昆虫sf9细胞培养
杆状病毒——昆虫细胞表达系统
实验材料：1. 重组杆状病毒质粒：Bacmid/nsp-6及阳性对照Bacmid/CAT，已构建成功。
2. 昆虫细胞Sf9、High Five及其相关培养基、转染试剂均购自Invitrogen公司。
抗His单克隆抗体购自Oncogene公司，CAT-ELISA试剂盒购自Roche。
实验步骤：一、昆虫细胞转染：1． Sf9细胞计数，取6孔板中的两孔，每孔加入9×10 5个细胞(其中一孔设为正常对照)，并以全培培养至少1小时，使细胞贴壁。
2．准备重组质粒和细胞转染试剂的混合物：a. 溶解1μg纯化重组杆状病毒重组质粒于100μl 无添加成分的Grace’s Medium。
b. 转染试剂充分摇匀后取6μl加入100μl 无添加成分的Grace’s Medium，混匀。
c. 将上述稀释好的质粒及稀释好的转染剂混匀，室温孵育20min。
3．重组质粒与转染剂混合液孵育的同时，以2ml无添加成分的Grace’s Medium洗涤待转染的一孔细胞并弃去洗液。
4．取0.8ml无添加成分的Grace’s Medium加入质粒与转染剂的混合液中，轻轻混匀后，总体积约为1ml。
加入上步洗涤后的细胞孔中，27℃继续培养5h。
5．移除质粒、转染剂混合物，加入2ml全培。
27℃湿盒孵育，直到病变现象产生。
二、病毒贮液的制备：1. 病毒感染晚期（正常24-72h）可见细胞停止生长、黏附，呈颗粒状外观。
即收集含病毒的培养上清，500g离心5min，去除细胞和碎片。
2. 上清即为P1病毒贮液，移入新的离心管中4℃避光保存。
长期保存分装冻存于-80℃。
3. 病毒贮液的扩增，按以下公式进行所需病毒P1贮液的量：感染所需病毒贮液量(ml)=[MOI(pfu/cell) ×细胞数÷病毒贮液效价(pfu/ml)]注：若不进行病毒空斑测定，P1贮液效价按照1×10 6到1×10 7计。
4. 扩增P1液制备P2病毒贮液方法如下：a. 转染当天，取2×106个细胞/孔加入六孔板中，贴壁生长至少1h。
sf9细胞冻存方法
sf9细胞冻存方法
SF9细胞是一种昆虫表达系统中常用的细胞系。
下面是一种常
见的SF9细胞冻存方法：
1. 在培养皿中培养SF9细胞至高密度（通常为培养皿80-90%
的细胞覆盖度）。
2. 用DPBS（无钙无镁的磷酸盐缓冲液）洗涤细胞一次，以去
除培养基和细胞碎片。
3. 使用酶解液（例如Trypsin-EDTA）将细胞从培养皿中解离。
根据细胞的密度，可以使用适当的溶菌酶/胰酶酶解细胞。
4. 加入同等体积的冻存培养基（通常为细胞培养基中含有20-50%的人血清、10%的二甲基亚砜（DMSO）和1-2%的低浓度抗生素的培养基）。
5. 轻轻混合并将混合液转移到冻存管中。
6. 使用-80℃冰箱或液氮罐冷却细胞冻存过程。
最好将细胞冻
存在气相中且不接触液氮。
7. 冻存细胞超过12小时后，将冻存管从液氮中转移到-150℃
以上的长期液氮储存罐中。
使用这种冻存方法，SF9细胞可以在-70℃至-80℃下保存6个
月至1年以上。
为了确保细胞质量，建议每6个月检查一次细胞的生长和表达能力。
请注意，在冻存细胞前，确保培养细
胞没有被细菌、真菌等污染，以避免污染的细胞冻存在长期储存中。
sf-9细胞培养2
血清中含有: 血清中含有: 多种蛋白质(白蛋白,球蛋白,铁蛋白等) ①多种蛋白质(白蛋白,球蛋白,铁蛋白等) ②多种金属离子 激素; ③激素; 促贴附物质,如纤粘蛋白,冷析球蛋白, ④促贴附物质,如纤粘蛋白,冷析球蛋白,胶 原等. 原等. ⑤各种生长因子 ⑥转移蛋白 ⑦不明成分
血清质量好坏是实验成败的关键. 血清质量好坏是实验成败的关键. 常用血清有胎牛血清,新生牛血清,小牛血清, 常用血清有胎牛血清,新生牛血清,小牛血清, 兔血清,马血清等,其中以胎牛血清质量最好. 兔血清,马血清等,其中以胎牛血清质量最好. 优质血清的标准:透明,淡黄色,无沉淀物, 优质血清的标准:透明,淡黄色,无沉淀物, 无细菌,支原体,病毒污染. 无细菌,支原体,病毒污染. 血清的灭活(消除补体活性): ):56 血清的灭活(消除补体活性):56 ℃ ,30 min 血清的消毒: 血清的消毒:过滤除菌
实验要求: 实验要求:
进实验室先洗手,签到.进细胞培养室要换鞋. 进实验室先洗手,签到.进细胞培养室要换鞋. 洗手 必须保持显微镜,试验桌,超净台以及其它用具 的清洁和整齐,各种药品,试剂按照规定的用量 进行使用.用完后要恢复摆放位置 进行使用.用完后要恢复摆放位置. 恢复摆放位置. 严格遵守显微镜使用的注意事项,否则损坏物镜, 同时也影响试验的进行. 离开实验室前,必须检查水龙头和电开关,避免 发生事故.
培养皿和培养板等表面消毒
超净台
超净工作台的工作原 理是利用鼓风机驱动 空气遁过高效滤器除 去空气中的尘埃粒, 使空气得到净化. 净化空气徐徐通过工 作台面,使工作台内 构成无菌环境.
生化培养箱
生化培养箱设定的条件为28 ℃ . 使用生化培养箱培养细胞时应注 意的问题: 1)保持培养箱内空气干净.定 期消毒 (90 ℃ ,14 h). 2)箱内灭菌蒸馏水3000ml蒸馏 水槽中以保持箱内湿度,避免培 养液蒸发.
