昆虫sf9细胞培养
昆虫细胞的培养综述
昆虫细胞培养及其应用进展摘要: 随着生命科学的迅速发展, 细胞工程愈来愈受到人们的重视。
以昆虫细胞为对象的细胞培养技术在现代实验生物学上具有重要的价值, 已经广泛地应用于医学、农业及生物学的各个领域。
本文综述了有关昆虫细胞培养的研究进展, 包括昆虫细胞培养基研究开发, 昆虫细胞系的建立和组织培养, 利用生物反应器大规模培养昆虫细胞, 昆虫细胞2杆状病毒表达系统,构建基因工程细胞系及其稳定性表达, 以及昆虫细胞培养的应用前景和研究展望。
关键词: 昆虫细胞系; 昆虫细胞培养; 基因表达;培养条件昆虫的组织培养最早始于1915 年, 直到1962 年Grace 才成功建立了世界上第一个细胞系, 此后昆虫细胞培养在世界范围内广泛开展, 不断有新细胞系建立的报道。
现在, 昆虫细胞培养已在细胞生物学、分子生物学、昆虫学、病毒学、生物化学、遗传学等领域的研究工作中发挥着重要的作用。
1昆虫细胞培养基昆虫细胞培养基的发展经历了天然培养基、合成培养基和无血清培养基三个阶段. 天然培养基采用取自动物体液或从组织中提取的成分作为培养液. 合成培养基最大的特点是各种成分已知.无血清培养基是在已知细胞所需营养物质和贴壁因子基础上, 在基础培养基中加入适宜的促细胞生长因子, 能够保证细胞生长良好无须补加血清的培养基. 昆虫细胞培养基的发展主要是合成培养基的发展.[1] 体外培养昆虫组织的首创者是R ichard Ben2dict (1915), 但他当时没有合适的昆虫细胞培养基。
T rager 首次研究了培养基中昆虫细胞的生长条件, 目的是证明单个细胞能在体外存活几天, 并利用昆虫细胞培养基研究昆虫和哺乳动物病毒。
1956 年, Silver W yatt 改进了用于家蚕(B om byx m ori L innaeus) 蛹的培养基, 成功地使细胞存活了14d。
他的培养基含有浓度与家蚕血淋巴成分相应的21 种氨基酸、5 种盐、3 种有机酸、以及果糖、海藻糖和葡萄糖, 并相应调解了pH 值和渗透压, 这为昆虫细胞培养基的研究奠定了重要的基础。
sf9细胞冻存方法
sf9细胞冻存方法
SF9细胞是一种昆虫表达系统中常用的细胞系。
下面是一种常
见的SF9细胞冻存方法：
1. 在培养皿中培养SF9细胞至高密度（通常为培养皿80-90%
的细胞覆盖度）。
2. 用DPBS（无钙无镁的磷酸盐缓冲液）洗涤细胞一次，以去
除培养基和细胞碎片。
3. 使用酶解液（例如Trypsin-EDTA）将细胞从培养皿中解离。
根据细胞的密度，可以使用适当的溶菌酶/胰酶酶解细胞。
4. 加入同等体积的冻存培养基（通常为细胞培养基中含有20-50%的人血清、10%的二甲基亚砜（DMSO）和1-2%的低浓度抗生素的培养基）。
5. 轻轻混合并将混合液转移到冻存管中。
6. 使用-80℃冰箱或液氮罐冷却细胞冻存过程。
最好将细胞冻
存在气相中且不接触液氮。
7. 冻存细胞超过12小时后，将冻存管从液氮中转移到-150℃
以上的长期液氮储存罐中。
使用这种冻存方法，SF9细胞可以在-70℃至-80℃下保存6个
月至1年以上。
为了确保细胞质量，建议每6个月检查一次细胞的生长和表达能力。
请注意，在冻存细胞前，确保培养细
胞没有被细菌、真菌等污染，以避免污染的细胞冻存在长期储存中。
昆虫细胞培养基-sf-900 ii sfm 1x液体版 说明书
Sf-900™ II SFMDescriptionSf-900™ II SFM is a complete, serum-free, protein-free, ready-to-use insect cell culture medium developed for high cell-density growth and high-level recombinant protein expression using the Baculovirus Expression Vector System (BEVS). Sf-900™ II SFM has optimized amino acid, carbohydrate, vitamin, and lipid components, as well as a biologically active raw material providing significant improvement in cell growth, virus production and recombinant protein expression over other serum-free or serum-supplemented media. Sf-900™ II SFM supports long term growth (>20 passages) of Spodoptera frugiperda (Sf9, Sf21), Trichoplusia ni (Tn-368), and Lymantia dispar (Ld) cells in both suspension and monolayer culture.Product Catalog No. Amount Storage Shelf life*Sf-900™ II SFM (1X), liquid 10902-09610902-15310902-08810902-104500 mL10 × 500 mL1000 mL6 × 1000 mL2°C to 8°C; Protect from light 12 monthsSf-900™ II SFM (1X), liquid, Universal Bag 10902-16110902-17910902-187 5 L10 L20 L2°C to 8°C; Protect from light 12 monthsSf-900™ II SFM (1X), liquid w/out methionine or cysteine 21012-026 500 mL 2°C to 8°C; Protect from light 12 months * Shelf life duration is determined from Date of Manufacture.Product useFor Research Use Only. Not for use in diagnostic procedures. Important informationSf-900™ II SFM is a complete, ready to use medium. Do not addL-Glutamine or surfactants such as Pluronic® F-68.Safety informationRead the Safety Data Sheets (SDSs) and follow the handling instructions. Wear appropriate protective eyewear, clothing, and gloves.Culture ConditionsMedia: Sf-900™ II SFMCell line: Sf9, Sf21, Ld, Tn-368 cellsCulture type: Suspension or AdherentCulture vessels: Shake flask, spinner bottle or T-flask. Temperature range: 27°C to 28°CIncubator atmosphere: Non-humidified, air regulated non-CO2 atmosphere. Ensure proper gas exchange and minimize exposure of cultures to light.Recovery1.Rapidly thaw (<1 minute) frozen cells in a 37°C water bath.2.Transfer entire contents of the cryovial into theappropriately sized vessel so that the cells are seeded at3–5 × 105 cells/mL of pre-warmed Sf-900™ II SFM.3.Incubate at 28°C in a non-humidified, air regulated non-CO2atmosphere, on an orbital shaker platform rotating at120–140 rpm. Loosen flask caps to allow for gas exchange. 4.Subculture when cells reach >2 × 106 viable cells/mL. Werecommend subculturing cells a minimum of 3 passagesbefore using in downstream applications. Subculture suspension culturesInsect cells are sensitive to physical shearing. Ensure that impeller mechanisms rotate freely and do not contact vessel walls or base (adjust prior to autoclaving).1.Determine viable cell density using a Countess® AutomatedCell Counter or alternative automated or manual method. 2.Seed cells at 3–5 × 105 viable cells/mL in sterile culturevessels containing pre-warmed Sf-900™ II SFM. (30 mL per125-mL shake flask, 75–100 mL per 100-mL spinner bottle).3.Incubate at 27°C to 28°C in a non-humidified, air regulatednon-CO2 atmosphere. Loosen caps to allow for gas exchange.4.Rotate shake flask cultures on an orbital shaker platform at120–140 rpm, set impeller stirring rate to 85–95 rpm forspinner bottles (optimum impeller speed must be empirically determined for each spinner apparatus for robust cell growth and viability).5.Subculture cells when viable cell density reaches>2 × 106 viable cells/mL (about twice a week) into clean,sterile flask(s) with fresh pre-warmed Sf-900™ II SFM. Note: If cell debris is observed, gently centrifuge the cell suspension at 100 × g for 5–10 minutes and resuspend the cell pellet in fresh Sf-900™ II SFM to reduce accumulation of cell debris and metabolic waste by-products.Note: We recommend thawing a fresh low-passage vial of cells every 3 months or 30 passages.Subculture monolayer cultures1.Observe cell monolayer to ensure 80–90% confluence.Aspirate medium and floating cells from a confluentmonolayer.2.Add 4 mL (per 25 cm2) pre-warmed Sf-900™ II SFM to theflask and resuspend cells by repeatedly pipetting themedium across the monolayer.3.Observe cell monolayer to ensure cell detachment from thesurface of the flask. Firmly rap the side of the flask on thepalm of your hand or a hard flat surface if necessary.Publication Number MAN0007285 Rev. 1.002.4. Transfer entire cell suspension to a sterile conical tube; anycell clumps quickly settle to the bottom after 1–2 minutes. Pipet the clumps into a 10-mL pipette and gently break up the clumps by pressing the pipette tip against the bottom of the tube and gently expell the cells back into the medium, repeat if necessary to break up remaining clumps. Pipetting too harshly will decrease cell viability due to sensitivity of cells to shear force.5. Determine viable cell density using a Countess ® AutomatedCell Counter.6. Inoculate 2–5 × 104 viable cells/cm 2 into new culture flaskscontaining pre-warmed Sf-900™ II SFM (5 mL/25 cm 2). 