土壤酶活

土壤酶活

4.1脲酶测定

4.1.1原理

脲酶存在于大多数细菌、真菌和高等植物里。它是一种酰胺酶作用是极为专性的，它仅能水解尿素，水解的最终产物是氨和二氧化碳、水。土壤脲酶活性与土壤的微生物数量、有机物质含量、全氮和速效磷含量呈正相关。根际土壤脲酶活性较高，中性土壤脲酶活性大于碱性土壤。人们常用土壤脲酶活性表征土壤的氮素状况。

土壤中脲酶活性的测定是以脲素为基质经酶促反应后测定生成的氨量，也可以通过测定未水解的尿素量来求得。本方法以尿素为基质，根据酶促产物氨与苯酚-次氯酸钠作用生成蓝色的靛酚，来分析脲酶活性。

4.1.2试剂

1）甲苯

2）10%尿素：称取10g尿素，用水溶至100ml。

3）PH6.7柠檬酸盐缓冲液：184g柠檬酸和147.5g氢氧化钾（KOH）溶于蒸馏水。将两溶液合并，用1mol/L NaOH将PH调至6.7，用水稀释定容至1000ml。

4）苯酚钠溶液（1.35mol/L）：62.5g苯酚溶于少量乙醇，加2ml甲醇和18.5ml丙酮，用乙醇稀释至100ml（A液），存于冰箱中；27g NaOH溶于

100ml水（B液）。将A、B溶液保存在冰箱中。使用前将A液、B液各20ml 混合，用蒸馏水稀释至100ml。

5）次氯酸钠溶液：用水稀释试剂，至活性氯的浓度为0.9%，溶液稳定。

6）氮的标准溶液：精确称取0.4717g硫酸铵溶于水并稀释至1000ml，得到1ml含有0.1mg氮的标准液。绘制标准曲线时，再将此溶液稀释10倍供用。

4.1.3操作步骤

4.1.3.1标准曲线制作

分别吸取稀释后的标准液0、0.25、0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0ml，移于25ml容量瓶中，然后补加蒸馏水至10ml。再加入2ml苯酚钠溶液和1.5ml次氯酸钠溶液，随加随摇匀。20min后显色，定容。1h内在分光光度计上于578nm 波长处比色。然后以氮工作液浓度为横坐标，吸光值为纵坐标，绘制标准曲线。

4.1.3.2样品处理

称取5g土样于50ml三角瓶中，加1ml甲苯。15min后加10ml 10%尿素溶液和20ml PH 6.7柠檬酸盐缓冲溶液，摇匀后在37℃恒温箱培养24小时。培养结束后过滤，过滤后取1.5ml滤液加入25ml容量瓶中，再加2ml苯酚钠溶液和1.5ml次氯酸钠溶液，随加随摇匀。20min后显色，定容。1h内在分光光度计与578nm波长处比色。

4.1.4结果计算：

脲酶活性以24小时后5g土壤中NH3－N的毫克数表示土壤脲酶活性（Ure）。

NH3－N=（a样品－a无土－a无基质）×V×n／m

式中：

a样品为样品吸光值由标准曲线求得的NH3－N毫克数；

a无土为无土对照吸光值由标准曲线求得的NH3－N毫克数；

a无基质为无基质对照吸光值由标准曲线求得的NH3－N毫克数；

V为显色液体积；

n为分取倍数，浸出液体积／吸取滤液体积；

m表示烘干土重

4.1.5注意事项:

4.1.

5.1每一个样品应该做一个无基质对照，以等体积的蒸馏水代替基质，其他操作与样品实验相同，以排除土样中原有的氨对实验结果的影响。

4.1.

5.2整个实验设置一个无土对照，不加土样，其他操作与样品实验相同，以检验试剂纯度和基质自身分解。

4.1.

5.3如果样品吸光值超过标曲的最大值，则应该增加分取倍数或减少培养的土样

4.2过氧化氢酶活性测定（高锰酸钾滴定法）

4.2.1原理

过氧化氢广泛存在于生物体和土壤中，是由生物呼吸过程和有机物的生物化学氧化反应的结果产生的，这些过氧化氢对生物和土壤具有毒害作用。与此同时，在生物体和土壤中存有过氧化氢酶，能促进过氧化氢分解为水和氧的反应（H2O2→ H2O+O2），从而降低了过氧化氢的毒害作用。土壤中过氧化氢酶的测定便是根据土壤（含有过氧化氢酶）和过氧化氢作用析出的氧气体积或过氧化氢的消耗量，测定过氧化氢的分解速度，以此代表过氧化氢酶的活性。测定过氧化氢酶的具体方法比较多，如气量法：根据析出的氧气体积来计算过氧化氢酶的活性；比色法：根据过氧化氢与硫酸铜产生黄色或橙黄色络合物的量来表征过氧化氢酶的活性；滴定法：用高锰酸钾溶液滴定过氧化氢分解反应剩余过氧化氢的量，表示出过氧化氢酶的活性。本实验重点采用高锰酸钾滴定法。

4.2.2试剂

1.5mol/L H2SO4溶液：量取42ml浓硫酸稀释至500ml；

0.3%的H2O2：将30%双氧水稀释100倍，其浓度用高锰酸钾滴定；

饱和明矾溶液：铝钾矾即明矾在20℃的溶解度为10.84g，30℃的溶解度为15.41g；

0.02mol/L高锰酸钾：称取3.16g高锰酸钾溶解定容至1L，其准确浓度用草酸钠标定；

4.2.3操作步骤

分别取2g土壤样品于三角瓶中，加入40ml蒸馏水，加5ml0.3%的H2O2溶液，立即将三角瓶瓶口密封起来。震荡20分钟后加入1ml饱和铝钾矾，立即过滤于盛有5ml1.5mol硫酸的三角瓶中，滤干后，吸取滤液25ml，用0.02mol/L 高锰酸钾滴定至紫红色，同时做无土对照。

4.2.4结果计算：

KMnO4标定：准确称取0.13-0.16g草酸钠置于250ml三角瓶中，加30ml谁和20ml1.5mol/L的H2SO4，加热至75℃左右，用KMnO4滴定至紫红色。

刚开始滴定溶液就会变成紫红色，此时并不是滴定终点。等刚开始出现的紫红色褪色之后，再继续滴定至紫红色，直到30 S 紫红色不褪色为止。

H2O2标定：吸取5ml H2O2加入10ml1.5mol/L的H2SO4，用KMnO4滴定至紫红色。

过氧化氢酶活性以20min内每克土壤分解的过氧化氢的毫克数表示

过氧化氢酶活性= (V-V S)C*51/V0*17/W

V：为滴定空白所用的KMnO4体积；

V S：为滴定样品所用的KMnO4体积；

C：为KMnO4浓度；

V0：为滴定体积25ml；

W：为土重；