昆虫细胞培养手册
昆虫细胞系的生长和维持细胞系简介：本手册包括Sf9、Sf21和H5昆虫细胞以及提供相关昆虫细胞生长和维持的一般信息。
Sf9、Sf21和H5细胞系适于用杆状病毒或其他昆虫表达系统表达重组蛋白。
运输与储存：运输：置于干冰上。
储存和传代：置于液氮储存。
收到细胞即可开始，详见14页。
细胞系比较：下面的表格总结了Invitrogen细胞系一般特征。
订购信息见下页。
细胞 倍增时间 细胞外观 初始培养基Sf9 72h 规则的带有颗粒球形。
贴壁紧。
TNM-FHSf21 24h 不同大小带有颗粒球形。
贴壁紧。
TNM-FHH5 18h 不同大小带有颗粒球形。
贴壁松。
Express Five SFM重要事项：Invitrogen（生命技术部分）通过RT-PCR证实H5细胞藏匿有内生的野田病毒。
在一定条件下，H5产生野田病毒粒子。
如此产生的病毒粒子未表现出对内原蛋白表达的不利的影响，或着在限制使用证书66号下已延伸和提供对H5细胞其它研究应用（见35页）。
更多信息请联系技术支持。
用途：仅供研究使用。
禁止用于动物或人的疾病治疗和诊断。
Sf9和Sf21细胞系：来源：Sf9（货号B825-01）和Sf21（货号B821-01）细胞系是传统的用于杆状病毒表达的细胞系，源于美国农业部昆虫病理实验室。
此细胞系适用于InsectSelect系统。
这两株细胞衍生于IPLBSF-21细胞系，来源于秋蝇蠕虫（草地夜蛾）蛹的卵巢组织。
特征：Sf9和Sf21有下列共同特征：易于形成单层和悬浮培养、适用无血清培养基。
大小不同：Sf9细胞系克隆分离于IPLBSF21-AE(Sf21)。
体积较小大小规则的使其易于形成单层和铺培养板。
Sf21在大小和形成单层以及铺板规则上有一些不同。
用途：两者都适于转染、纯化、生产高滴度病毒、铺板以及表达重组蛋白。
如果你是第一次使用杆状病毒，你会发现Sf9细胞易于从斑块中分离。
在一些结构上Sf21细胞可能比Sf9细胞表达蛋白量高。
SF9细胞的建立及生物学特性的鉴定
2020年第8期 吉林畜牧兽医97·经验交流·JingYan JiaoLiuSF9细胞的建立及生物学特性的鉴定李来旭1，刘鑫莹1、潘添博2，李 睿31.重庆永健生物制品有限公司，重庆市 400000；2.重庆市合川区合阳城街道办事处畜牧兽医站，重庆市 400000；3.东北农业大学，黑龙江哈尔滨 150000摘 要：自菌种保藏中心引进1株SF9细胞系，扩大培养，保存于液氮，建立SF9细胞基础细胞库。
对细胞进行形态、生长曲线、纯净性、染色体分析及致瘤性等特性进行研究。
结果表明，细胞呈圆球形；细胞呈S 型生长曲线；无细菌、支原体及外源病毒污染；细胞的染色体数目主要分布在170～190之间；无致瘤性。
关键词：SF9细胞系；基础细胞库；生物学特性杆状病毒表达系统(BEVS)被广泛用于疫苗开发及外源蛋白表达。
BEVS 因其操作简便、安全性及适用于大规模生产等优势, 具有极大的应用前景。
杆状病毒表达的受体为昆虫细胞，目前应用较广的细胞系为SF9细胞。
目前兽用疫苗领域针对猪圆环病毒、禽流感病毒、猪瘟病毒及鸡新城疫病毒等多疫苗在SF9 细胞中表达，极大程度上缓解了畜牧业的养殖风险和生产成本。
本研究自菌种保藏中心引进SF9细胞系，进行细胞生物学特性研究，为开展SF9细胞系及及传染性法氏囊VP2疫苗的研究与开发提供细胞资源和理论依据。
1 材料和方法1.1 材料1.1.1 细胞SF9细胞，购自美国菌种保藏中心ATCC。
1.1.2 试验试剂：SF9无血清培养基，胎牛血清，DMSO 购自美国gibco 公司；无菌培养基，重庆永健生物制品有限公司制备。
1.2 方法1.2.1 细胞传代：取对数生长期的SF9细胞，以900 r/min 离心5 min，弃去上清，用SF9无血清培养基稀释细胞密度为0.8×106个/mL 分装到三角培养瓶中。
培养转速为150 r/min，置27 ℃培养箱中培养。
1.2.2 基础细胞库的建立 取生长状况良的好SF9细胞进行离心，加入冻存液，吹打混匀细，调节细胞密度为1.2×107个/m L ，每只冻存管分装1 mL。
Sf9细胞的培养及转染解析
超净台
超净工作台的工作原 理是利用鼓风机驱动 空气遁过高效滤器除 去空气中的尘埃粒， 使空气得到净化。
净化空气徐徐通过工 作台面，使工作台内 构成无菌环境。
生化培养箱
• 生化培养箱设定的条件为28℃ 。 • 使用生化培养箱培养细胞时应注
意的问题：
• 1）保持培养箱内空气干净。定 期消毒（90 ℃ ，14 h)。
转染基本步骤
• 1、接种细胞并使其贴壁 • 2、制备重组Bacmid与Cellfectin Reagent
（ ）复合物 Invitrogen公司转染试剂 • 3、加入复合物 • 4、去掉复合物混合液，加入完全培养基，
培养细胞直到细胞出现病毒感染迹象 • 5、取上清液分离纯化得目的蛋白
• 4）送入培养箱中继续培养。
细胞培养－换液
• 对于像Sf9这样的半贴壁的培养物，可按如 下步骤操作：
• 吸去或倾出（部分或全部）旧培养液。 • 加入新鲜的培养液。加入的量与换液前的
量相同。 • 放回原来的培养箱中继续培养。
转染
• 转染(transfection)指真核细胞由于外源DNA 掺入而获得新的遗传标志的过程。