7. Incubate at 27°C to 28°C in a non-humidified, air regulatednon-CO atmosphere. Loosen caps to allow for gas exchange. 28. Three days post-plating, aspirate medium from the cellmonolayer and re-feed the culture with an equal volume of fresh medium gently added to the side of the flask. Note: Sf9 cells are not anchorage dependent and may be transferred between monolayer and spinner/shaker culture repeatedly without noticeable change in viability, morphology, or growth rate.For additional technical information such as Safety Data Sheets (SDS), Certificates of Analysis, visit /support For further assistance, email ************************All trademarks are the property of Thermo Fisher Scientific and its subsidiaries unless otherwise specified. Pluronic is a trademark of BASF Corporation. ©2014 Thermo Fisher Scientific Inc. All rights reserved.DISCLAIMER - LIFE TECHNOLOGIES CORPORATION AND/OR ITS AFFILIATE(S) DISCLAIM ALL WARRANTIES WITH RESPECT TO THIS DOCUMENT, EXPRESSED OR IMPLIED, INCLUDING BUT NOT LIMITED TO THOSE OF MERCHANTABILITY, FITNESS FOR A PARTICULAR PURPOSE, OR NON-INFRINGEMENT. TO THE EXTENT ALLOWED BY LAW, IN NO EVENT SHALLLIFE TECHNOLOGIES AND/OR ITS AFFILIATE(S) BE LIABLE, WHETHER IN CONTRACT, TORT, WARRANTY, OR UNDER ANY STATUTE OR ON ANY OTHER BASIS FOR SPECIAL, INCIDENTAL, INDIRECT, PUNITIVE, MULTIPLE OR CONSEQUENTIAL DAMAGES IN CONNECTION WITH OR ARISING FROM THIS DOCUMENT, INCLUDING BUT NOT LIMITED TO THE USE THEREOF.Adapt cells to Sf-900™ II SFMIt is critical that cell viability be ≥90% and the growth rate be in mid-logarithmic phase prior to initiating adaptation procedures.Direct adaptationMonolayer cultures need only have the culture media exchanged with prewarmed Sf-900™ II SFM as described in Subculture monolayer cultures.Transfer suspension cultures into Sf-900™ II SFM as follows: 1. Centrifuge the cell suspension at 100 × g for 5–10 minutes.Aspirate and discard the supernatant.2. Resuspend the cell pellet in pre-warmed Sf-900™ II SFM at aviable cell density of >5 × 105 cells/mL and transfer to appropriate culture vessel.3.Return to incubator and monitor cell growth.Note: If suboptimal performance is achieved using the direct adaptation method, use the sequential adaptation method.Sequential adaptationFollow the procedures for subculture of suspension or monolayer cultures with the following modifications.1. During the adaptation procedure use a seeding density of>5 × 105 viable cells/mL.2. Subculture cells into stepwise increasing ratios of Sf-900™ IISFM to original medium with each subsequent passage (25:75, 50:50, 75:25, 90:10 followed by 100% Sf-900™ II SFM). Multiple passages at each step may be needed.After several passages in 100% Sf-900™ II SFM, the viable cell count should exceed 2–4 × 106 cells/mL with a viability exceeding 85% within 4–6 days of culture.Cryopreservation1. Prepare the desired quantity of cells, harvesting in mid-logphase of growth with viability >90%. Reserve theconditioned medium to prepare cryopreservation medium.Determine the viable cell density and calculate the requiredvolume of cryopreservation medium to give a final cell density of >1 × 107 cells/mL.3. Prepare the required volume of cryopreservation medium of92.5% Sf-900™ II SFM (50:50 ratio of fresh to conditioned media) + 7.5% DMSO on day of intended use, store at 4°C until use.4. Centrifuge cell suspension at 100 × g for 5–10 minutes.Resuspend the cell pellet in the pre-determined volume of 4°C cryopreservation medium.5. Dispense aliquots of this cell suspension into cryovialsaccording to the manufacturer’s specifications.6. Cryopreserve in an automated or manual controlled ratefreezing apparatus following standard procedures (1°C decrease per minute).7. Transfer frozen cells to liquid nitrogen, (vapor phase)°C to –125°C.storage at –200Related productsProductCatalog no. Sf9 Cells Adapted in Sf-900™ II SFM 12659 Sf21 Cells Adapted in Sf-900™ II SFM 12682 BaculoDirect ™ N-Term Expression Kit 12562-054 BaculoDirect ™ N-Term Transfection Kit 12562-062 BaculoDirect ™ C-Term Expression Kit 12562-013 BaculoDirect ™ C-Term Transfection Kit 12562-039 Bac-N-Blue ™ Transfection KitK855-01 Bac-to-Bac ® Baculovirus Expression System 10359 Bac-to-Bac ® Vector Kit10360Countess ®Automated Cell CounterC10227Explanation of symbols and warningsThe symbols present on the product label are explained below:Temperature LimitationManufacturerBatch codeUse By:Catalog numberCaution, consult accompanying documentsConsult instructionsfor useKeep away from lightSterilized using aseptic processing techniquesLimited product warrantyLife Technologies Corporation and/or its affiliate(s) warrant their products as set forth in the Life Technologies’ General Terms and Conditions of Sale found on Life Technologies’ website at /termsandconditions . If you have any questions, please contact Life Technologies at /support .Important licensing informationThese products may be covered by one or more Limited Use Label Licenses. By use of these products, you accept the terms and conditions of all applicable Limited Use Label Licenses.。
sf-9细胞培养2
血清中含有: 血清中含有: 多种蛋白质(白蛋白,球蛋白,铁蛋白等) ①多种蛋白质(白蛋白,球蛋白,铁蛋白等) ②多种金属离子 激素; ③激素; 促贴附物质,如纤粘蛋白,冷析球蛋白, ④促贴附物质,如纤粘蛋白,冷析球蛋白,胶 原等. 原等. ⑤各种生长因子 ⑥转移蛋白 ⑦不明成分
血清质量好坏是实验成败的关键. 血清质量好坏是实验成败的关键. 常用血清有胎牛血清,新生牛血清,小牛血清, 常用血清有胎牛血清,新生牛血清,小牛血清, 兔血清,马血清等,其中以胎牛血清质量最好. 兔血清,马血清等,其中以胎牛血清质量最好. 优质血清的标准:透明,淡黄色,无沉淀物, 优质血清的标准:透明,淡黄色,无沉淀物, 无细菌,支原体,病毒污染. 无细菌,支原体,病毒污染. 血清的灭活(消除补体活性): ):56 血清的灭活(消除补体活性):56 ℃ ,30 min 血清的消毒: 血清的消毒:过滤除菌
实验要求: 实验要求:
进实验室先洗手,签到.进细胞培养室要换鞋. 进实验室先洗手,签到.进细胞培养室要换鞋. 洗手 必须保持显微镜,试验桌,超净台以及其它用具 的清洁和整齐,各种药品,试剂按照规定的用量 进行使用.用完后要恢复摆放位置 进行使用.用完后要恢复摆放位置. 恢复摆放位置. 严格遵守显微镜使用的注意事项,否则损坏物镜, 同时也影响试验的进行. 离开实验室前,必须检查水龙头和电开关,避免 发生事故.
