狂犬病疫苗的研制
狂犬病口服疫苗研究进展
口服 疫 苗 口服 免 疫 家 鼠， 抗 体 阳 转
率 达 ８ ％ 以 上 。１ ９ ０ ９ ６年 郑 海 发 等 又 采用 Ｃ ＴＮ一１ 经 Ｖｅｏ细胞 传 ｌ ， 株 ｒ ５代
实 的 技 术 基 础 。Ｄｉｔｓｈ ｌ 编 码 ｅｚｃ ｏｄ把
细 胞 凋 亡 蛋 白基 因 插 入 到 狂 犬 病 病
病毒感染植 物，用分 离的病毒粒子
免 疫 动 物 或 直 接 用病 毒 感 染 的 植 物 叶片 饲喂 动物 就可 起 到免疫 效果。 Ｙｓｏ ｕｉ ｖ等 于 １９ 成 功 构 建 了带 ｂ ９７年
有 糖 蛋 白 Ｂ细 胞 表 位 和 核 蛋 白 Ｔ细 胞 抗 原 表 位 的 重 组 ＡＩ ＭＶ病 毒 。通
诱 导 Ｔ细 胞 免 疫 。反 向遗 传 操 作 系 统 方 法 是 新 近 发 明 的 方 法 ，应 用 该 方 法通 过 修 改 狂 犬 病 病 毒 糖 蛋 白 与 毒 力相 关的 位 点和蛋 白的膜外 区 ，
可 以 重组 出 更 安 全 、 更 有 效 的 减 毒
活疫 苗 。
、
狗 和 浣 熊 产 生 中 和 抗 体 ，具 有 很 好
的 保 护性 ，但 对 鼠等 啮 齿 动物 、猫 、 臭 鼬 具 有 致 病 性 。Ｓ ＡＤ— ｅｎ株 疫 Ｂｒ 苗 对 红 狐 有 很 好 的 保 护 作 用 ，但 对 啮 齿动 物 和狒 狒 具 有 一定 的 致病 性 。
狂 犬病 毒 的 反 向 遗 传 学 操 作 系
一
三 、转基 因植物 口服疫苗
表 达 狂犬病 病 毒抗 原蛋 白的植 物 可 能 成 为 人或 动 物疫 苗的 廉价 来 源 ， 特 别 对 于 发 展 中 国 家 ，这 种 疫 苗 更
论狂犬病疫苗的研究进展
论狂犬病疫苗的研究进展摘要概述了狂犬病疫苗的研究进展，以期为合理应用疫苗及了解其发展趋势提供参考。
关键词狂犬病；传统疫苗；细胞疫苗；新型疫苗；研究进展中图分类号 r512.9903 文献标识码 a 文章编号 1007-5739（2009）05-0223-021 传统疫苗1885年巴斯德尝试用感染狂犬病毒固定毒的兔脊髓并于室温干燥，经此制备的疫苗试验后在1885年首次应用于人并获得了成功。
1908年fermi通过在室温下用1%酚处理组织改进了巴斯德的方法。
1911年semple 应用羊脑组织的匀浆物制备疫苗，提高了疫苗的易感性。
应用化学方法如酚、β－丙内脂制备了无毒性的semple 疫苗。
我国自1949年起，一直使用由山羊脑组织制备的semple 疫苗，直到1980年停止使用，由原代地鼠肾细胞和bhk细胞疫苗取代。
脑组织疫苗由于注射量大（每针2ml），接种次数多（14针以上），接种后易引起神经变态反应，抗体产生慢而且水平低等原因，who 狂犬病专家委员会在第七次报告（1984年）中支持限制和放弃生产脑组织疫苗，并极力提倡使用灭活的细胞培养疫苗。
2 细胞疫苗2.1 人二倍体细胞疫苗（hdcv）1964年wiktor在wistar研究所首次描述hdcv，并进一步通过比较试验最终将来源于semple疫苗生产用pm狂犬病毒株适应到w1～38人二倍体细胞株（后来又适应到mrc 5细胞）。
该疫苗于1974年首次获准生产，并于1978年开始商品化。
hdcv不含任何神经毒因子，并不含任何外源动物杂质，因而可以解释它在重复注射后较好的耐受。
采用nih法检测疫苗的稳定性证实，疫苗在4℃和37℃放置1个月后，无明显差异。
