流式细胞术最新进展及临床应用

流式细胞术最新进展及临床应用

流式细胞术最新进展及临床应用

流式细胞术( F l o w cy t o m e t r y, F C M), 临床上也被称为流式细胞分析,是利用流式细胞仪同时对单个细胞的多个参数进行定性/ 定量( 相对/ 绝对) 分析的生物医学分析技术,检测速度快、通量高、灵敏度高、采集数据量大、节约样本及成本,在临床上已经广泛应用于血液学、免疫学、肿瘤学、精子学等检验领域,是未来临床检

验不可替代的检测方法之一。传统流式细胞术,也被称为荧光流式细胞术,是基于荧光标记及荧光发射光谱检测的一门综合性技术,定量方式多为定性分析,检测参数类型单一、数目有限,数据分析复杂且缺乏标准化分析流程,不同检测中心间数据重现性差,这些都限制了它在临床检验中进一步的推广及应用。近年来,为克服以上问题,流式细胞术不断突破与创新,从定性检测发展为定量检测;从单参数分析、双参数分析发展成为多参数分析;从检测细胞表面抗原到胞内抗原及分泌到胞外的抗原;从检测蛋白表达水平发展为检测蛋白定位、蛋白功能及蛋白翻译后修饰等;从一维定量检测发展为二维定量定位分析,从体外检测发展为体内检测等;这些突破使得流式细胞术可以实现从单细胞水平去认识细胞在生理或病理状态下的免疫表型、分子表型甚至各种复杂的信号通路变化等,因此将更为广泛应用于临床检测。

1定量流式细胞术

定量流式细胞术( Q u a n tit a ti ve fl o w cy t o m e t r y, QFCM),即通过流式细胞仪定量检测细胞或微球上荧光素的中值荧光强度 ( M e d i a n fl u o r e s ce n t i n t e n s it y, M F I ) 或每个细胞结合的抗体单位( A n ti b o d i e s b o und t o p e r ce ll,A BC) 来对生物分子进行相对或绝对定量的流式细胞技术。定量流式细胞术已被证明是一种功能强大的临床检验技术,但由于M F I缺乏标准化度量方法,容易引起不同检测中心检测结果重现性差,导致诊断和治疗决策的不确定性及不可靠性, 限制了其在临床的推广应用, 因此,标准化M F I测量为流式细胞术实现精确定量分析,在临床广泛应用的必经之路。目前,在临床应

用过程中,为提高检测结果的准确性及重现性,定量流式细胞术必须做到以下几点:淤样本及试剂处理严格按照标准操作规程,每一次检测必须设置质控管; 于流式细胞仪维护及校准。每一次检测前进行仪器校准;盂检测流程标准化及规范化;榆数据分析自动化。流式检测数据量庞大,分析难度大,经验性强, 人工分析存在主观性和低保真度等特点。实现机器操控及数据分析的标准化、自动化将会大大提高检测数据的再现性及可靠性。

2多色流式细胞术

多色流式细胞术 ( M u lti co l o r fl o w cy t o m e t r y, MFC) 是指利用超过三种的荧光素实现多个参数同时检测的流式细胞技术。近年来,随着流式细胞仪硬件( 激光管、滤光片等)、软件( 数据分析等) 的不断改进,荧光素的不断开发及应用,临床诊断领域的不断发展及需求,MFC 应运而生。大部分临床检验中心的流式细胞仪具备 2 ~ 3 个激光器,可以同时检测9 ~ 10 色荧光,甚至出现了 5 激光20 参数同时检测的流式细胞仪。多色流式细胞术可以快速准确高灵敏的检测细胞内多个指标,实现从复杂样本中识别罕见细胞群,为疾病诊断、药物开发等提供了强大的工具,是流式细胞术未来发展的主要趋势,也是流式细胞术在临床应用的主要方向。但由于结果分析的复杂性,MFC 目前在临床应用中还主要是作为探索或辅助手段。例如,吴江等[1] 利用多色流式细胞术分析急性 HIV 感染者外周血酌啄T 细胞的表型,探索哪一种酌啄T 细胞在急性HIV 感染及疾病进展中发挥重要作用。流式细胞术评分系统经常被整合到疾病诊断和预后评分系统中,辅助精细评分。例如, 基于CD79b( 或CD22 )、CD23、CD5、FMC7 及SmIg检测的流式细胞术免疫分型评分参与辅助诊断慢性淋巴细胞白血病[2] ;利用 MFC 检测骨髓祖细胞侧向角散射光、CD117 表达以及单核细胞 CD13 表达等参数建立的流式检测积分系统可以补充目前的骨髓增生异常综合征国际预后评分系统( IPSS鄄R),实现更为精确的预后评估[3] ;利用 MFC 检测分析来自骨髓的造血细胞的免疫分型可以辅助慢性髓细胞白血病的诊断、预后和治疗[4] ;利用MFC 检测白血病细胞表面分化抗原可以辅助白血病分型诊断及白血病微小残留物诊断[5] ;基于G P I锚连蛋白缺失

检测的MFC 可以辅助阵发性睡眠性血红蛋白尿症诊断;基于多种分子标记物[ 血小板特异性膜糖蛋白( GP域b / 芋a、GP玉b鄄御鄄吁、GP玉a / 域a 等)、血小板颗粒膜糖蛋白( CD62P、CD63、CD107a、CD107b 等)]、Ca2+ 流及RNA 含量等检测的 MFC 可以辅助血小板功能分析等

3磷酸化流式细胞术

磷酸化流式细胞术 ( P h o s ph o鄄s p ec ifi c fl o w cy t o m e t r y,P h o s ph o鄄fl o w),是指高通量检测单个细胞内多个磷酸化蛋白的流式细胞术。细胞信号通路中关键因子的磷酸化水平是细胞信号转导研究的重要内容,而经典

的生化方法对信号通路的分析非常有限,因为它不仅只能一次检测一个蛋白的磷酸化水平,并且获得的结果为

一群细胞内蛋白磷酸化水平的平均值,这一方面无法实现细胞内信号网络的全面分析,另一方面在面对异质细

胞群体时也很难获得准确的结果,而磷酸化流式细胞术很好地克服了这些难题,它借助于多种信号分子的磷酸

化抗体,在单个细胞水平上同时分析细胞内多个蛋白因子的磷酸化水平,从而获得更高水平的信号转导动力学,

实现单个细胞内信号通路的全面分析。

P h o s ph o鄄fl o w已经广泛应用于多个领域,包括抗原或微生物刺激下免疫应答过程中的信号通路研究、癌症

及自身免疫性疾病相关信号通路研究、疾病相关标记物及药物的高通量筛选等。例如: 利用P h o s ph o鄄fl o w检

测C D3 阳性T细胞中的核糖体 S6蛋白磷酸化水平来进行心脏移植患者mTOR 抑制剂依维莫司治疗药物

的监测[7]; 利用P h o s ph o鄄fl o w检测肝移植患者外周血单核细胞( P B M C s) 中p70S6K 磷酸化水平来评估

西罗莫司药效学敏感性[8];利用P h o s ph o鄄fl o w测定主动脉瓣狭窄小鼠模型中的循环白细胞和血小板鄄白细

胞聚集体( PLA) 中的Smad2 / 3 磷酸化水平来探究TGF鄄茁1 活