培养皿和培养板等表面消毒
超净台
超净工作台的工作原 理是利用鼓风机驱动 空气遁过高效滤器除 去空气中的尘埃粒, 使空气得到净化. 净化空气徐徐通过工 作台面,使工作台内 构成无菌环境.
生化培养箱
生化培养箱设定的条件为28 ℃ . 使用生化培养箱培养细胞时应注 意的问题: 1)保持培养箱内空气干净.定 期消毒 (90 ℃ ,14 h). 2)箱内灭菌蒸馏水3000ml蒸馏 水槽中以保持箱内湿度,避免培 养液蒸发.
配置Sf9细胞培养液方法
Sf9细胞培养液配置方法
1.消毒烘干下列用品
500毫升玻璃瓶：两个（其中一个灌装500 毫升高洁水备用）
玻璃烧杯：一个、玻璃量筒：一个
2.准备下列设备
天平、搅拌器、称量纸、量勺、75%酒精、酒精棉球、试验用手套
3.UV消毒
用清洁液擦净洁净台；工作区域用酒精拭擦一遍。
所有准备好的用品和设备预先放进
洁净台；UV消毒至少2个小时；工作前关闭UV灯，打开内置灯和风扇
4.称量
用称量纸称出相当于制备250毫升培养液的粉末(约11.7g)，倒入玻璃烧杯中
5.溶解、定容
将玻璃烧杯至于搅拌器上，缓缓加入约100-150毫升的清洁水。
将搅拌器调至低速，
缓缓搅拌；溶解过程中不能产生泡沫，产生泡沫意味着蛋白变性；将溶解后的培养液
加入到量筒内；必要时补充水量直至250毫升。
6. 调节pH
按4.7mL 7.5%NaHCO3/L培养液的比例加入NaHCO3，逐滴加入1N NaOH至pH值为
5.9。
过滤后培养液pH值为
6.2左右。
7.过滤
用无菌针筒将培养液缓缓通过0.22m的过滤膜过滤，必要时更换新的过滤器；过滤液
直接进入消毒玻璃瓶中。
8.加入双抗和FBS
按照相应比例，加入1%双抗和10%胎牛血清。
9.标记、保存
过滤后的培养液要标明制备日期。
根据使用需要可将培养液分别保存在4度或-20度。
4度保存的培养液使用不超过1周；-20度保存的培养液使用不超过一个月。
昆虫细胞培养手册
昆虫细胞系的生长和维持细胞系简介：本手册包括Sf9、Sf21和H5昆虫细胞以及提供相关昆虫细胞生长和维持的一般信息。
Sf9、Sf21和H5细胞系适于用杆状病毒或其他昆虫表达系统表达重组蛋白。
运输与储存：运输：置于干冰上。
储存和传代：置于液氮储存。
收到细胞即可开始，详见14页。
细胞系比较：下面的表格总结了Invitrogen细胞系一般特征。
订购信息见下页。
细胞 倍增时间 细胞外观 初始培养基Sf9 72h 规则的带有颗粒球形。
贴壁紧。
TNM-FHSf21 24h 不同大小带有颗粒球形。
贴壁紧。
TNM-FHH5 18h 不同大小带有颗粒球形。
贴壁松。
Express Five SFM重要事项：Invitrogen（生命技术部分）通过RT-PCR证实H5细胞藏匿有内生的野田病毒。
在一定条件下，H5产生野田病毒粒子。
如此产生的病毒粒子未表现出对内原蛋白表达的不利的影响，或着在限制使用证书66号下已延伸和提供对H5细胞其它研究应用（见35页）。
更多信息请联系技术支持。
用途：仅供研究使用。
禁止用于动物或人的疾病治疗和诊断。
Sf9和Sf21细胞系：来源：Sf9（货号B825-01）和Sf21（货号B821-01）细胞系是传统的用于杆状病毒表达的细胞系，源于美国农业部昆虫病理实验室。
此细胞系适用于InsectSelect系统。
这两株细胞衍生于IPLBSF-21细胞系，来源于秋蝇蠕虫（草地夜蛾）蛹的卵巢组织。
特征：Sf9和Sf21有下列共同特征：易于形成单层和悬浮培养、适用无血清培养基。
大小不同：Sf9细胞系克隆分离于IPLBSF21-AE(Sf21)。
体积较小大小规则的使其易于形成单层和铺培养板。
Sf21在大小和形成单层以及铺板规则上有一些不同。
用途：两者都适于转染、纯化、生产高滴度病毒、铺板以及表达重组蛋白。
如果你是第一次使用杆状病毒，你会发现Sf9细胞易于从斑块中分离。
在一些结构上Sf21细胞可能比Sf9细胞表达蛋白量高。
SF9细胞的建立及生物学特性的鉴定
2020年第8期 吉林畜牧兽医97·经验交流·JingYan JiaoLiuSF9细胞的建立及生物学特性的鉴定李来旭1，刘鑫莹1、潘添博2，李 睿31.重庆永健生物制品有限公司，重庆市 400000；2.重庆市合川区合阳城街道办事处畜牧兽医站，重庆市 400000；3.东北农业大学，黑龙江哈尔滨 150000摘 要：自菌种保藏中心引进1株SF9细胞系，扩大培养，保存于液氮，建立SF9细胞基础细胞库。
对细胞进行形态、生长曲线、纯净性、染色体分析及致瘤性等特性进行研究。
结果表明，细胞呈圆球形；细胞呈S 型生长曲线；无细菌、支原体及外源病毒污染；细胞的染色体数目主要分布在170～190之间；无致瘤性。
关键词：SF9细胞系；基础细胞库；生物学特性杆状病毒表达系统(BEVS)被广泛用于疫苗开发及外源蛋白表达。
BEVS 因其操作简便、安全性及适用于大规模生产等优势, 具有极大的应用前景。
杆状病毒表达的受体为昆虫细胞，目前应用较广的细胞系为SF9细胞。
目前兽用疫苗领域针对猪圆环病毒、禽流感病毒、猪瘟病毒及鸡新城疫病毒等多疫苗在SF9 细胞中表达，极大程度上缓解了畜牧业的养殖风险和生产成本。
本研究自菌种保藏中心引进SF9细胞系，进行细胞生物学特性研究，为开展SF9细胞系及及传染性法氏囊VP2疫苗的研究与开发提供细胞资源和理论依据。
1 材料和方法1.1 材料1.1.1 细胞SF9细胞，购自美国菌种保藏中心ATCC。
1.1.2 试验试剂：SF9无血清培养基，胎牛血清，DMSO 购自美国gibco 公司；无菌培养基，重庆永健生物制品有限公司制备。
1.2 方法1.2.1 细胞传代：取对数生长期的SF9细胞，以900 r/min 离心5 min，弃去上清，用SF9无血清培养基稀释细胞密度为0.8×106个/mL 分装到三角培养瓶中。
培养转速为150 r/min，置27 ℃培养箱中培养。
1.2.2 基础细胞库的建立 取生长状况良的好SF9细胞进行离心，加入冻存液，吹打混匀细，调节细胞密度为1.2×107个/m L ，每只冻存管分装1 mL。
Sf9细胞的培养及转染解析
超净台
超净工作台的工作原 理是利用鼓风机驱动 空气遁过高效滤器除 去空气中的尘埃粒， 使空气得到净化。
净化空气徐徐通过工 作台面，使工作台内 构成无菌环境。
生化培养箱
• 生化培养箱设定的条件为28℃ 。 • 使用生化培养箱培养细胞时应注
意的问题：
• 1）保持培养箱内空气干净。定 期消毒（90 ℃ ，14 h)。
转染基本步骤
• 1、接种细胞并使其贴壁 • 2、制备重组Bacmid与Cellfectin Reagent
（ ）复合物 Invitrogen公司转染试剂 • 3、加入复合物 • 4、去掉复合物混合液，加入完全培养基，
培养细胞直到细胞出现病毒感染迹象 • 5、取上清液分离纯化得目的蛋白
• 4）送入培养箱中继续培养。
细胞培养－换液
• 对于像Sf9这样的半贴壁的培养物，可按如 下步骤操作：
• 吸去或倾出（部分或全部）旧培养液。 • 加入新鲜的培养液。加入的量与换液前的
量相同。 • 放回原来的培养箱中继续培养。
转染
• 转染(transfection)指真核细胞由于外源DNA 掺入而获得新的遗传标志的过程。
病毒重组，获得重组病毒（酶切酶连转化） 2、将重组的病毒纯化 3、感染昆虫细胞或虫体（转染） 4、外源基因随着病毒的复制而获得表达