进一步将5批效价为4.3～5.6的疫苗4℃存放3.5年，所有批号滴度均大于2.5iu/剂。
早期调查发现，hdcv预防接种后1个月或3个月达到抗体峰值（10iu左右），随后便逐渐降低，但1～2年内滴度始终大于0.5iu，通过1～3年内加强免疫后，抗体滴度迅速增加10～15倍，肌肉注射和皮下注射途径相近。
人二倍体细胞狂犬疫苗与Vero细胞纯化狂犬疫苗的安全性对比分析
人二倍体细胞狂犬疫苗与Vero细胞纯化狂犬疫苗的安全性对比分析人二倍体细胞狂犬疫苗与Vero细胞纯化狂犬疫苗是两种常见的疫苗类型，它们都是用于预防狂犬病的疫苗，但它们的制备过程和安全性可能存在一些差异。
本文将对这两种疫苗的安全性进行对比分析，帮助读者更好地了解这两种疫苗的特点和适用范围。
人二倍体细胞狂犬疫苗是一种由人类细胞培养制备的疫苗，它们来源于人的胚胎组织或细胞株。
这种疫苗制备的过程较为复杂，需要经过多道程序，从细胞培养、病毒复制、收获和纯化等环节，确保最终的疫苗产品符合国家标准和生产安全规定。
而Vero细胞纯化狂犬疫苗则是利用Vero细胞培养，通过细胞培养、病毒复制、收获和纯化等步骤，生产出的疫苗产品。
在安全性方面，这两种疫苗都有着严格的生产工艺和质量控制要求，保证生产过程中的卫生和纯度全面符合相关法规和标准要求。
但是在实际应用中，人二倍体细胞狂犬疫苗和Vero细胞纯化狂犬疫苗的安全性会有所不同。
人二倍体细胞疫苗制备的过程可能会存在与细胞培养相关的潜在风险，如细胞变异、病毒污染等。
而Vero细胞纯化疫苗则通过纯化过程将可能存在的杂质去除，减少了潜在的风险。
从制备过程来看，Vero细胞纯化狂犬疫苗在安全性上可能更有优势。
人二倍体细胞疫苗和Vero细胞纯化疫苗的生产工艺、疫苗成分和疫苗质量也会对其安全性产生影响。
人二倍体细胞疫苗可能含有人类组织或细胞株的成分，存在一定的传染风险；而Vero细胞纯化疫苗则是通过Vero细胞培养制备，不含有人类组织或细胞株成分，安全系数更高。
临床使用中对这两种疫苗的不良反应进行监测和统计分析也是很重要的。
通过对患者接种后的不良反应进行监测和分析，可以更好地评估疫苗的安全性和适用性。
有研究显示，人二倍体细胞疫苗在部分接种者中可能会出现不良反应，如发热、局部反应等；而Vero细胞纯化疫苗在临床使用中的不良反应相对较少。
人二倍体细胞狂犬疫苗和Vero细胞纯化狂犬疫苗在安全性上存在一定的差异。
人用狂犬病疫苗的历史和现状分析：重庆狂犬抗体检测机构
人用狂犬病疫苗的历史和现状分析一、人用狂犬病疫苗的历史和现状1882年，法国人路易巴斯德先生首次成功发明了人用狂犬病疫苗，之后经历了早期的动物神经组织疫苗、禽胚疫苗、细胞培养的粗制疫苗，发展到目前技术日趋完善的原代地鼠肾细胞、鸡胚细胞、人二倍体细胞和Vero细胞培养的纯化疫苗。
早期的神经组织疫苗免疫效果不佳（全程免疫后仍有1‰的死亡病例），且疫苗接种后局部和全身反应严重，由于疫苗中含有动物脑组织的髓磷脂成分，接种后可能引起神经性麻痹反应（变态反应性脑脊髓炎）。
WHO于1984年建议停止生产和使用神经组织疫苗，目前各国已陆续停止使用。
20世纪60年代起，采用细胞和组织胚胎培养技术生产的狂犬病疫苗（CCEEVs）取得了长足发展。
由于采用了细胞培养和纯化技术，CCEEVs避免了产品中残留动物脑组织、细胞蛋白残留等引起的不良反应，提高了疫苗效价和免疫后抗体水平，减少了注射针次，最大限度降低了免疫失败病例。
现已证明，CCEEVs可安全有效地预防狂犬病。