病毒重组，获得重组病毒（酶切酶连转化） 2、将重组的病毒纯化 3、感染昆虫细胞或虫体（转染） 4、外源基因随着病毒的复制而获得表达
*《人细小病毒B19- XA株VP1蛋 白在Bac- to-Bac系 统中的表达及其反应原性》 *《Bac-toBac® Baculovirus Expression System 实验流程》
• （2）5分钟内用培养液稀释至原体积的10 倍以上。
• （3）低速离心10分钟。 （4）去上清，加新鲜培养液培养刚复苏的 细胞。
Sf9细胞的培养工艺
第19卷第3期1998年8月化 工 冶 金Engineering Chem istry &M etallu rgy V o l 119N o 13A ug 11998收稿日期:1997206209,修回日期:1997210216王晓迟:女,25岁,硕士,生物化学工程专业・研究简报・Sf 9细胞的培养工艺王晓迟 戚艺华 欧阳藩中国科学院化工冶金研究所生化工程国家重点实验室 北京 100080)细胞进行环境pH 值由低到高的值为710的培养液中即不能其次进行了培养液血清浓度由高到低2◊时细胞仍可,104个 m l 数量级是其生长的临界接种密度.关键词 Sf 9细胞,培养工艺,pH 值,血清浓度,接种密度中图分类号 Q 281 前 言80年代以来,Sf 9昆虫细胞—杆状病毒系统被广泛用于各种重组蛋白的表达.该细胞有许多优点,如非贴壁依赖性、培养温度低、可在无血清体系中繁殖等,很适合高密度、大规模培养.与之相关的各种发酵设备也在不断被开发.对Sf 9细胞的研究既能为动物细胞大规模培养找到一个新的对象,又可使推广多种以该细胞为表达系统的基因工程产品成为可能.要利用这株细胞,首先要对其培养工艺有全面、深入的了解,然而目前Sf 9细胞培养工艺方面的研究成果大部分属于商业机密,文献报道很少.本文从静止培养入手,对几项关键性的工艺条件进行了研究.2 材料和方法211 细胞系Sf 9昆虫细胞,来自美国A TCC (160～220代).212 细胞培养液21211 pH 梯度实验培养液用二次蒸馏水溶解IPL 241昆虫细胞培养基干粉(G I BCO ,Inc .),加0135g LN aHCO 3,用215m o l LN aOH 调pH 至设定值,以0122Λm 滤膜过滤除菌,向滤后液中加入2◊胰蛋白肉汤(G I BCO ,Inc .),1◊制霉菌素,50单位 m l 庆大霉素以及10◊的热灭活小牛血清.21212 血清梯度实验培养液先将有血清培养液的pH 调至612,然后加入设定浓度的热灭活血清,除血清条件外其余同上;无血清培养液Sf 2900II SFM (G I BCO ,Inc .)中加入2◊胰蛋白肉汤.872化 工 冶 金19 卷21213 密度梯度实验培养液将pH调至612,加10◊血清,其余同21211.213 实验方法21311 pH梯度实验将在初始pH=612的培养液中生长到对数期的细胞传至pH=615的培养液中,适应生长1代;待细胞密度达到105个 m l以后稳定传代2次;然后依次传至初始pH=618和pH=710的培养液中驯化.观察细胞在每种条件下的生长规律.21312条件下生长到对数期的细胞传至含8◊血清的培养液中,适应生长1周,2次;然后依次传至含5◊和2◊血清的培养液中驯化观察细胞在每种条件下的生长规律.21313密度梯度实验分别以较高密度(5×105和1×105个 m l)、中等密度(5×104和1×104个 m l)及低密度(5×103和1×103个 m l)接种Sf9细胞进行培养,观察细胞在每种条件下的生长规律.3 结果与讨论311 pH梯度实验Sf9细胞在pH=615的环境中适应很快,1代以后就能良好生长,适应pH=618的环境比较困难,连续传代3次才得以稳定生长,在pH=710的环境中始终难以存活.Sf9细胞在不同pH环境中的生长状况如图1所示,以pH=612的培养液中的细胞为对照组.由图可知,Sf9细胞在初始pH=615的培养液中生长良好,与对照组相比差别不大,延迟期24h,最大细胞密度由接种时的104个 m l数量级增加到105个 m l数量级;培养液初始pH=618时,细胞的生长开始受到影响,生长速率缓慢,延迟期增加至48h,最大细胞密度远小于对照组;培养液初始pH值提高到710时,细胞已不能存活.Sf9细胞生长过程中,各组培养液pH值的变化情况见图2.Sf9细胞在初始pH值为612,615和618的3种培养液中生长时,培养液的pH值总体上均呈升高趋势,其pH增加值不超过0131在pH=710条件下细胞已不能正常生长,其培养液pH值的检测也随细胞的死亡而终止.Sf9细胞的最适pH值为612,略偏酸性,而中性条件更利于工业化生产和多种基因工程产品的稳定,因此进行了该细胞对高pH值环境的适应性实验.结果发现,培养液的pH值随着细胞的生长会略有增加,这可能是由于Sf9细胞在生长过程中产生乳酸的量较少,并且在乳酸积累时还会反过来利用它作为碳源;同时培养液中的许多酸性成份如精氨酸等在细胞生长旺盛时被大量消耗,所以引起了培养液pH值升高,但这种升高仍然是缓慢的和不显著的.初始pH=710时培养液pH值的上升可能是由于细胞死亡裂解,释放出胞内碱性成份的缘故.培养液初始pH值提高到615对细胞生长的影响不大,但继续升高至618时细胞的生长状况已明显不如对照组,在初始pH值为710的培养液中Sf9细胞已不能存活,说明此时的pH值已超出了该细胞的适应范围.