*《人细小病毒B19- XA株VP1蛋 白在Bac- to-Bac系 统中的表达及其反应原性》 *《Bac-toBac® Baculovirus Expression System 实验流程》
• （2）5分钟内用培养液稀释至原体积的10 倍以上。
• （3）低速离心10分钟。 （4）去上清，加新鲜培养液培养刚复苏的 细胞。
Sf9细胞的培养工艺
第19卷第3期1998年8月化 工 冶 金Engineering Chem istry &M etallu rgy V o l 119N o 13A ug 11998收稿日期:1997206209,修回日期:1997210216王晓迟:女,25岁,硕士,生物化学工程专业・研究简报・Sf 9细胞的培养工艺王晓迟 戚艺华 欧阳藩中国科学院化工冶金研究所生化工程国家重点实验室 北京 100080)细胞进行环境pH 值由低到高的值为710的培养液中即不能其次进行了培养液血清浓度由高到低2◊时细胞仍可,104个 m l 数量级是其生长的临界接种密度.关键词 Sf 9细胞,培养工艺,pH 值,血清浓度,接种密度中图分类号 Q 281 前 言80年代以来,Sf 9昆虫细胞—杆状病毒系统被广泛用于各种重组蛋白的表达.该细胞有许多优点,如非贴壁依赖性、培养温度低、可在无血清体系中繁殖等,很适合高密度、大规模培养.与之相关的各种发酵设备也在不断被开发.对Sf 9细胞的研究既能为动物细胞大规模培养找到一个新的对象,又可使推广多种以该细胞为表达系统的基因工程产品成为可能.要利用这株细胞,首先要对其培养工艺有全面、深入的了解,然而目前Sf 9细胞培养工艺方面的研究成果大部分属于商业机密,文献报道很少.本文从静止培养入手,对几项关键性的工艺条件进行了研究.2 材料和方法211 细胞系Sf 9昆虫细胞,来自美国A TCC (160～220代).212 细胞培养液21211 pH 梯度实验培养液用二次蒸馏水溶解IPL 241昆虫细胞培养基干粉(G I BCO ,Inc .),加0135g LN aHCO 3,用215m o l LN aOH 调pH 至设定值,以0122Λm 滤膜过滤除菌,向滤后液中加入2◊胰蛋白肉汤(G I BCO ,Inc .),1◊制霉菌素,50单位 m l 庆大霉素以及10◊的热灭活小牛血清.21212 血清梯度实验培养液先将有血清培养液的pH 调至612,然后加入设定浓度的热灭活血清,除血清条件外其余同上;无血清培养液Sf 2900II SFM (G I BCO ,Inc .)中加入2◊胰蛋白肉汤.872化 工 冶 金19 卷21213 密度梯度实验培养液将pH调至612,加10◊血清,其余同21211.213 实验方法21311 pH梯度实验将在初始pH=612的培养液中生长到对数期的细胞传至pH=615的培养液中,适应生长1代;待细胞密度达到105个 m l以后稳定传代2次;然后依次传至初始pH=618和pH=710的培养液中驯化.观察细胞在每种条件下的生长规律.21312条件下生长到对数期的细胞传至含8◊血清的培养液中,适应生长1周,2次;然后依次传至含5◊和2◊血清的培养液中驯化观察细胞在每种条件下的生长规律.21313密度梯度实验分别以较高密度(5×105和1×105个 m l)、中等密度(5×104和1×104个 m l)及低密度(5×103和1×103个 m l)接种Sf9细胞进行培养,观察细胞在每种条件下的生长规律.3 结果与讨论311 pH梯度实验Sf9细胞在pH=615的环境中适应很快,1代以后就能良好生长,适应pH=618的环境比较困难,连续传代3次才得以稳定生长,在pH=710的环境中始终难以存活.Sf9细胞在不同pH环境中的生长状况如图1所示,以pH=612的培养液中的细胞为对照组.由图可知,Sf9细胞在初始pH=615的培养液中生长良好,与对照组相比差别不大,延迟期24h,最大细胞密度由接种时的104个 m l数量级增加到105个 m l数量级;培养液初始pH=618时,细胞的生长开始受到影响,生长速率缓慢,延迟期增加至48h,最大细胞密度远小于对照组;培养液初始pH值提高到710时,细胞已不能存活.Sf9细胞生长过程中,各组培养液pH值的变化情况见图2.Sf9细胞在初始pH值为612,615和618的3种培养液中生长时,培养液的pH值总体上均呈升高趋势,其pH增加值不超过0131在pH=710条件下细胞已不能正常生长,其培养液pH值的检测也随细胞的死亡而终止.Sf9细胞的最适pH值为612,略偏酸性,而中性条件更利于工业化生产和多种基因工程产品的稳定,因此进行了该细胞对高pH值环境的适应性实验.结果发现,培养液的pH值随着细胞的生长会略有增加,这可能是由于Sf9细胞在生长过程中产生乳酸的量较少,并且在乳酸积累时还会反过来利用它作为碳源;同时培养液中的许多酸性成份如精氨酸等在细胞生长旺盛时被大量消耗,所以引起了培养液pH值升高,但这种升高仍然是缓慢的和不显著的.初始pH=710时培养液pH值的上升可能是由于细胞死亡裂解,释放出胞内碱性成份的缘故.培养液初始pH值提高到615对细胞生长的影响不大,但继续升高至618时细胞的生长状况已明显不如对照组,在初始pH值为710的培养液中Sf9细胞已不能存活,说明此时的pH值已超出了该细胞的适应范围.因此,较大幅度地提高培养液的pH值在Sf9细胞的培养过程中极为困难.图1 Sf 9细胞在各种pH 值条件下的生长曲线F ig 11 Sf 9cell grow th at vari ouspH 图2 各组实验中培养液的pH 值变化曲线F ig 12 V ariati on of pH of culture w ith different initial pH 图3 Sf 9细胞在不同血清浓度的培养液中的生长曲线F ig 13 Sf 9cell grow th in culture w ith different concentra 2ti on of serum312 血清梯度实验Sf 9细胞对于含8◊血清的培养液适应很快,1代之后即可良好生长;适应5◊的血清需传代2次,共12d ;适应2◊的血清较慢,共需3代18d ;由2◊的血清到无血清培养液适应较快,需2代10d .Sf 9细胞在不同血清浓度下的生长状况如图3所示.Sf 9细胞在含8◊血清的培养液中生长良好,延迟期24h ,最大细胞密度由接种时的104个 m l 数量级增加到105个 m l 数量级,与常用浓度10◊条件下基本相同;细胞在含5◊血清的培养液中延迟期增加至48h ,生长速度减慢,但仍属于正常生长状态;当血清浓度降至2◊时细胞仍可生长,出现72h 的延迟期,最大细胞密度值较低;该细胞在无血清培养液中生长良好,各项指标均接近在10◊常用浓度下的情况.因此该细胞具有较强的低血清适应性.同时,Sf 9细胞在已经过优化的市售无血清培养液中生长良好,如需尽可能地消除血清对实验造成的影响,可以考虑采用无血清培养系统.313 密度梯度实验不同接种密度时Sf 9细胞的生长状况如图4～6所示.105个 m l 数量级接种时,Sf 9细胞的生长十分迅速,不出现延迟期而直接进入对数生长阶段,最大细胞密度增加至106个 m l 数量级;104个 m l 数量级接种时,细胞处于正常生长状态,有24h 的延迟期,倍增迅速,最大细胞密度值增加至105个 m l 数量级;103个 m l 数量级接种时,细胞有4d 的延迟期,生长过于缓慢,已失去实际操作意义.