目前广泛使用的有Vero细胞纯化疫苗、人二倍体细胞疫苗、纯化鸡胚细胞疫苗和原代地鼠肾细胞疫苗等。
人二倍体细胞疫苗（HDCV）为美国Wistar研究所首创，随后法国Merieux研究所1974年获得生产许可，经多中心临床人体观察，该疫苗接种后不良反应发生率低、症状轻，免疫效果好。
但是人二倍体细胞增殖慢，病毒产量低，疫苗成本高，价格贵，尚不能得到广泛应用。
纯化Vero细胞狂犬病疫苗由法国Merieux研究所于1985年获得生产许可，人体观察不良反应轻、效果好，与人二倍体细胞疫苗有着同样的安全性和效力。
而且由于培养的狂犬病病毒滴度高、疫苗产量大、价格低，在世界范围得到了广泛的应用。
纯化鸡胚细胞疫苗和原代地鼠肾细胞疫苗根据不同厂家的临床观察，其不良反应较轻微，免疫效果、安全性和有效性均较好。
现代生物技术的发展为新型疫苗的研究提供了更多可能性，比如重组疫苗、DNA疫苗、多肽疫苗等。
我国狂犬病疫苗的历史和现状分析-重庆狂犬抗体检测分析
我国狂犬病疫苗的历史和现状分析一、我国狂犬病疫苗的历史和现状1980年以前，我国一直生产和使用羊脑制备的经石炭酸灭活的脑组织疫苗。
1965年，我国开始研制原代地鼠肾细胞培养的原液灭活疫苗，此疫苗须加入氢氧化铝作为佐剂以增加疫苗效力，1980年获生产许可证书，当时以Habel法测定疫苗效力，要求保护指数≥10000，需皮下注射14针；后改用NIH法测定效价，效价定为1．3IU/2ml，免疫程序也改为5针法。
FangtaoLin的研究显示，该疫苗注射后抗体水平高于羊脑疫苗，对确诊为狂犬病的动物致伤的暴露者有保护作用。
由于新疫苗效价仍较低且免疫失败病例频发，卫生部决定改进疫苗生产工艺，将疫苗培养的病毒原液超滤浓缩3-5倍以提高疫苗中抗原含量，使加入氢氧化铝佐剂后的疫苗效价能达到≥2．5IU的标准。
然而，单纯浓缩疫苗在提高效力的同时，由于杂质蛋白残留物含量相应增高，不良反应发生率升高且症状加重，严重不良反应发生率达5%-10%。
此后，为改进疫苗的质量特性，引入柱层析等纯化技术去除杂质蛋白，疫苗仍然添加氢氧化铝佐剂，NIH法检测效价可达2．5IU以上，达到了WHO设定的疫苗有效标准。
使用WHO推荐的通用的暴露前3针法和暴露后5针法，尽管添加氢氧化铝佐剂可以增加免疫效果，但会导致机体免疫应答缓慢，产生中和抗体延迟。
由于狂犬病疫苗主要用于暴露后免疫，疫苗诱导免疫的时效性非常重要。
2005年，国家食品药品监督管理局要求去除氢氧化铝佐剂。
临床研究显示，去佐剂疫苗的早期免疫反应明显高于佐剂疫苗，初次免疫14天中和抗体阳转率可达100%，且不良反应发生率低。
1990年以来，我国研制或引进Vero细胞为基质的纯化狂犬病疫苗大量上市，2014年，国产人二倍体细胞疫苗也批准上市，疫苗种类不断增多。
分析二、狂犬疫苗行业前景展望由于人二倍体疫苗产量低、大体积生物反应器培养人二倍体细胞难度较大等因素，二代狂犬疫苗仍为国内使用的主流狂犬疫苗。
狂犬病减毒活疫苗的研究进展
中国生物制品学杂志２００８年７月第２ｌ卷第７期ｃｈｉｎ Ｊ Ｂｉｏｌ孵ｃａｌ８ Ｊｌｌｌｙ ２∞８，Ｖ０１．２１ Ｎｏ．７ 文献标识码Ａ
中国圈书分类号磁１７３．９ Ｒ剪２．３３
文章缩号ｌ帅唪５５帕（２嗍）０７舶枷３
【综述】
狂犬病减毒活疫苗的研究进展
明平刚
罗静
严家新
