPN <3.0 3.0 3.0 6.1 6.2 9.4 3.6 7.2 11 7.4 11 11 15 16 9.2 14 20 15 20 27 95%置信区间 95%置信区间 低 -0.15 0.15 1.2 1.2 3.6 0.17 1.3 3.6 1.3 3.6 3.6 4.5 4.5 1.4 3.6 4.5 3.7 4.5 8.7 高 9.5 9.6 11 18 18 38 18 18 38 20 38 42 42 42 38 42 42 42 42 94 0.10 2 2 2 2 2 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 阳性管数 0.01 2 2 2 3 3 0 0 0 1 1 1 1 2 2 2 2 3 3 3 3 0.001 0 1 2 0 1 0 1 2 0 1 2 3 0 1 2 3 0 1 2 3 MPN 21 28 35 29 36 23 38 64 43 75 120 160 93 150 210 290 240 460 1100 >1100 95%置信区间 95%置信区间 低 4.5 8.7 8.7 8.7 8.7 4.6 8.7 17 9 17 37 40 18 37 40 90 42 90 180 420 高 42 94 94 94 94 94 110 180 180 200 420 420 420 420 430 1,000 1,000 2,000 4,100 --
平板菌落数的选择
选择菌落数在30~150之间的平板，分别计 数平板上出现的典型和可疑大肠菌群菌落。 典型菌落为紫红色，菌落周围有胆盐与酸形 成的沉淀环，菌落直径为0.5mm或更大。
证实试验
从VRBA平板上挑取10个不同类型的典型和 可疑菌落，分别移种于BGLB肉汤管内，进 行证实试验。 BGLB肉汤管产气者，所对应的菌落即为大 肠菌群阳性菌落。
第一步：初发酵
选择适宜的三个连续稀释度的样品匀液，液 体样品可以包括未经稀释的原液，每个稀释 度接种三管月桂基硫酸盐胰蛋白胨（LST） 肉汤，每管接种1mL（如接种量需要超过 1mL，则用双料LST肉汤）。 36℃±1℃培养24h±2h，检查倒管内是否有 气泡产生或轻摇试管时是否有密集连续的细 小气泡从管底逸出，如未产气则继续培养至 48h±2h。
不产气
产气 煌绿乳糖胆盐肉汤（BGLB） 36± 煌绿乳糖胆盐肉汤（BGLB） 36±１℃，24~48±2h 24~48± 不产气 大肠菌群阴性 产气 大肠菌群阳性
报告
样品的处理和稀释
固体和半固体食品：以无菌操作取25g）样 品,放入装有225 mL生理盐水的无菌均质杯 内,于8000 r/min均质1min～2min,制成1:10样 品匀液，或放入225 mL生理盐水的无菌均 质袋中，用均质器拍打1min～2min，制成 1:10的样品匀液。 液体食品：以无菌吸管吸取样品25mL放入 装有225mL生理盐水的无菌玻璃瓶(瓶内预 置适当数量的玻璃珠)中,以30cm幅度、于7s 内振摇25次(或以机械振荡器振摇),制成1:10 的样品匀液。
大肠菌群计数
第一法：MPN法 第二法：平板计数法 第三法：Petrifilm测试片法 Petrifilm
第一法 大肠菌群检验MPN法
培养基改变情况
原标准 乳糖胆盐发酵管 EMB琼脂 乳糖发酵管 新标准 第一法： 月桂基硫酸盐胰蛋白胨肉汤 （LST） LST） 煌绿乳糖胆盐肉汤（BGLB） 煌绿乳糖胆盐肉汤（BGLB） 第二法： 结晶紫中性红胆盐琼脂(VRBA) 结晶紫中性红胆盐琼脂(VRBA) 煌绿乳糖胆盐肉汤（BGLB） 煌绿乳糖胆盐肉汤（BGLB）
计数典型和可疑菌落 BGLB肉汤证实试验 BGLB肉汤证实试验 36℃ 36℃±1℃ 18~24h
报告结果
操作要点
样品稀释同第一法。 选取适宜的2~3个连续稀释度, 每个稀释度 接种两个灭菌平皿, 每皿1mL。另取1mL生 理盐水做个空白对照。将冷至46℃的结晶 紫中性红胆盐琼脂(VRBA)约15mL倾注于每 个平皿中。小心旋转平皿，将培养基与样 液充分混匀，待琼脂凝固后，再加3 mL~4 mLVRBA覆盖平板表层。
什么样的菌落必须要做证实试验?
一是非典型菌落，如在颜色、直径与典型菌 落不符合的菌落。 另一种情况是被检样品中含有乳糖以外的其 他糖类，如牛奶、饮料等样品。本来大肠菌 群的定义是发酵乳糖，但由于样品含有的其 他糖类混入了培养基，使得不能分解乳糖但 能分解其他糖类的细菌也能够长出红色菌落， 所以需要进行证实实验。
检样25g(ml)+225ml稀释液，均质 检样25g(ml)+225ml稀释液，均质 10倍系列稀释 10倍系列稀释 选择2~3个适宜稀释度的样液， 选择2~3个适宜稀释度的样液， 接种PetrifilmTM大肠菌群测试纸片 接种PetrifilmTM大肠菌群测试纸片 36℃ 36℃±1℃ 24± 24±2h 计数红色带气泡菌落 报告结果
根据对样品污染情况的估计,按上述操作， 依次制成系列十倍系列样品匀液。每递增 稀释1次，换用1支1mL无菌吸管。从制备样 品匀液至样品接种完毕，全过程不得超过 15min。 样品匀液的pH值应在6.5～7.5之间，必要时 要进行调节，如有些果汁pH值很低，如果 不进行调节，检验结果的误差可能就会比 较大。
测试片法原理
PetrifilmTM大肠菌群测试 片是一种预先制备好的 培养基系统，含有VRB 培养基，冷水可溶性凝 胶和TTC指示剂，可增 强菌落计数效果。表面 覆盖的胶膜，可截留发 酵乳糖的大肠菌群产生 的气体。培养结束后计 数红点周围有气泡的菌 落为大肠菌群数。
大肠菌群PetrifilmTM 测试片检验程序
操作步骤的改变
原标准 初发酵 EMB分离培养 EMB分离培养 染色，复发酵 报 告 报 告 现标准 LST初发酵 LST初发酵 BGLB验证 BGLB验证
大肠菌群检验程图(新国标MPN法)
检样 稀释 月桂基硫酸盐胰蛋白胨肉汤（LST）36± 月桂基硫酸盐胰蛋白胨肉汤（LST）36±１℃，24~48±2h 24~48±