当以较高密度接种时,细胞的启动生长极为迅速,这可能是由于细胞密度较高时,与之相关的各种激素、生长因子、酶及其它细胞因子的浓度也较高,同时细胞间的频繁接触有利于多种因子的分泌,从而增强了细胞活力的缘故;当以低密度接种时,细胞生长过于缓慢,说明此接种量限制了细胞的正常生长,因此初始接种密度对Sf 9细胞的生长影响很大,直接关系其延迟期的长短和最大细胞密度值的大小.9723期王晓迟等:Sf 9细胞的培养工艺图4 Sf 9细胞在较高密度接种时的生长曲线F ig 14 Sf 9cell grow th in culturew ith h igh density of inoc 2ulati on 图5 Sf 9细胞在中等密度接种时的生长曲线F ig 15 Sf 9cell grow th in culture w ith m edium density of inoculati on 图6 Sf 9细胞在低密度接种时的生长曲线F ig 16 Sf 9cell grow th in culture w ith low density of inocu 2lati on 另一方面,由图6可知,103个 m l 数量级接种时,细胞生长已不正常,所以104个 m l 数量级是Sf 9细胞的临界接种密度,低于这一密度会出现超长延迟甚至不生长.4 结 论根据上面的实验结果可以得出以下结论:(1)Sf 9细胞对于环境pH 值的适应能力十分有限;在生长过程中,培养液的pH 值是逐渐升高的,但总的变化幅度不大.(2)Sf 9细胞对于低血清环境的适应性很强.(3)初始接种密度对Sf 9细胞的生长影响很大,该细胞的临界密度约为104个 m l 数量级.本文对Sf 9细胞静止培养的几项关键性工艺条件进行了初步研究,其结果可作为进一步放大培养的理论依据.参考文献 1Caro l J .M arcus -Sekura et al .Confo r m ati on -dependent recogniti on of Baculovirus -exp ressed Ep stein -barr V irus gp 350by a Panel of M onoclonal A ntibody .Journal of General V iro logy ,1993,74:2171 2Summ ers M .D .,Sm ith G .E .Baculovirus Structural Po lypep tides .A M anual of M ethods fo r Baculovirus V ecto rs andInsect Cell Culture P rocedures .T exas ,U SA ,T exas A gricultural Experi m ent Stati on and T exas A &M U niversity Co l 2lege Stati on ,1987.10 3王国政等.动物细胞大量培养.生物工程进展,1988,8(4):11 4卢锦汉等.医学生物制品学.北京:人民卫生出版社,1995.528 5W ong et al ,R elati onsh i p betw een O xygen U p take R ate and T i m e of Infecti on of Sf 9Insect Cells Infected w ith a R ecom 2binant Baculovirus.Cyto techno logy ,1994,15:157 6Bertheussen K .Grow th of Cells in a N ew D efined P ro tein -free M edium .Cyto techno logy ,1993,11:219082化 工 冶 金19 卷THE CUL TURE TECHNOLOG Y OF Sf 9CELL SW AN G X iaoch i Q I Y ihua OU YAN G Fan(Inst .Che m .M eta ll .,Ch inese A cad e m y of S ciences ,B eij ing 100080,Ch ina )ABSTRACT Sf 9cells are cultured staticly w ith different pH ,serum concentrati on and inoculati on densi 2ty .It is found that the cell culture is sensitive to pH change and cells hardly grow in the m edium w ith an ini 2tial pH of 7.0,pH of the culture m edium increases sligh tly during the culture and Sf 9cells can grow w ell in the m edium w ith serum concentrati on as low as 2◊.A critical inoculati on density of 104cells m l is foundnecessary fo r the grow th of Sf 9cells.KEY WOR D S Sf 9cells ,Culture techno logy ,pH ,Serum concentrati on ,Inoculating density 化工冶金研究所学位论文简介有机硫代磷酸2有机铵协萃体系萃取分离镉锌的研究 选择有机硫代磷酸作为萃取剂,合成与提纯了二2(22乙基己基)二硫代磷酸(D 2EHD T PA ,简称二硫代磷酸)和二2(22乙基己基)单硫代磷酸(D 2EHM T PA ,简称单硫代磷酸).在分别考察了其萃取效果后,进一步系统研究了这两种有机硫代磷酸与3种有机胺(伯胺N 1923、仲胺DOA 和叔胺TOA )协同萃取体系的性能与机理.总的来说,二硫代磷酸2有机胺协萃体系的萃取能力较优.对各体系,一般萃镉的能力大于萃锌的能力.硫酸盐溶液中,镉、锌分离的综合性能的优良顺序如下:D 2EHD T PA -TOA >D 2EHD T PA -DOA >D 2EHM T PA -TOA >D 2EHD T PA -N 1923,D 2EHM T PA -DOA ,D 2EHM T PA -N 1923用恒界面池法对D 2EHD T PA 2TOA 萃取镉体系进行了动力学研究,该萃取过程属于界面反应模式,表观活化能为4412kJ m o l ,反应历程为BHA i =BH +i +A -i(1)BH i +=B i +H i +(2)Cd i 2++A -i k 1k -1CdA +i (3)CdA +i +A -i k 1k -2CdA 2i (4)CdA 2(O )+BHA (O )=CdA 2 BHA (O )(5)其中式(3)与(4)为速率控制步骤,CdA +为反应活性中间产物,下标i 表示在界面上,下标(O )表示有机相,B 为有机胺,BH +为胺阳离子,A -为有机硫代磷酸根阴离子.最后,用实际的含镉、铜和锌的浸出液进行新协萃体系检验,取得了较好的分离效果,从而提出了萃取分离无渣新工艺建议流程.(摘自化工冶金研究所1997年张大力的博士学位论文,导师:柯家骏,卢立柱)1823期王晓迟等:Sf 9细胞的培养工艺。