【摘要】减毒活疫苗是新一代狂犬病疫苗的发展方向，应用最近十余年发展起来的反向遗传学技术，有可能在不久的将 来，研制出高效、安全、廉价且使用方便的狂犬病减毒活疫苗。本文就反向遗传系统及４种类型的狂犬病减毒活疫苗的研究进展 作一简要综述。 【关键词】 狂犬病；减毒活疫苗；反向遗传学
在周围神经的感染性降低。 第三类，在病毒基因组中插入额外的Ｇ基因。 为了增强减毒活疫苗毒株的免疫原性，Ｆａｂｅｒ等［１２】 曾尝试在基因组中插人额外的Ｇ基因，以增加Ｇ蛋 白在感染细胞中的表达水平。在该项研究中，Ｆａｂｅｒ 等构建了１株含有２个相同Ｇ基因的重组狂犬病 病毒（ｓＰＢＮＧＡ—ＧＡ株）。２个Ｇ基因均包含了减毒相 关突变，即如前述在Ｇ蛋白的３３３位点的氨基酸残
“ｍ８ ｉＩｌｆｅｃｔｉｏｎ （３）：７５—８０．
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ａ１．ＰｅｒＢｉｓｔｅｎｔｈｉｇＩｌ蛔ｕｅ肿ｉ髓
Ｊ Ｍｅｄ，２００２．３４７（１）：２６．３４．
［１１］Ａｎｎｅｎｉ蚰ｓＨ，Ｈａｎ ＪＹ，Ｄｕｎ删ａｙ ＴＭ，ｅｔ ａ１．ｓａｆｅｔｙ卸ｄ ｉｍｌ眦ｎｏ－
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最近，美国国立卫生研究院（Ｎ砒ｉｏｎａｌ
与在狂犬病病毒感染细胞中所产生的ＲＮＰ复合物 具有相同的生物活性，因此，用反义基因组ＲＮＰ作
为模板，即可合成基因组ＲＮＡ，随后从基因组ＲＮＰ 中合成ｍＲＮＡ，并表达病毒蛋白。基因组ＲＮＰ、其他
生物反应器生产狂犬病疫苗的工艺应用
生物反应器生产狂犬病疫苗的工艺应用作者：张瑜来源：《兽医导刊》 2016年第3期狂犬病是一种致死率非常高的人畜共患病，我国列为甲类传染病，是重要防控疫病。
由于尚无非常有效的治疗方法，因此暴露于该病原后，接种疫苗是最重要预防措施之一。
2015 年OIE 的狂犬病控制计划指出，95% 的人狂犬病是由病犬咬伤所致，如果实现70% 以上的犬免疫，可将人的狂犬病发病率极大降低。
与人预防该病相比，所消耗的费用成本节约近10 倍。
此外加强狗和野生动物狼等易感动物免疫是逐渐净化本病的根本方法。
自从1885 年，Louis Pasteur首次用兔脑和脊髓制备了狂犬病弱毒疫苗，成功保护了第一位狂犬病野毒暴露者。
此后，在疫苗安全性和免疫效果方面不断改进和提高。
狂犬病疫苗经历了神经组织疫苗，禽胚疫苗，细胞培养疫苗的发展历程。
一、狂犬病疫苗毒株及培养基质1. 狂犬病疫苗的发展。
最早的狂犬病疫苗是用感染疫苗毒株的动物脑和脊髓神经组织制备而成。
由于其效价低，免疫产生抗体水平较差，且含有大量神经髓磷脂，存在引发变态反应等缺点。
此后，开发出禽胚组织培养狂犬病疫苗。
1955年，Peck 制备了鸭胚疫苗（DEV）。
虽然鸭胚疫苗在生产工艺又有进一步改善，引起变态反应的危险性降低，但仍然表现出免疫后抗体效价低的特点。
第三代疫苗走上历史舞台，将狂犬病病毒适应于细胞培养，生产细胞培养狂犬病疫苗，主要包括原代细胞疫苗、二倍体细胞疫苗和传代细胞疫苗。
随着生产工艺改进，第三代疫苗免疫效果好，副反应少，能够实现大批量生产，肩负起了目前免疫防控狂犬病的重任。
虽然，狂犬病基因工程疫苗也进行很多研究，包括重组活载体疫苗、亚单位疫苗和基因疫苗等。
2. 狂犬病疫苗毒株。
由于狂犬病分布广泛，各个国家和地区依据本国疫情流行情况，培养筛选出不同的狂犬疫苗毒株。
