狂犬病疫苗的研制

狂犬病及其疫苗的研制过程

摘要：目的应用Vero细胞研制人用精制狂犬病疫苗。方法应用Vero细胞经转瓶或生物反应

器培养制备人用精制狂犬病疫苗。结果各项质控指标均符合WHO 和中国生物制品规程标准, 经

Ⅰ期临床观察疫苗是安全的。结论用Vero细胞生产的狂犬病疫苗产量大, 效价高, 不良反应

少, 且能进行工业化生产。

关键词：狂犬病病毒疫苗 Vero细胞

狂犬病是一种自然疫源性疾病, 是由狂犬病毒引起的所有温血动物都易感的人兽共患性疾病, 一旦发病, 100%死亡。唯一有效的预防手段就是及时注射狂犬疫苗。我国每年需要600万人份左右的狂犬病疫苗。但是我国现行的原代地鼠肾细胞培养狂犬病疫苗。生产工艺落后, 生产效率低, 特别是疫苗的稳定性差, 免疫失败的例子很多, 尽管1994 年开始浓缩3～5 倍, 一定程度上解决了疫苗稳定性差的问题, 但浓缩后的副反应比较严重。所以研制和生产国际上已得到广泛承认和推广的Vero细胞疫苗已势在必行。

狂犬病即疯狗症，又名恐水症，是一种侵害中枢神经系统的急性病毒性传染病，所有温血动物包括人类，都可能被感染。它多由染病的动物咬人而得。一般认为口边出白色泡沫的疯狗咬到传染，其实猫，白鼬，浣熊，臭鼬，狐狸或蝙蝠也可能患病并传染。患病的动物经常变得非常野蛮，在唾液里的病毒从咬破的伤口进入下一个病人。狂犬病从一个人传到另外一个人极为少见，患狂犬病的人类患者多数会发病身亡。

狂犬病病毒对神经系统有强大的亲和力，病毒进入人体后，主要沿神经系统传播和扩散，病毒侵入人体后先在伤口的骨骼肌和神经中繁殖，这称为局部少量繁殖期，此期可长可短，最短为72小时，最长可达数周、数月甚至更长。病毒在局部少量繁殖后即侵入神经末梢，沿周围神经以每小时3mm的速度向中枢神经推进，到达脊髓后即大量繁殖，24小时后遍布整个神经系统。以后病毒又沿周围神经向末梢传播，最后到达许多组织器官，如唾液腺、味蕾、角膜、肌肉、皮肤等，由于头、面、颈、手等部位神经比较丰富，病毒易于繁殖，再加上离中枢神经较近，故这些部位被咬伤后发病者较多，潜伏期也较短；伤势越严重，也越容易发病。病毒在中枢神经中主要侵犯迷走神经核、舌咽神经核和舌下神经核等。这些神经核主要支配吞咽肌和呼吸肌，受到狂犬病病毒侵犯后，就处于高度兴奋状态，当饮水时，听到流水声，受到音响、吹风和亮光等刺激时，即可使吞咽肌和呼吸肌发生痉挛，引起吞咽和呼吸困难。

导致狂犬病的病原体是弹状病毒科狂犬病病毒属的狂犬病病毒（Rabies Virus）。完整的狂犬病病毒呈子弹形，长度大约为200纳米左右直径为70纳米左右。整个病毒由最外层的脂质双分子层外膜、结构蛋白外壳和负载遗传信息的RNA分子构成。目前普遍认为狂犬狂犬病说明及防治病病毒有四个不同的血清型。狂犬病病毒对不利环境的抵抗力非常弱，在表面活性剂、消毒剂如甲醛、升汞、碘酒还有酸碱环境下会很快失去活性，并且对热和紫外线极其敏感。

人用狂犬病疫苗既往种类较多，现今国内外多使用细胞培养疫苗。我国现在使用的有精制VERO细胞狂犬病疫苗和精制地鼠肾细胞狂犬病疫苗，浓缩地鼠肾细胞狂犬病疫苗已禁用。狂犬病疫苗人用精制VERO细胞狂犬病疫苗及精制地鼠肾细胞狂犬病疫苗均为轻度混浊白色液体，久放形成可摇散的沉淀，含硫柳汞防腐剂。

1材料和方法

1.1细胞及其培养

Vero 细胞株: 来源于中国药品生物制品检定所, 并进行了细胞的外源因子检查、肿瘤原性检查、染色体检查, 证明该细胞无细菌、霉菌、支原体及病毒污染, 无致肿瘤性, 细胞染色体分布在58～60 之间, 符合世界卫生组织狂犬病专家委员会制定的关于应用传代细胞制备疫苗的规程要求。

1.2狂犬病病毒

狂犬病毒固定毒CTN-1珠，由中国药品生物制品检验所提供。毒种毒力≥7.5LD50/ML,小白鼠脑内法作中和试验，中和指数大于500，无菌试验及病毒外源因子检查阴性，符合WHO 提出的疫苗生产用毒种要求，并经WHO狂犬病专家委员第七次会议确定，可用于狂犬病疫苗的生产。

1.3病毒滴定及效力试验

按1995年版《中国生物制品规程》进行。

1.4蛋白质含量测定

采用Lowery法。

1.5残余牛血清含量测定

采用反向间接血凝抑制剂实验，所用试剂均为中国药品生物制品鉴定所提供。

1.6Vero细胞残余DNA检测

采用Dig标记点样杂交法。

1.7FPLC

购自Amersham Phamacia Biotech。

1.8超滤器

购自Millipore Co.。

1.9微载体及生物反应器

Cytodex1和Cytodex3购自Amersham Phamacia Biotech；5、15和50L搅拌式生物反应器购自B.Braun Biotech Intermationl。

1.10原苗制备

将Vero 细胞复苏后, 按常规传代到中方瓶中, 经连续5～6次传代分种, 得到足够多的细胞, 再用12～14 个中方瓶转种到一个10L 转瓶中, 使整个转瓶表面形成单层, 转瓶培养长成单层后, 细胞经胰酶和EDTA 消化, 加入CT N-1 液体毒种, 充分吸收后, 继续在转瓶中培养, 37℃, 72h 后洗换掉生长液, 加入维持液, 以后每隔72～96h 收获, 可连续收4～5 次。生长液为含8%小牛血清的Hanks 液, 维持液不含小牛血清, 但含人白蛋白Hanks 液。将收获的原液合并, 抽样做毒力、无菌、蛋白含量测定。

1.11下游工艺

用0. 45 m 滤膜澄清原苗, 截留分子量为10 万的超滤膜超滤浓缩, 再经离心和柱层析纯化, 加入 -丙内酯灭活剂, 补加人白蛋白及佐剂, 调pH 至7. 2～ 7. 8, 测定DNA 残留量及灭活效果, 进行分装及成品检定。

1.12检定方法

效力、牛血清蛋白残留量、无菌试验、蛋白含量、毒性试验、理化试验均按文献, 细胞DNA 残留量测定, 按文献。

1.13I期临床观察方案

20名健康志愿者按0、3、7、14、28d在上臂三角肌肌肉内注射1.0ml疫苗。观察局部反应和全身反应。

2结果与分析

2.1Vero细胞库的建立

将Vero 细胞种子扩增传代, 制备种子细胞库和生产细胞库, 冻存于液氮中。细胞库经