因此,较大幅度地提高培养液的pH值在Sf9细胞的培养过程中极为困难.图1 Sf 9细胞在各种pH 值条件下的生长曲线F ig 11 Sf 9cell grow th at vari ouspH 图2 各组实验中培养液的pH 值变化曲线F ig 12 V ariati on of pH of culture w ith different initial pH 图3 Sf 9细胞在不同血清浓度的培养液中的生长曲线F ig 13 Sf 9cell grow th in culture w ith different concentra 2ti on of serum312 血清梯度实验Sf 9细胞对于含8◊血清的培养液适应很快,1代之后即可良好生长;适应5◊的血清需传代2次,共12d ;适应2◊的血清较慢,共需3代18d ;由2◊的血清到无血清培养液适应较快,需2代10d .Sf 9细胞在不同血清浓度下的生长状况如图3所示.Sf 9细胞在含8◊血清的培养液中生长良好,延迟期24h ,最大细胞密度由接种时的104个 m l 数量级增加到105个 m l 数量级,与常用浓度10◊条件下基本相同;细胞在含5◊血清的培养液中延迟期增加至48h ,生长速度减慢,但仍属于正常生长状态;当血清浓度降至2◊时细胞仍可生长,出现72h 的延迟期,最大细胞密度值较低;该细胞在无血清培养液中生长良好,各项指标均接近在10◊常用浓度下的情况.因此该细胞具有较强的低血清适应性.同时,Sf 9细胞在已经过优化的市售无血清培养液中生长良好,如需尽可能地消除血清对实验造成的影响,可以考虑采用无血清培养系统.313 密度梯度实验不同接种密度时Sf 9细胞的生长状况如图4～6所示.105个 m l 数量级接种时,Sf 9细胞的生长十分迅速,不出现延迟期而直接进入对数生长阶段,最大细胞密度增加至106个 m l 数量级;104个 m l 数量级接种时,细胞处于正常生长状态,有24h 的延迟期,倍增迅速,最大细胞密度值增加至105个 m l 数量级;103个 m l 数量级接种时,细胞有4d 的延迟期,生长过于缓慢,已失去实际操作意义.当以较高密度接种时,细胞的启动生长极为迅速,这可能是由于细胞密度较高时,与之相关的各种激素、生长因子、酶及其它细胞因子的浓度也较高,同时细胞间的频繁接触有利于多种因子的分泌,从而增强了细胞活力的缘故;当以低密度接种时,细胞生长过于缓慢,说明此接种量限制了细胞的正常生长,因此初始接种密度对Sf 9细胞的生长影响很大,直接关系其延迟期的长短和最大细胞密度值的大小.9723期王晓迟等:Sf 9细胞的培养工艺图4 Sf 9细胞在较高密度接种时的生长曲线F ig 14 Sf 9cell grow th in culturew ith h igh density of inoc 2ulati on 图5 Sf 9细胞在中等密度接种时的生长曲线F ig 15 Sf 9cell grow th in culture w ith m edium density of inoculati on 图6 Sf 9细胞在低密度接种时的生长曲线F ig 16 Sf 9cell grow th in culture w ith low density of inocu 2lati on 另一方面,由图6可知,103个 m l 数量级接种时,细胞生长已不正常,所以104个 m l 数量级是Sf 9细胞的临界接种密度,低于这一密度会出现超长延迟甚至不生长.4 结 论根据上面的实验结果可以得出以下结论:(1)Sf 9细胞对于环境pH 值的适应能力十分有限;在生长过程中,培养液的pH 值是逐渐升高的,但总的变化幅度不大.(2)Sf 9细胞对于低血清环境的适应性很强.(3)初始接种密度对Sf 9细胞的生长影响很大,该细胞的临界密度约为104个 m l 数量级.本文对Sf 9细胞静止培养的几项关键性工艺条件进行了初步研究,其结果可作为进一步放大培养的理论依据.参考文献 1Caro l J .M arcus -Sekura et al .Confo r m ati on -dependent recogniti on of Baculovirus -exp ressed Ep stein -barr V irus gp 350by a Panel of M onoclonal A ntibody .Journal of General V iro logy ,1993,74:2171 2Summ ers M .D .,Sm ith G .E .Baculovirus Structural Po lypep tides .A M anual of M ethods fo r Baculovirus V ecto rs andInsect Cell Culture P rocedures .T exas ,U SA ,T exas A gricultural Experi m ent Stati on and T exas A &M U niversity Co l 2lege Stati on ,1987.10 3王国政等.动物细胞大量培养.生物工程进展,1988,8(4):11 4卢锦汉等.医学生物制品学.