应用最为广泛的毒株来源于3 个疫苗株：1882 年从狂犬病病犬脊髓分离并通过兔体传代的固定毒巴斯德株(Paris-Pasteur株) ；1939 年从美国一个患病女孩脊髓悬液经鼠脑传代分离，以鸡胚传代的固定毒Flury 株；1935 年美国一个患病犬体内分离的SAD 株，经鼠脑传代固定毒SAD 株。
狂犬病疫苗开发,充满风险和希望的探索
龙源期刊网
狂犬病疫苗开发，充满风险和希望的探索
作者：余凤高
来源：《大众健康》2018年第10期
一场由长春长生掀起的“疫苗事件”，引发了一连串关于疫苗安全与健康屏障的追问。
疫苗身陷多事之秋，责任之失，信任之殇，猜想和臆测交错，焦虑和不安蔓延。
殊不知，作为医学史上最伟大的发明之一，疫苗问世不久即成为让人类免受很多疾病侵扰的希望和曙光。
而处于激流中心的狂犬病疫苗，则是科学家孜孜不倦，甚至以身试险之所得。
读史使人明智，历史的纵横捭阖中，对健康的祈愿、对真理的追求，总是感召人心。
本期健康纵横，为您讲述狂犬病疫苗开发中的那些事儿。
狂犬病疫苗的成功，曾使得疫苗的研制和开发进入一个蓬勃发展的时期。
巴斯德不会想到，他发明的狂犬病疫苗有朝一日竟会陷入舆论的漩涡之中。
狂犬病又称恐水病，系病情凶险的中枢神经系统急性病毒性传染病，常在家犬或野生食肉目动物之间蔓延，患病动物唾液腺含有狂犬病病毒，借撕咬传播。
唾液中的病毒进入伤口后沿神经上行至脑，患者多在三五天内死亡。
这是人类有历史记载以来最古老的疾病之一。
古希腊哲学家亚里士多德在《动物志》中曾写到：“犬由于疯狂会陷入狂暴状态，所有狂暴咬人的动物，也都是因为疯狂的关系。
”古希腊悲剧作家欧里庇得斯的戏剧也曾提到狂犬病。
我国东晋医药学家葛洪（284年～364年）的《肘后备急方》中也有描述，说“凡犬咬人，七日一发。
过三七日不发，则脱也。
要过百日，乃为大免。
”。
狂犬疫苗冻干制剂的制备方法[发明专利]
![狂犬疫苗冻干制剂的制备方法[发明专利]](https://img.taocdn.com/s3/m/c1d00db2e43a580216fc700abb68a98270feac50.png)
(10)申请公布号 (43)申请公布日 2014.01.15C N 103505723A (21)申请号 201310430624.2(22)申请日 2013.09.22A61K 39/205(2006.01)A61K 9/19(2006.01)A61K 47/42(2006.01)A61K 47/38(2006.01)A61P 31/14(2006.01)(71)申请人成都康华生物制品有限公司地址610100 四川省成都市国家经济技术开发区北京路182号(72)发明人蔡勇 杨刚强(54)发明名称狂犬疫苗冻干制剂的制备方法(57)摘要本发明公开了狂犬疫苗冻干制剂的制备方法，在制备过程中，加入了纳米级的氢氧化铝，配置含有麦芽糖、人血白蛋白、维生素C 、半胱氨酸和尿素的磷酸盐缓冲液作为稳定剂，并对常规的冻干工艺路线和参数进行修正优化，通过预冻、一次干燥、二次干燥和解析干燥完成冻干制剂的生产。
本发明与现有的狂犬疫苗相比，通过对冻干过程中的稳定剂组分和保护剂的组分优化，对狂犬疫苗的存储过程起到了良好的防变性、失效功效，同时优化了冻干工艺路线，设置了更为合理的冻干参数，使冻干制剂产品晶体结构稳定，外观符合国家标准。