Sf9细胞的培养及转染
Bacmid
? 能快速、高效产生的重组AcMNPV 病毒。 取杆状病毒( baculovirus) 和质粒( plasmid) 的英文字头字尾命名为Bacmid，即杆状病 毒质粒之意。该载体可像质粒一样在大肠 杆菌中生长，又对鳞翅目昆虫细胞具有感 染性。
昆虫杆状病毒表达系统的构成
表达过程： 1、将外源目的基因插入到启动子下游与杆状
Sf-9细胞的培养及转染
Sf-9细胞
? Sf-9细胞是由G.E. Smith 和 C.L. Cherry 在1983年从细胞株IPLB-SF 21 AE得来的一 个克隆。IPLB-SF 21 AE是1977年由Vaughn 等从草地夜蛾蛹的卵巢组织得到的。
? Sf-9是半贴壁的细胞，贴壁性不强，可贴 壁培养也可悬浮培养。
? （2）5分钟内用培养液稀释至原体积的10 倍以上。
? （3）低速离心10分钟。 （4）去上清，加新鲜培养液培养刚复苏的 细胞。
Sf9细胞的传代
? 判断分离（散）细胞培养物是否需要传代 的主要指标就是观察培养物是否已基本长 满培养瓶皿的底壁。
? 一般来说，原代培养物未达到生长基质的 80%表面面积，不要急于传代，对于拟行 首次传代的培养物更如此。
? 2）箱内灭菌蒸馏水3000ml蒸馏 水槽中以保持箱内湿度，避免培 养液蒸发。
培养瓶
拿培养瓶的正确姿势：拇指和食指夹住培养瓶， 瓶口向外，中指托住瓶底。保持瓶子的水平， 防止培养液倒向瓶口。
血球计数板
细胞冻存和复苏
? 冻存和复苏的原则：慢冻快融
– 当细胞冷到零度以下，可以产生以下变化：细 胞器脱水，细胞中可溶性物质浓度升高，并在 细胞内形成冰晶。
? 4）送入培养箱中继续培养。
细胞培养－换液
sf9
Spodoptera frugiperda（草地夜蛾）卵巢细胞形态：上皮细胞生长特性：贴壁注释：Sf-9细胞是由G.E. Smith 和C.L. Cherry 在1983年从细胞株IPLB-SF 21 AE得来的一个克隆。
IPLB-SF 21 AE是1977年由Vaughn等从草地夜蛾蛹的卵巢组织得到的。
培养液：TNM-FH培养液：照厂家的说明配好Grace's Antheraea 培养液，每升培养液加3.3g 酵母粉和3.3g乳白蛋白水解物，用1M KOH调pH到6.2-6.4过滤除菌，4℃保存。
完整培养液在使用前加入10%热灭活的胎牛血清。
传代：用吸液管吹洗细胞使其悬浮，或用手从侧面拍打细胞培养瓶(当用大细胞培养瓶时)重悬细胞。
杆状病毒表达系统(baculovirus expression system)是近年来应用较多的真核表达系统，它可以在昆虫细胞中表达多种外源基因，包括真菌，植物，细菌，病毒的基因。
杆状病毒是一类以昆虫细胞为天然宿主的双链DNA病毒，具有高度的种属特异性，不感染脊椎动物，对人、畜无害。
目前研究较多的是苜蓿银纹夜蛾核多角体病毒(AcNPV) ，其宿主是草地贪夜蛾。
而sf9细胞，正是杆状病毒表达系统的宿主细胞之一。
sf9细胞属于半贴壁型细胞系，可以进行悬浮培养，也可以进行贴壁培养，在应用于蛋白的表达与制备纯化中，有着许多的优点。
杆状病毒表达系统的主要优越性有：①表达的重组蛋白能正确折叠，并形成二硫键；②翻译后可进行修饰加工如糖基化、磷酸化、酰胺化及信号肽切割等，使重组蛋白在结构和功能上更接近天然蛋白；③与其他真核表达系统相比，杆状病毒表达系统可以高效表达外源基因，表达量最高可达被感染昆虫细胞总蛋白量的5 0 ％；④可以容纳大片段外源基因。
SF21,sf9昆虫细胞
sf9昆虫细胞货号基因名称规格货期huayueyang-531sf9昆虫细胞1ml 现货细胞描述：Sf9昆虫细胞，可以用来包装扩增杆状病毒并表达蛋白。
Sf9昆虫细胞增殖能力取决于培养技术、培养条件等综合因素。
请按照正确的培养方法来复苏、传代，以此保证细胞具备良好的增殖能力，方便您的后继研究顺利进行。
质量控制：本细胞经过严格的质量检测，不含有细菌、真菌、病毒（HIV、HBV、HCV）和支原体等。
培养条件：27℃，PH值7.2~7.4，120–140rpm，无菌恒温培养。
用途：本产品仅供科研使用，不可用于治疗等其他用途。
细胞相关操作：sf9细胞复苏1.37°C水浴预热培养基；2.从液氮中取出细胞放入37°C水浴快速解冻（解冻后不要继续暖细胞）；3.在超净台中加入5ml的培养基重悬细胞，1000rpm离心5min；4.4.弃上清，加入5ml培养基重悬细胞，用血小球计数板进行细胞计数，按细胞密度3-5×105/ml接种到25ml无菌摇瓶中（带空气过滤通气孔的摇瓶）；5.摇瓶置于27°C培养箱中的摇瓶架上，120–140rpm培养。
sf9细胞传代1.取细胞计数(详见sf9细胞冻存)，当细胞密度达到1–3×106/ml时，可传代；2.37°C水浴预热培养基；3.在超净台中，加适量预热好的培养基到无菌摇瓶中，以细胞终密度为3-5×105/ml接种细胞（也可1000rpm，5min离心后弃上清，用预热好的培养基重悬并调整细胞密度为3-5×105/ml）；4.摇瓶置于27°C培养箱中的摇瓶架上，120–140rpm培养。
注：昆虫细胞对氧的要求较高，因此，悬浮培养必须具有高表面积体积比，否则细胞的生长会受到抑制。
培养基的体积不能超过摇瓶的五分之二；即100毫升的摇瓶不能超过40ml培养基，250ml摇瓶不能超过100ml培养基。
Sf9昆虫细胞悬浮培养工艺研究
Sf9昆虫细胞悬浮培养工艺研究李伟;秦红刚;张萍;漆世华;朱薇;王威;谢红玲;温文生;吴玉石【摘要】对Sf9昆虫细胞在不同培养基、培养基中是否添加血清及不同生物反应器中的培养工艺进行了研究,发现Sf9细胞在Sf900Ⅱ无血清培养基中生长比在添加10％小牛血清的Grace培养基中更好,在Sf900Ⅱ无血清培养基14 L搅拌式生物反应器分批培养细胞密度可达1.4×107/mL.过程生化特性分析表明,总氨基酸的消耗及主要代谢副产物特别是乳酸及游离氨的积累是培养后期细胞密度降低及活性下降的重要原因.本研究为Sf9细胞生物反应器培养工艺优化及利用昆虫杆状病毒蛋白表达系统高效表达重组蛋白生产亚单位疫苗奠定了良好基础.【期刊名称】《中国兽药杂志》【年(卷),期】2012(046)008【总页数】4页(P39-42)【关键词】Sf9细胞;生物反应器;生化分析【作者】李伟;秦红刚;张萍;漆世华;朱薇;王威;谢红玲;温文生;吴玉石【作者单位】武汉中博生物股份有限公司,武汉430070;武汉中博生物股份有限公司,武汉430070;武汉中博生物股份有限公司,武汉430070;武汉中博生物股份有限公司,武汉430070;武汉中博生物股份有限公司,武汉430070;武汉中博生物股份有限公司,武汉430070;武汉中博生物股份有限公司,武汉430070;武汉中博生物股份有限公司,武汉430070;武汉中博生物股份有限公司,武汉430070【正文语种】中文【中图分类】Q962昆虫细胞杆状病毒表达系统是20世纪80年代发展起来的新型表达载体系统，据报道现已成功应用于500多种外源蛋白的表达［1］。
相比贴壁依附型的哺乳动物细胞，昆虫细胞可直接进行悬浮培养而更具有优越性。
不同昆虫细胞系在不同培养基中的生长动力学及代谢参数已有文献报道［2］。