北京:人民卫生出版社,1995.528 5W ong et al ,R elati onsh i p betw een O xygen U p take R ate and T i m e of Infecti on of Sf 9Insect Cells Infected w ith a R ecom 2binant Baculovirus.Cyto techno logy ,1994,15:157 6Bertheussen K .Grow th of Cells in a N ew D efined P ro tein -free M edium .Cyto techno logy ,1993,11:219082化 工 冶 金19 卷THE CUL TURE TECHNOLOG Y OF Sf 9CELL SW AN G X iaoch i Q I Y ihua OU YAN G Fan(Inst .Che m .M eta ll .,Ch inese A cad e m y of S ciences ,B eij ing 100080,Ch ina )ABSTRACT Sf 9cells are cultured staticly w ith different pH ,serum concentrati on and inoculati on densi 2ty .It is found that the cell culture is sensitive to pH change and cells hardly grow in the m edium w ith an ini 2tial pH of 7.0,pH of the culture m edium increases sligh tly during the culture and Sf 9cells can grow w ell in the m edium w ith serum concentrati on as low as 2◊.A critical inoculati on density of 104cells m l is foundnecessary fo r the grow th of Sf 9cells.KEY WOR D S Sf 9cells ,Culture techno logy ,pH ,Serum concentrati on ,Inoculating density 化工冶金研究所学位论文简介有机硫代磷酸2有机铵协萃体系萃取分离镉锌的研究 选择有机硫代磷酸作为萃取剂,合成与提纯了二2(22乙基己基)二硫代磷酸(D 2EHD T PA ,简称二硫代磷酸)和二2(22乙基己基)单硫代磷酸(D 2EHM T PA ,简称单硫代磷酸).在分别考察了其萃取效果后,进一步系统研究了这两种有机硫代磷酸与3种有机胺(伯胺N 1923、仲胺DOA 和叔胺TOA )协同萃取体系的性能与机理.总的来说,二硫代磷酸2有机胺协萃体系的萃取能力较优.对各体系,一般萃镉的能力大于萃锌的能力.硫酸盐溶液中,镉、锌分离的综合性能的优良顺序如下:D 2EHD T PA -TOA >D 2EHD T PA -DOA >D 2EHM T PA -TOA >D 2EHD T PA -N 1923,D 2EHM T PA -DOA ,D 2EHM T PA -N 1923用恒界面池法对D 2EHD T PA 2TOA 萃取镉体系进行了动力学研究,该萃取过程属于界面反应模式,表观活化能为4412kJ m o l ,反应历程为BHA i =BH +i +A -i(1)BH i +=B i +H i +(2)Cd i 2++A -i k 1k -1CdA +i (3)CdA +i +A -i k 1k -2CdA 2i (4)CdA 2(O )+BHA (O )=CdA 2 BHA (O )(5)其中式(3)与(4)为速率控制步骤,CdA +为反应活性中间产物,下标i 表示在界面上,下标(O )表示有机相,B 为有机胺,BH +为胺阳离子,A -为有机硫代磷酸根阴离子.最后,用实际的含镉、铜和锌的浸出液进行新协萃体系检验,取得了较好的分离效果,从而提出了萃取分离无渣新工艺建议流程.(摘自化工冶金研究所1997年张大力的博士学位论文,导师:柯家骏,卢立柱)1823期王晓迟等:Sf 9细胞的培养工艺。
Sf9细胞的培养及转染
Bacmid
? 能快速、高效产生的重组AcMNPV 病毒。 取杆状病毒( baculovirus) 和质粒( plasmid) 的英文字头字尾命名为Bacmid，即杆状病 毒质粒之意。该载体可像质粒一样在大肠 杆菌中生长，又对鳞翅目昆虫细胞具有感 染性。
昆虫杆状病毒表达系统的构成
表达过程： 1、将外源目的基因插入到启动子下游与杆状
Sf-9细胞的培养及转染
Sf-9细胞
? Sf-9细胞是由G.E. Smith 和 C.L. Cherry 在1983年从细胞株IPLB-SF 21 AE得来的一 个克隆。IPLB-SF 21 AE是1977年由Vaughn 等从草地夜蛾蛹的卵巢组织得到的。
? Sf-9是半贴壁的细胞，贴壁性不强，可贴 壁培养也可悬浮培养。
? （2）5分钟内用培养液稀释至原体积的10 倍以上。
? （3）低速离心10分钟。 （4）去上清，加新鲜培养液培养刚复苏的 细胞。
Sf9细胞的传代
? 判断分离（散）细胞培养物是否需要传代 的主要指标就是观察培养物是否已基本长 满培养瓶皿的底壁。