(51)Int.Cl.权利要求书1页 说明书4页(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请权利要求书1页 说明书4页(10)申请公布号CN 103505723 A1/1页1.狂犬疫苗冻干制剂的制备方法，包括以下制备过程；A 、在经过纯化的疫苗原液中加入纳米级氢氧化铝佐剂，其质量配比为100份疫苗原液中加入10份~15份、粒径为50纳米~90纳米的氢氧化铝佐剂，加入氢氧化铝佐剂后将混合液置于4℃~6℃中吸附；B 、配置Ph 为7.2~7.8的磷酸盐缓冲液，在磷酸盐缓冲液中加入磷酸盐缓冲液质量2%~5%的麦芽糖、1%~5%的人血白蛋白、3%的维生素C 和5%的半胱氨酸和2%的尿素；C 、将步骤B 中的磷酸盐缓冲液加入至步骤A 的溶液中混合，然后加入混合液总质量的1%碳酸氢钠溶液、1%右旋糖酐、2%甘露醇、2%羟甲基纤维素和0.1%~0.5%亚硒酸钠；将混合液冻干 ；D 、前述冻干工艺包括预冻：将经过步骤C 处理的疫苗原液分装入冻干瓶中，冻干瓶置于冻干机内，使其在零下20℃中预冻4h ，然后在零下35℃中预冻2h ；同时开启真空机，使冻干机的真空度维持在8pa~12pa ；一次干燥：调节隔板温度，控制隔板温度维持在零下30℃~零下28℃，真空度维持在15Pa ，保温10h ；二次干燥：调节隔板温度，维持在零下28℃~零下25℃之间，真空度维持在15Pa ，保温15h ；解析干燥：隔板温度升温至15℃，真空度为15Pa ，维持2h ；然后将隔板温度升温至30℃，真空度为10Pa ，保温5h 。
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狂犬病及其疫苗的研制过程
摘要：目的应用Vero细胞研制人用精制狂犬病疫苗。
方法应用Vero细胞经转瓶或生物反应
器培养制备人用精制狂犬病疫苗。
结果各项质控指标均符合WHO 和中国生物制品规程标准, 经
Ⅰ期临床观察疫苗是安全的。
结论用Vero细胞生产的狂犬病疫苗产量大, 效价高, 不良反应
少, 且能进行工业化生产。
关键词：狂犬病病毒疫苗 Vero细胞
狂犬病是一种自然疫源性疾病, 是由狂犬病毒引起的所有温血动物都易感的人兽共患性疾病, 一旦发病, 100%死亡。
唯一有效的预防手段就是及时注射狂犬疫苗。
我国每年需要600万人份左右的狂犬病疫苗。
但是我国现行的原代地鼠肾细胞培养狂犬病疫苗。
生产工艺落后, 生产效率低, 特别是疫苗的稳定性差, 免疫失败的例子很多, 尽管1994 年开始浓缩3～5 倍, 一定程度上解决了疫苗稳定性差的问题, 但浓缩后的副反应比较严重。
所以研制和生产国际上已得到广泛承认和推广的Vero细胞疫苗已势在必行。
狂犬病即疯狗症，又名恐水症，是一种侵害中枢神经系统的急性病毒性传染病，所有温血动物包括人类，都可能被感染。
它多由染病的动物咬人而得。
一般认为口边出白色泡沫的疯狗咬到传染，其实猫，白鼬，浣熊，臭鼬，狐狸或蝙蝠也可能患病并传染。
患病的动物经常变得非常野蛮，在唾液里的病毒从咬破的伤口进入下一个病人。
狂犬病从一个人传到另外一个人极为少见，患狂犬病的人类患者多数会发病身亡。
狂犬病病毒对神经系统有强大的亲和力，病毒进入人体后，主要沿神经系统传播和扩散，病毒侵入人体后先在伤口的骨骼肌和神经中繁殖，这称为局部少量繁殖期，此期可长可短，最短为72小时，最长可达数周、数月甚至更长。
病毒在局部少量繁殖后即侵入神经末梢，沿周围神经以每小时3mm的速度向中枢神经推进，到达脊髓后即大量繁殖，24小时后遍布整个神经系统。