理论及实验表明，利用重组杆状病毒感染高密度的Sf9细胞可获得高水平的外源蛋白的表达［3］。
应用激流式生物反应器大规模悬浮培养昆虫细胞(sf9)的工艺研究
应用激流式生物反应器大规模悬浮培养昆虫细胞(sf9)的工艺研究赵立民;蒋天华;罗乃杰【摘要】应用激流式生物反应器对大规模悬浮培养sf 9细胞的工艺进行了研究,通过摸索细胞接种密度、溶解氧(DO)、反应器转速3项工艺参数,成功实现了sf 9细胞的大规模悬浮培养,细胞密度最高可达到0.8~1.5×106/ml,生长状态良好【期刊名称】《山东畜牧兽医》【年(卷),期】2012(000)008【总页数】2页(P12-13)【关键词】激流式生物反应器;sf9细胞;接种密度;DO;转速【作者】赵立民;蒋天华;罗乃杰【作者单位】广东温氏食品集团有限公司研究院广东新兴 527400;广东温氏食品集团有限公司研究院广东新兴 527400;广东温氏食品集团有限公司研究院广东新兴 527400【正文语种】中文【中图分类】Q962sf 9细胞由G.E. Smith和C.L. Cherry在1983年从细胞株IPLB-SF 21 AE得来的一个克隆，是目前国际上常用的细胞株之一，可作为猪圆环病毒(PCV)等多种病毒的宿主细胞，用于生产兽用疫苗，也可用于昆虫细胞/杆状病毒表达系统，制备各种农业杀虫剂等，用途广泛[1]。
相比哺乳动物细胞，昆虫细胞对生长环境要求苛刻，所需培养液营养丰富，添加的血清须是高质量的胎牛血清[2]。
细胞本身娇弱，对剪切力敏感，较难以反应器发酵的方式进行大规模培养。
激流式生物反应器是目前国内新兴的一次性生物反应器，具有剪切力小、控制精准、操作简单、规模易放大等特点。
本文采用该反应器，通过对相关工艺参数的摸索，进行了sf 9细胞大规模悬浮培养工艺的实验研究。
1.1.1 细胞系 sf 9昆虫细胞，购自武汉生物所，100～150代。
1.1.2 细胞培养液 Grace干粉培养基(Gibco)，每升添加0.35gNaHCO3、1.3g水解乳蛋白、3g酵母提取物，用Millipore超纯水溶解，稀HCl调节pH至6.2后，0.22mm滤芯除菌过滤；使用时添加10%热灭活胎牛血清(Hyclone)。
昆虫细胞培养手册
昆虫细胞系的生长和维持细胞系简介：本手册包括Sf9、Sf21和H5昆虫细胞以及提供相关昆虫细胞生长和维持的一般信息。
Sf9、Sf21和H5细胞系适于用杆状病毒或其他昆虫表达系统表达重组蛋白。
运输与储存：运输：置于干冰上。
储存和传代：置于液氮储存。
收到细胞即可开始，详见14页。
细胞系比较：下面的表格总结了Invitrogen细胞系一般特征。
订购信息见下页。
细胞 倍增时间 细胞外观 初始培养基Sf9 72h 规则的带有颗粒球形。
贴壁紧。
TNM-FHSf21 24h 不同大小带有颗粒球形。
贴壁紧。
TNM-FHH5 18h 不同大小带有颗粒球形。
贴壁松。
Express Five SFM重要事项：Invitrogen（生命技术部分）通过RT-PCR证实H5细胞藏匿有内生的野田病毒。
在一定条件下，H5产生野田病毒粒子。
如此产生的病毒粒子未表现出对内原蛋白表达的不利的影响，或着在限制使用证书66号下已延伸和提供对H5细胞其它研究应用（见35页）。
更多信息请联系技术支持。
用途：仅供研究使用。
禁止用于动物或人的疾病治疗和诊断。
Sf9和Sf21细胞系：来源：Sf9（货号B825-01）和Sf21（货号B821-01）细胞系是传统的用于杆状病毒表达的细胞系，源于美国农业部昆虫病理实验室。
此细胞系适用于InsectSelect系统。
这两株细胞衍生于IPLBSF-21细胞系，来源于秋蝇蠕虫（草地夜蛾）蛹的卵巢组织。
特征：Sf9和Sf21有下列共同特征：易于形成单层和悬浮培养、适用无血清培养基。
大小不同：Sf9细胞系克隆分离于IPLBSF21-AE(Sf21)。
体积较小大小规则的使其易于形成单层和铺培养板。
Sf21在大小和形成单层以及铺板规则上有一些不同。
用途：两者都适于转染、纯化、生产高滴度病毒、铺板以及表达重组蛋白。
如果你是第一次使用杆状病毒，你会发现Sf9细胞易于从斑块中分离。
在一些结构上Sf21细胞可能比Sf9细胞表达蛋白量高。
昆虫sf9细胞培养
Sf9培养要点：温度：27-28摄氏度pH：，sf9最适的pH6.2，随培养时间的延长，Ph值会增加传代时间：72h（三天左右）细胞来源：Sf9（货号B825-01）和Sf21（货号B821-01）细胞系是传统的用于杆状病毒表达的细胞系，源于美国农业部昆虫病理实验室。
此细胞系适用于InsectSelect系统。
这两株细胞衍生于IPLBSF-21细胞系，来源于秋蝇蠕虫（草地夜蛾）蛹的卵巢组织。
（以上来自invitrogen）细胞特点：规则的带有颗粒球形。
贴壁紧。
标准条件的定义：培养最低密度：0.6/ml（健康对数生长期细胞活率至少应不低于90％。
活率低于90％细胞不是在最佳条件下培养不能用于实验）1×/mL将出现对数生长状态传代培养：传代培养需将细胞调整到维持对数生长状态和最大活率。
贴壁培养: 贴壁细胞传代需在细胞长成单层（如下定义）然后1：5（细胞体积：最后培养基体积）稀释维持对数生长。
形成单层细胞可以传代培养悬浮培养：在细胞密度达到2.0×-2.5×细胞/mL后将密度调整至0.7×-1.0×细胞/mL进行悬浮传代。
确保传代细胞密度不高于4×个/mL或保持密度高于1×个/mL以达到对数生长状态。
Sf9悬浮培养所需要的细胞数培养基：sf-900 Ⅲ SFM（添加2%的血清减小感染过程中蛋白水解量）培养瓶与培养体积：冻存：一旦细胞系建立且倍增规律则可以进行冻存。
细胞需达到90％活率和80-90％融合的要求（如：低代次）推荐冻存几管。
当融解细胞，它将会达到最佳使用状态。
1. 用细胞计数板计数细胞。
需要足够的如上表所示密度的细胞冻存2-4管。
细胞可是悬浮或贴壁培养；2. 将无菌冻存管立于冰上，做好标记；3. 室温400-600×g离心10min。
移除上清。
4. 以给定的密度在冻存液中重悬细胞；5. 移取1mL细胞悬液置于无菌冻存管中；6. 置于-20℃1h，然后移至-80℃24-48h；7. 储存于液氮中。
草地贪夜蛾细胞株Sf9生测杀虫剂毒力的方法探索
162020.4中国农药生物测定作为一种手段，广泛应用于农药的筛选、毒力测定与药效试验及抗药性检测等方面。
目前,国内外主要采用活体昆虫进行杀虫剂筛选和毒力测定。
在长期的研究过程中,活体昆虫生物测定已形成一整套比较规范并且标准化的经典方法。
由于活体昆虫生测前期准备需要大量时间，试虫需常年于养虫室中饲养繁殖建立起敏感种群，环境条件要求十分严格；另外活体昆虫生测往往存在供试虫体基数需求量大、虫龄大小不一、生理生态质量难以掌握、测定周期较长、劳动密集、其结果往往需要校正等问题，很难满足杀虫剂的高通量测定。
因此，利用细胞株系进行杀虫剂毒力测定受到了学者们的关注。
早期Stipanovic 等测定了棉酚系列天然产物对烟芽夜蛾细胞系的毒力，结果与田间小区试验有良好的相关性。
周青春等测定7种有机磷和氨基甲酸酯类杀虫剂细胞与活体生物测定LD 50值大小顺序完全一致。
张志祥等对19种茼蒿素类似物进行了离体细胞筛选，实验结果与以斜纹夜蛾、小菜蛾和小菜粉蝶活体幼虫筛选的结果基本一致。