? 一般来说，原代培养物未达到生长基质的 80%表面面积，不要急于传代，对于拟行 首次传代的培养物更如此。
? 2）箱内灭菌蒸馏水3000ml蒸馏 水槽中以保持箱内湿度，避免培 养液蒸发。
培养瓶
拿培养瓶的正确姿势：拇指和食指夹住培养瓶， 瓶口向外，中指托住瓶底。保持瓶子的水平， 防止培养液倒向瓶口。
血球计数板
细胞冻存和复苏
? 冻存和复苏的原则：慢冻快融
– 当细胞冷到零度以下，可以产生以下变化：细 胞器脱水，细胞中可溶性物质浓度升高，并在 细胞内形成冰晶。
? 4）送入培养箱中继续培养。
细胞培养－换液
Sf9昆虫细胞系的致瘤性研究
胡㊀波ꎬ王㊀芳ꎬ范志宇ꎬ等.Ｓｆ９昆虫细胞系的致瘤性研究[Ｊ].江苏农业科学ꎬ２０１９ꎬ４７(１８):２０９－２１１.ｄｏｉ:１０.１５８８９/ｊ.ｉｓｓｎ.１００２－１３０２.２０１９.１８.０４５Ｓｆ９昆虫细胞系的致瘤性研究胡㊀波１ꎬ２ꎬ王㊀芳２ꎬ范志宇１ꎬ２ꎬ宋艳华２ꎬ魏后军２ꎬ薛家宾２ꎬ姜㊀平１(１.南京农业大学动物医学院ꎬ江苏南京２１００９５ꎻ２.江苏省农业科学院兽医研究所/农业农村部动物疫病诊断与免疫重点开放实验室ꎬ江苏南京２１００１４)㊀㊀摘要:为确定Ｓｆ９昆虫细胞系作为疫苗生产细胞株的安全性ꎬ检测了Ｓｆ９细胞对裸鼠的致瘤性ꎮ将３周龄ＳＰＦ级雌性裸鼠随机分为５组ꎬ分别为Ｓｆ９基础细胞库细胞组㊁Ｓｆ９最高限制代次细胞组㊁阳性对照Ｈｅｐ－２细胞组㊁阴性对照ＣＥＦ细胞组和空白对照组ꎬ以各自细胞悬液皮下接种裸鼠ꎮ在接种后２１ｄ和８４ｄ观察接种部位肿瘤形成情况ꎬ并进行病理组织学检查ꎮ结果显示ꎬ接种后２１ｄꎬＨｅｐ－２细胞组裸鼠注射部位形成米粒大小结节ꎬ经病理组织学检查为鳞状细胞癌ꎬ而ＣＥＦ细胞组和Ｓｆ９细胞组注射部位均无结节ꎮ接种后８４ｄꎬ经病理组织学检查ꎬＣＥＦ细胞组和Ｓｆ９细胞组均无肿瘤形成ꎮ本研究表明基础代次和最高限制代次Ｓｆ９细胞均不具有致瘤性ꎬＳｆ９细胞可用于疫苗生产ꎮ㊀㊀关键词:Ｓｆ９细胞ꎻ致瘤性ꎻ裸鼠ꎻ疫苗ꎻ安全性㊀㊀中图分类号:Ｓ８５２.４㊀㊀文献标志码:Ａ㊀㊀文章编号:１００２－１３０２(２０１９)１８－０２０９－０３收稿日期:２０１８－０６－１５基金项目:现代农业产业技术体系建设专项资金(编号:ＣＡＲＳ－４３－Ｃ－１)ꎮ作者简介:胡㊀波(１９８２ )ꎬ男ꎬ江苏南京人ꎬ博士ꎬ副研究员ꎬ主要从事畜禽疫病防控与兽医生物技术研究ꎮＴｅｌ:(０２５)８４３９０３３７ꎻＥ－ｍａｉｌ:ｈｕｂｏｌｓｈｇ＠１６３.ｃｏｍꎮ通信作者:姜㊀平ꎬ博士ꎬ教授ꎬ主要从事动物传染病学研究ꎮＴｅｌ:(０２５)８４３９６６４０ꎻＥ－ｍａｉｌ:ｊｉａｎｇｐ＠ｎｊａｕ.ｅｄｕ.ｃｎꎮ㊀㊀昆虫细胞－杆状病毒表达系统(ＢＥＶＳ)属于真核细胞表达系统ꎬ广泛用于制备重组蛋白和病毒样颗粒以进行基础生命科学和生物医药领域研究ꎬ据报道已成功用于数百种外源蛋白的表达[１]ꎮ目前ꎬ该系统研究较多的是苜蓿银纹夜蛾核多角体病毒(ＡｃＮＰＶ)ꎬ其宿主是草地贪夜蛾卵巢细胞(Ｓｆ９细胞)ꎮ利用ＢＥＶＳ系统可实现在Ｓｆ９细胞中高水平表达外源蛋白ꎬ所表达的外源蛋白几乎均为可溶性蛋白ꎬ其生物学活性接近天然来源的分离物ꎬ因此可利用ＢＥＶＳ生产各种动物疾病的免疫疫苗或治疗药物ꎮ目前ꎬ国内动物疫苗研究中ꎬ已有猪流行性腹泻病毒[２]㊁伪狂犬病病毒[３]㊁猪圆环病毒[４－５]㊁禽流感病毒[６]㊁新城疫病毒[７－８]㊁兔出血症病毒[９]等数十种动物病毒的抗原蛋白在Ｓｆ９细胞中表达ꎮ据我国兽用生物制品相关规定ꎬ作为动物疫苗生产的Ｓｆ９细胞株ꎬ需对该细胞进行致瘤性检验以确保疫苗的安全性[１０]ꎮ本研究取不同代次的Ｓｆ９昆虫细胞ꎬ采用裸鼠体内接种法检测其致瘤性ꎬ为Ｓｆ９昆虫细胞作为疫苗生产细胞株的安全性提供试验依据ꎮ１㊀材料与方法１.１㊀细胞与培养基Ｓｆ９昆虫细胞来源于美国典型培养物保藏中心(ＡＴＣＣ)ꎬ由笔者所在实验室传代并保存ꎻＨｅｐ－２细胞购自中国科学院细胞库ꎻＣＥＦ原代细胞由笔者所在实验室分离培养ꎻＳｆ－９００ＴＭⅡＳＦＭ培养基和ＤＭＥＭ培养基ꎬ购自Ｇｉｂｃｏ公司ꎮ１.２㊀实验动物３周龄ＳＰＦ雌性裸鼠购自南京大学模式动物研究所ꎬ饲养于实验动物中心屏障系统隔离器中严格无菌饲养ꎮ１.３㊀细胞传代及细胞库的建立将笔者所在实验室保存的Ｓｆ９细胞作为原始种子１代ꎬ按细胞传代方法以 １传３ꎬ２ｄ传１代 方式ꎬ于２７~２８ħ培养箱中连续传代培养至６０代ꎬ建立Ｓｆ９细胞原始细胞库(第５代)㊁基础细胞库(第１０代)㊁工作细胞库(第１５代)ꎬ并规定最高限制代次细胞为６０代ꎮ１.４㊀细胞接种将３周龄ＳＰＦ级雌性裸鼠５０只随机分为５组ꎬ分别设为Ｓｆ９基础细胞库细胞组㊁Ｓｆ９最高限制代次细胞组㊁阳性对照Ｈｅｐ－２细胞组㊁阴性对照ＣＥＦ细胞组和不作任何处理的空白对照组ꎬ每组１０只ꎮ基础细胞库细胞组裸鼠每只皮下注射１ˑ１０７个/０.２ｍＬ第１０代Ｓｆ９细胞悬液ꎬ最高限制代次细胞组裸鼠每只皮下注射１ˑ１０７个/０.２ｍＬ第６０代Ｓｆ９细胞悬液ꎬ阳性对照组裸鼠每只皮下注射１ˑ１０６个/０.２ｍＬＨｅｐ－２细胞悬液ꎬ阴性对照组裸鼠每只皮下注射１ˑ１０６个/０.２ｍＬＣＥＦ细胞悬液ꎮ１.５㊀肿瘤观察及判定各细胞试验组连续观察１４ｄꎬ检查接种部位皮下是否有肿瘤形成ꎮ如有结节或可疑病灶ꎬ继续观察７ｄꎬ取病变部位组织ꎬ采用１０％甲醛固定ꎬ常规石蜡包埋切片ꎬＨＥ染色ꎬ普通光学显微镜下进行病理组织学检查ꎮ未发现结节裸鼠ꎬ分别于注射后２１ｄ和８４ｄꎬ各取一半裸鼠脱颈椎处死ꎬ对接种部位进行解剖检查ꎬ观察各淋巴结和各器官中有无结节形成ꎬ如果可疑进行病理组织学检查ꎮ２㊀结果与分析２.