以后病毒又沿周围神经向末梢传播，最后到达许多组织器官，如唾液腺、味蕾、角膜、肌肉、皮肤等，由于头、面、颈、手等部位神经比较丰富，病毒易于繁殖，再加上离中枢神经较近，故这些部位被咬伤后发病者较多，潜伏期也较短；伤势越严重，也越容易发病。
病毒在中枢神经中主要侵犯迷走神经核、舌咽神经核和舌下神经核等。
这些神经核主要支配吞咽肌和呼吸肌，受到狂犬病病毒侵犯后，就处于高度兴奋状态，当饮水时，听到流水声，受到音响、吹风和亮光等刺激时，即可使吞咽肌和呼吸肌发生痉挛，引起吞咽和呼吸困难。
导致狂犬病的病原体是弹状病毒科狂犬病病毒属的狂犬病病毒（Rabies Virus）。
完整的狂犬病病毒呈子弹形，长度大约为200纳米左右直径为70纳米左右。
整个病毒由最外层的脂质双分子层外膜、结构蛋白外壳和负载遗传信息的RNA分子构成。
目前普遍认为狂犬狂犬病说明及防治病病毒有四个不同的血清型。
狂犬病病毒对不利环境的抵抗力非常弱，在表面活性剂、消毒剂如甲醛、升汞、碘酒还有酸碱环境下会很快失去活性，并且对热和紫外线极其敏感。
人用狂犬病疫苗既往种类较多，现今国内外多使用细胞培养疫苗。
我国现在使用的有精制VERO细胞狂犬病疫苗和精制地鼠肾细胞狂犬病疫苗，浓缩地鼠肾细胞狂犬病疫苗已禁用。
狂犬病疫苗人用精制VERO细胞狂犬病疫苗及精制地鼠肾细胞狂犬病疫苗均为轻度混浊白色液体，久放形成可摇散的沉淀，含硫柳汞防腐剂。
1材料和方法
1.1细胞及其培养
Vero 细胞株: 来源于中国药品生物制品检定所, 并进行了细胞的外源因子检查、肿瘤原性检查、染色体检查, 证明该细胞无细菌、霉菌、支原体及病毒污染, 无致肿瘤性, 细胞染色体分布在58～60 之间, 符合世界卫生组织狂犬病专家委员会制定的关于应用传代细胞制备疫苗的规程要求。
1.2狂犬病病毒
狂犬病毒固定毒CTN-1珠，由中国药品生物制品检验所提供。
毒种毒力≥7.5LD50/ML,小白鼠脑内法作中和试验，中和指数大于500，无菌试验及病毒外源因子检查阴性，符合WHO 提出的疫苗生产用毒种要求，并经WHO狂犬病专家委员第七次会议确定，可用于狂犬病疫苗的生产。
1.3病毒滴定及效力试验
按1995年版《中国生物制品规程》进行。
1.4蛋白质含量测定
采用Lowery法。
1.5残余牛血清含量测定
采用反向间接血凝抑制剂实验，所用试剂均为中国药品生物制品鉴定所提供。
1.6Vero细胞残余DNA检测
采用Dig标记点样杂交法。
1.7FPLC
购自Amersham Phamacia Biotech。
1.8超滤器
购自Millipore Co.。
1.9微载体及生物反应器
Cytodex1和Cytodex3购自Amersham Phamacia Biotech；5、15和50L搅拌式生物反应器购自B.Braun Biotech Intermationl。
1.10原苗制备
将Vero 细胞复苏后, 按常规传代到中方瓶中, 经连续5～6次传代分种, 得到足够多的细胞, 再用12～14 个中方瓶转种到一个10L 转瓶中, 使整个转瓶表面形成单层, 转瓶培养长成单层后, 细胞经胰酶和EDTA 消化, 加入CT N-1 液体毒种, 充分吸收后, 继续在转瓶中培养, 37℃, 72h 后洗换掉生长液, 加入维持液, 以后每隔72～96h 收获, 可连续收4～5 次。
生长液为含8%小牛血清的Hanks 液, 维持液不含小牛血清, 但含人白蛋白Hanks 液。
将收获的原液合并, 抽样做毒力、无菌、蛋白含量测定。
1.11下游工艺