研究证明，采用昆虫细胞系进行杀虫剂筛选和毒力测定时，多数杀虫剂能够直接作用于细胞内相应靶标，可以排除活体昆虫体壁对杀虫剂的阻碍作用及体内代谢作用的干扰，这可为杀虫剂作用机理的研究提供更为直接的证据。
此外，离体昆虫细胞生物测定法还具有准确、简便、快速、高效和灵敏等特点；离体培养的细胞所处环境相同，遗传背景相似，还能为化学药物及微生物杀虫剂的定量测试提供极大的方便，所测得的LC 50值稳定性比活体测试好。
与活体测试相比离体生测直接从细胞水平上反映了毒力的差异，弥补了活体毒力测定耗时耗量的不足。
草地贪夜蛾细胞株Sf9生测杀虫剂毒力的方法探索Sf9系草地贪夜蛾卵巢细胞株，现在已经商品化生产，培养条件及技术十分成熟，广泛应用于昆虫毒理、昆虫病毒学研究。
本文通过比较不同类型、同一类型和不同剂型杀虫剂对Sf9细胞和活体试虫小菜蛾触杀毒力，探索建立利用Sf9细胞生物测定方法，以期为杀虫剂快速筛选、毒力测定等提供新的途径。
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超净台
超净工作台的工作原 理是利用鼓风机驱动 空气遁过高效滤器除 去空气中的尘埃粒， 使空气得到净化。
净化空气徐徐通过工 作台面，使工作台内 构成无菌环境。
生化培养箱
• 生化培养箱设定的条件为28℃ 。 • 使用生化培养箱培养细胞时应注
意的问ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ：
• 1）保持培养箱内空气干净。定 期消毒（90 ℃ ，14 h)。
• 一般来说，原代培养物未达到生长基质的 3）接种在新的培养瓶皿内。
Bac-to-Bac expression system
80%表面面积，不要急于传代，对于拟行 生化培养箱设定的条件为28℃ 。
当温度达-100℃时，可迅速放入液氮中细胞冻存 3）接种在新的培养瓶皿内。
首次传代的培养物更如此。 有时候，传代仅为了使培养物经历并适应传代处理过程，在培养物细胞数量不大的情况下，传代时还只是接种在一个培养瓶皿内。
Sf细胞的培养及转染
Sf-9细胞的形态
培养细胞生长的条件
• 1、细胞的营养需要 • 2、细胞的生存环境
温度: 28℃ 氧
渗透压 • 3、无污染 • 4、无毒
实验材料：
• 实验用品： • 超净工作台，压力蒸汽消毒器，电热干燥箱，滤
器，酸缸 • 生化培养箱 • 倒置显微镜 • 酶标仪、微孔板震荡器 • 液氮罐 • 自动双重纯水蒸馏器，纯水仪 • 耗材： • 培养瓶，吸管，电动吸引器，培养板， 冻存管
吹打过程须有序进行，亦即要从一边开始到另一边结束，尤其是器皿的边缘地带和四角处，确保瓶皿底壁各处的细胞均被吹打脱离。 棉铃虫核型多角体病毒( HaNPV)
昆虫细胞Sf9悬浮培养表达尿激酶原(pro-UK)
昆虫细胞Sf9悬浮培养表达尿激酶原(pro-UK)
常韶华;孙洪亮;郭雁;李佐虎
【期刊名称】《药物生物技术》
【年(卷),期】1998(5)4
【摘要】研究了悬浮培养昆虫细胞 Sf9时感染指数 (MOI)、感染时间和培养基营养状况对重组蛋白激酶原 (pro- UK)表达的影响。
发现在转瓶培养中采用 MOI3、感染对数中期细胞所产生的重组蛋白的量最高 ,酶活可达 42 0 U/ml。
在反应器中采用同样感染条件 ,重组蛋白的表达量可达530 U/ml。
在转瓶培养中采取感染后换液处理 ,重组蛋白的表达可提高至 61 0
【总页数】3页(P207-209)
【关键词】昆虫细胞;重组;杆状病毒;悬浮培养;尿激酶原
【作者】常韶华;孙洪亮;郭雁;李佐虎
【作者单位】中国科学院化工冶金研究所;北京大学生命科学院
【正文语种】中文
【中图分类】Q556;Q78
【相关文献】
1.应用bac-to-bac杆状病毒表达系统在sf9昆虫细胞中重组表达保守性多巴胺能神经营养因子蛋白 [J], 张俊;牛朝诗;梅加明;汤深凤;李静
2.应用杆状病毒表达系统在Sf9昆虫细胞中重组表达Legumain蛋白 [J], 李兴育;张华;李娟;田冰玉
3.应用激流式生物反应器大规模悬浮培养昆虫细胞(sf9)的工艺研究 [J], 赵立民;蒋天华;罗乃杰
4.Sf9昆虫细胞悬浮培养工艺研究 [J], 李伟;秦红刚;张萍;漆世华;朱薇;王威;谢红玲;温文生;吴玉石
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Sf9培养要点：
温度：27-28摄氏度
pH：，sf9最适的pH6.2，随培养时间的延长，Ph值会增加
传代时间：72h（三天左右）
细胞来源：Sf9（货号B825-01）和Sf21（货号B821-01）细胞系是传统的用于杆状病毒表达的细胞系，源于美国农业部昆虫病理实验室。
此细胞系适用于InsectSelect系统。
这两株细
（以上来自invitrogen）胞衍生于IPLBSF-21细胞系，来源于秋蝇蠕虫（草地夜蛾）蛹的卵巢组织。
细胞特点：规则的带有颗粒球形。
贴壁紧。
标准条件的定义：
培养最低密度：0.6×106/ml（健康对数生长期细胞活率至少应不低于90％。
活率低于90％细胞不是在最佳条件下培养不能用于实验）1×106/mL将出现对数生长状态
传代培养：传代培养需将细胞调整到维持对数生长状态和最大活率。
贴壁培养: 贴壁细胞传代需在细胞长成单层（如下定义）然后1：5（细胞体积：最后培养基体积）稀释维持对数生长。
形成单层细胞可以传代培养
悬浮培养：在细胞密度达到2.0×106-2.5×106细胞/mL后将密度调整至0.7×106-1.0×106细胞/mL进行悬浮传代。
确保传代细胞密度不高于4×106个/mL或保持密度高于1×106个/mL以达到对数生长状态。
Sf9悬浮培养所需要的细胞数
培养基：sf-900 ⅢSFM（添加2%的血清减小感染过程中蛋白水解量）
培养瓶与培养体积：
冻存：一旦细胞系建立且倍增规律则可以进行冻存。
细胞需达到90％活率和80-90％融合的要求（如：低代次）推荐冻存几管。
当融解细胞，它将会达到最佳使用状态。
1. 用细胞计数板计数细胞。
需要足够的如上表所示密度的细胞冻存2-4管。
细胞可是悬浮或贴壁培养；
2. 将无菌冻存管立于冰上，做好标记；
3. 室温400-600×g离心10min。
移除上清。
4. 以给定的密度在冻存液中重悬细胞；
5. 移取1mL细胞悬液置于无菌冻存管中；
6. 置于-20℃1h，然后移至-80℃24-48h；
7. 储存于液氮中。
转染的细胞：需要的是对数期的细胞＞95%发育能力，可以完成成功的转染。
载氧：对于最优生长条件和蛋白的表达，昆虫细胞要求被动的通氧。
积极的通氧系统要求溶氧饱和在10%-50%
Sf900II和sf900Ⅲ的区别：一般推荐Sf900II来大量表达蛋白
Sf900II含有表面活性剂（剪切力保护剂（保护细胞在转瓶中培养时不会受到剪切力伤害））
当设计纯化多聚组氨酸标签蛋白的计划时，注意无血清培养基不能直接用于螯合树脂，因为培养基的成分会除去树脂中的镍离子。
细胞培养的一般顺序：复苏——传代——传代稳定——冻存
应当遵循的一般过程：复苏——贴壁培养——悬浮——悬浮扩大培养（产生目标蛋白）（也可不经过贴壁培养，直接悬浮培养）
贴壁时间：45min
悬浮的转速：80rpm
附：离心机rcf与g的换算：
无血清培养基可以选择性加入一定的抑菌剂防止细菌或者真菌污染：
培养基：GIBCO-SFM900
加青霉素链霉素抑制细菌生长两性霉素B抑制真菌生长。