１㊀Ｓｆ９细胞显微镜观察对第５㊁１０㊁１５㊁６０代Ｓｆ９细胞进行显微镜观察拍照ꎬ由图１可知ꎬ各代次细胞的形态较为一致ꎬ呈圆形㊁晶莹透亮㊁大小９０２ 江苏农业科学㊀２０１９年第４７卷第１８期均一ꎬ直径约为１５μｍꎮ２.２㊀裸鼠外部及解剖观察各代次细胞接种裸鼠后ꎬ在试验观察期内各组动物均健康存活ꎮ在接种后１４ｄꎬ阳性对照Ｈｅｐ－２细胞组裸鼠经外部观察ꎬ发现注射部位有粟米大小的结节(肿块)形成ꎬ至２１ｄ结节变大(图２－Ａ)ꎬ经解剖发现注射部位有米粒大结节(图２－Ｆ)ꎬ各淋巴结㊁器官均正常ꎬ未见结节形成ꎻ而阴性对照(ＣＥＦ细胞组㊁Ｓｆ９基础细胞库细胞组和Ｓｆ９最高限制代次细胞组)注射部位未见有结节形成ꎻ在接种后８４ｄꎬ与空白对照组(图２－Ｅ㊁图２－Ｊ)和阴性对照ＣＥＦ细胞组(图２－Ｂ㊁图２－Ｇ)相比ꎬＳｆ９基础细胞库细胞组(图２－Ｃ㊁图２－Ｈ)和Ｓｆ９最高限制代次细胞组裸鼠(图２－Ｄ㊁图２－Ｉ)经外部观察ꎬ注射部位未见有结节形成ꎬ解剖后ꎬ注射部位未见有结节ꎬ各淋巴结㊁各内脏器官正常ꎬ未见有结节形成ꎮ２.３㊀病理组织学检查阳性对照Ｈｅｐ－２细胞组裸鼠ꎬ在接种细胞２１ｄ后进行解剖ꎬ发现注射部位有米粒大结节ꎮ取注射部位病变组织ꎬ采用１０％甲醛固定ꎬ常规石蜡包埋切片ꎬＨＥ染色ꎬ普通光学显微镜下做病理组织学检查ꎮ结果显示ꎬ病变部位组织内为鳞状细胞癌(图３－Ａ)ꎬ阳性对照组接种肿瘤形成率为１００％ꎻ在接种后８４ｄꎬ与空白对照组和阴性对照ＣＥＦ细胞组相比ꎬＳｆ９基础细胞库细胞组和Ｓｆ９最高限制代次细胞组经解剖后ꎬ注射部位未见有结节ꎬ各淋巴结㊁各内脏器官均正常ꎬ未见有结节形成ꎬ随机选取Ｓｆ９基础细胞库细胞组和Ｓｆ９最高限制代次细胞组裸鼠肝脏㊁脾脏做病理组织学检查ꎬ未发现有瘤细胞(图３－Ｂ㊁图３－Ｃ和图３－Ｄ㊁图３－Ｅ)ꎮ３ 讨论与结论鉴于昆虫细胞－杆状病毒表达系统(ＢＥＶＳ)可获得大量免疫原性好㊁与天然蛋白功能相似的可溶性重组蛋白ꎬ已被用于蛋白质表达㊁疫苗生产和病毒制备等各方面[１１]ꎮ重组杆状病毒感染Ｓｆ９昆虫细胞后可对外源蛋白进行许多真核细胞的转录后加工作用ꎬ包括蛋白质折叠及糖基化㊁磷酸化㊁酰基化等ꎮ同时ꎬ相比于哺乳动物细胞ꎬＳｆ９细胞为半贴壁细胞ꎬ可在０１２ 江苏农业科学㊀２０１９年第４７卷第１８期不需要对细胞进行驯化和改造的情况下直接在培养基中进行悬浮培养ꎬ这为大规模高密度培养昆虫细胞创造了必要条件ꎬ因而其作为外源蛋白的表达细胞具有较明显优势ꎮＢＥＶＳ作为疫苗生产用表达系统已进行了广泛研究并取得了大量成果ꎮ人用疫苗研究方面ꎬＧＳＫ公司应用ＢＥＶＳ系统研制的ＨＰＶ１６/１８双价疫苗ꎬ已于２００７年获得批准上市[１２－１３]ꎬ另有多项采用该表达系统的人类亚单位疫苗进入Ⅱ期和Ⅲ期临床研究阶段ꎬ如流感疫苗[１４－１５]㊁戊肝疫苗[１６]㊁糖尿病疫苗[１７]等ꎮ动物疫苗研究方面ꎬＳｆ９昆虫细胞已用于猪圆环病毒２型(ＰＣＶ２)基因工程亚单位疫苗的商品化制备[１８]ꎬ取得了良好的经济效益ꎮＳｆ９细胞作为ＢＥＶＳ系统常用的细胞株ꎬ必将在亚单位疫苗研发及产品制备中发挥重要作用ꎬ其安全性评价具有重要意义ꎮ本研究根据兽用生物制品生产用细胞系试验研究指导原则和中国兽药典的要求ꎬ将不同代次Ｓｆ９细胞接种于裸鼠皮下ꎬ结果显示细胞接种后直至８４ｄ均无结节形成ꎬ病理组织学检测无异常ꎬ表明Ｓｆ９细胞对裸鼠不具有致瘤性ꎬ安全性良好ꎬ可用于疫苗生产ꎮ参考文献:[１]ＭｉｌｌｅｒＬＫ.Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓｅｓ:ｈｉｇｈ－ｌｅｖｅｌｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｉｎｉｎｓｅｃｔｃｅｌｌｓ[Ｊ].ＣｕｒｒｅｎｔＯｐｉｎｉｏｎｉｎＧｅｎｅｔｉｃｓ＆Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔꎬ１９９３ꎬ３(１):９７－１０１. [２]杨德强ꎬ李慧春ꎬ陈鹏飞ꎬ等.猪流行性腹泻病毒Ｓ１基因在昆虫细胞中的表达与鉴定[Ｊ].中国动物传染病学报ꎬ２０１７ꎬ２５(３):１８－２２.㊀[３]周金龙ꎬ王同燕ꎬ颜世君ꎬ等.伪狂犬病病毒ｇＥ基因在昆虫细胞中的表达[Ｊ].中国兽医科学ꎬ２０１６ꎬ４６(２):１８０－１８４. [４]黄㊀娟ꎬ袁㊀飞ꎬ韩先杰ꎬ等.猪圆环病毒２ｄ亚型衣壳蛋白在昆虫细胞中的表达[Ｊ].农业生物技术学报ꎬ２０１６ꎬ２４(９):１３４６－１３５３.㊀[５]张永武ꎬ连㊀海ꎬ张锦霞ꎬ等.表达猪圆环病毒２型Ｃａｐ蛋白的重组杆状病毒的构建及鉴定[Ｊ].动物医学进展ꎬ２０１６ꎬ３７(３):１４－１８.㊀[６]王㊀盛ꎬ谢芝勋ꎬ罗思思ꎬ等.Ｈ５Ｎ１亚型禽流感病毒ＨＡ基因在ｓｆ９细胞中的表达[Ｊ].中国兽医科学ꎬ２０１７ꎬ４７(１０):１２８１－１２８６.㊀[７]王安平ꎬ朱善元ꎬ王永娟ꎬ等.鸭源新城疫病毒ＮＰ基因在昆虫细胞中的表达及抗原性检测[Ｊ].江苏农业学报ꎬ２０１５ꎬ３１(６):１３８４－１３８８.㊀[８]张㊀磊.ＮＤＶ７７９３－ＨＮ蛋白在ＳＦ９细胞中的表达[Ｄ].南宁:广西医科大学ꎬ２０１７.[９]王㊀芳ꎬ胡㊀波ꎬ任雪枫ꎬ等.