用0. 45 m 滤膜澄清原苗, 截留分子量为10 万的超滤膜超滤浓缩, 再经离心和柱层析纯化, 加入 -丙内酯灭活剂, 补加人白蛋白及佐剂, 调pH 至7. 2～ 7. 8, 测定DNA 残留量及灭活效果, 进行分装及成品检定。
1.12检定方法
效力、牛血清蛋白残留量、无菌试验、蛋白含量、毒性试验、理化试验均按文献, 细胞DNA 残留量测定, 按文献。
1.13I期临床观察方案
20名健康志愿者按0、3、7、14、28d在上臂三角肌肌肉内注射1.0ml疫苗。
观察局部反应和全身反应。
2结果与分析
2.1Vero细胞库的建立
将Vero 细胞种子扩增传代, 制备种子细胞库和生产细胞库, 冻存于液氮中。
细胞库经
细菌、霉菌、支原体及外源因子检查均为阴性。
用裸鼠进行致癌性检查, 阳性对照(Hela细胞)10/10 发生肿瘤,Vero细胞（0/10）无肿瘤发生。
染色体检查证明细胞核学稳定, 计数100 个中期细胞, 其染色体分布高峰数目为56~58 条, 符合WHO关于“动物细胞体外培养生产生物制品规程”的要求。
2.2CTN-1V株毒种库的建立
将25代CTN-1V珠Vero细胞上传代, 建立基础毒种库（CTN-1V28）,CTN-1V33代为生产毒种库, 冻存于一70℃冰箱, 并经细菌、霉菌、外源因子、支原体检查均为阴性。
毒力基本上稳定在7.0Log-LD50/ML以上。
2.3疫苗的制备
采用100ML方瓶→2L 方瓶→ 10L转瓶或5L→15L→50L 生物反应器扩增培养Vero 细胞, 待3~5d细胞长成单层可接种毒种, 并用0.05、0.01和0.002MOL进行试验, 种毒后3天开始收毒, 每隔2天收获一次病毒液, 结果表明病毒感染量不同, 病毒滴度（3次平均值）也不同。
2.4疫苗的浓缩、灭活和纯化
将原苗合并后澄清, 经超滤浓缩30 一50倍, 用1/4000的丙内醋灭活病毒, 用硫酸鱼精蛋白去除Vero细胞DNA进行初步纯化, 再经一步柱层析法提纯抗原。
收集I峰合并, 加人人血白蛋白和Al(OH)3, 分装即成精制Vero细胞狂犬病疫苗。
2.5疫苗的检定
用上述工艺生产的3 批Vero细胞狂犬病疫苗,经自检和中国生物制品检定所检定, 疫苗质量均符合WHO规程和《中国生物制品规程》的要求。
2.6期临床观察
1999 年4 月获准I期临床观察, 接种20 名志愿者。
5 针全程免疫后, 未发现全身不良反应, 局部反应极轻微, 极少数接种者注射部位出现疼痛, 但注射后1 一2 d 疼痛消失, 此疫苗是安全的。
3结论与讨论
用Vero细胞生产狂犬病疫苗产量大, 效价高，不良反应小, 且能进行工业化生产。
目前法国巴斯德研究所生产的维尔博狂犬病疫苗就是一种Vero细胞狂犬病疫苗, 其毒株为PM。
国内用Vero细胞作为基质研制的狂犬疫苗和乙型脑炎疫苗都采用了二步柱层析法步骤较为复杂。
本研究先用硫酸鱼精蛋白除去VerO 细胞DNA , 再用Sepharose4FF 一步柱层析法纯化Vero 细胞狂犬病疫苗, 操作简单, 生产的疫苗质量符合W H O规程和( 中国生物制品规程) 的要求。
经I期临床观察证明此疫苗是安全的, 需进行2-3 期临床观察, 进一步评价该疫苗的安全性和免疫效果。
参考文献
[1]黄仕和,桑爱军,乐威等.人用精制Vero细胞狂犬病疫苗的研制.武汉生物制品研究所
[2]窦志勇,李春英,钱浩等.人用纯化Vero 细胞狂犬病疫苗的研制.辽宁省卫生防疫站
[3]于伟,刘兆文,钱浩等.精制Vero细胞狂犬病疫苗的研制及免疫学效果观察。