兔出血症病毒衣壳蛋白在昆虫细胞中的表达及对家兔的免疫保护效果[Ｊ].畜牧兽医学报ꎬ２００８ꎬ３９(１０):１３８２－１３８７.[１０]兽用生物制品生产用细胞系试验研究指导原则[Ｍ].中华人民共和国农业部公告第６８３号:３１.[１１]万㊀婧ꎬ相兴伟ꎬ江玲丽ꎬ等.杆状病毒－昆虫细胞表达系统在复合体重组表达应用中的研究进展[Ｊ].生物技术通报ꎬ２０１４(２):７－１４.[１２]ｌａＴｏｒｒｅＧꎬｄｅＷａｕｒｅＣꎬＣｈｉａｒａｄｉａＧꎬｅｔａｌ.ＴｈｅｈｅａｌｔｈｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙａｓｓｅｓｓｍｅｎｔｏｆｂｉｖａｌｅｎｔＨＰＶｖａｃｃｉｎｅｃｅｒｖａｒｉｘｉｎＩｔａｌｙ[Ｊ].Ｖａｃｃｉｎｅꎬ２０１０ꎬ２８(１９):３３７９－３３８４.[１３]孙㊀博.应用昆虫细胞表达预防性人乳头瘤病毒疫苗和应用填充床生物反应器表达Ｈ１Ｎ１流感病毒疫苗的研究[Ｄ].长春:吉林大学ꎬ２０１２.[１４]ＣｏｘＭＭꎬＰａｔｒｉａｒｃａＰＡꎬＴｒｅａｎｏｒＪＦ.Ａｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｈｅｍａｇｇｌｕｔｉｎｉｎｉｎｆｌｕｅｎｚａｖａｃｃｉｎｅ[Ｊ].ＩｎｆｌｕｅｎｚａａｎｄＯｔｈｅｒＲｅｓｐｉｒａｔｏｒｙＶｉｒｕｓｅｓꎬ２００８ꎬ２(６):２１１－２１９.[１５]ＰｕｓｈｋｏＰꎬＫｏｒｔＴꎬＮａｔｈａｎＭꎬｅｔａｌ.ＲｅｃｏｍｂｉｎａｎｔＨ１Ｎ１ｖｉｒｕｓ－ｌｉｋｅｐａｒｔｉｃｌｅｖａｃｃｉｎｅｅｌｉｃｉｔｓｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅｉｍｍｕｎｉｔｙｉｎｆｅｒｒｅｔｓａｇａｉｎｓｔｔｈｅ２００９ｐａｎｄｅｍｉｃＨ１Ｎ１ｉｎｆｌｕｅｎｚａｖｉｒｕｓ[Ｊ].Ｖａｃｃｉｎｅꎬ２０１０ꎬ２８(３０):４７７１－４７７６.㊀[１６]ＳｈｒｅｓｔｈａＭＰꎬＳｃｏｔｔＲＭꎬＪｏｓｈｉＤＭꎬｅｔａｌ.ＳａｆｅｔｙａｎｄｅｆｆｉｃａｃｙｏｆａｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｈｅｐａｔｉｔｉｓＥｖａｃｃｉｎｅ[Ｊ].ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄＪｏｕｒｎａｌｏｆＭｅｄｉｃｉｎｅꎬ２００７ꎬ３５６(９):８９５－９０３.[１７]ＰｅａｋｍａｎＭꎬＴｒｅｅＴＩꎬＥｎｄｌＪꎬｅｔａｌ.ＣｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎｏｆｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎｓｏｆＧＡＤ６５ꎬｐｒｏｉｎｓｕｌｉｎꎬａｎｄｔｈｅｉｓｌｅｔｔｙｒｏｓｉｎｅｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅＩＡ－２ｆｏｒｕｓｅｉｎｄｅｔｅｃｔｉｏｎｏｆａｕｔｏｒｅａｃｔｉｖｅＴ－ｃｅｌｌｓｉｎｔｙｐｅ１ｄｉａｂｅｔｅｓ:ｒｅｐｏｒｔｏｆｐｈａｓｅⅡｏｆｔｈｅＳｅｃｏｎｄＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌＩｍｍｕｎｏｌｏｇｙｏｆＤｉａｂｅｔｅｓＳｏｃｉｅｔｙＷｏｒｋｓｈｏｐｆｏｒＳｔａｎｄａｒｄｉｚａｔｉｏｎｏｆＴ－ｃｅｌｌａｓｓａｙｓｉｎｔｙｐｅ１ｄｉａｂｅｔｅｓ[Ｊ].Ｄｉａｂｅｔｅｓꎬ２００１ꎬ５０(８):１７４９－１７５４.[１８]ＦｅｌｂｅｒｂａｕｍＲＳ.Ｔｈｅｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｖｅｃｔｏｒｓｙｓｔｅｍ:Ａｃｏｍｍｅｒｃｉａｌｍａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇｐｌａｔｆｏｒｍｆｏｒｖｉｒａｌｖａｃｃｉｎｅｓａｎｄｇｅｎｅｔｈｅｒａｐｙｖｅｃｔｏｒｓ[Ｊ].ＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙＪｏｕｒｎａｌꎬ２０１５ꎬ１０(５):Ｕ８５－７０２.１１２江苏农业科学㊀２０１９年第４７卷第１８期。
sf9
Spodoptera frugiperda（草地夜蛾）卵巢细胞形态：上皮细胞生长特性：贴壁注释：Sf-9细胞是由G.E. Smith 和C.L. Cherry 在1983年从细胞株IPLB-SF 21 AE得来的一个克隆。
IPLB-SF 21 AE是1977年由Vaughn等从草地夜蛾蛹的卵巢组织得到的。
培养液：TNM-FH培养液：照厂家的说明配好Grace's Antheraea 培养液，每升培养液加3.3g 酵母粉和3.3g乳白蛋白水解物，用1M KOH调pH到6.2-6.4过滤除菌，4℃保存。
完整培养液在使用前加入10%热灭活的胎牛血清。
传代：用吸液管吹洗细胞使其悬浮，或用手从侧面拍打细胞培养瓶(当用大细胞培养瓶时)重悬细胞。
杆状病毒表达系统(baculovirus expression system)是近年来应用较多的真核表达系统，它可以在昆虫细胞中表达多种外源基因，包括真菌，植物，细菌，病毒的基因。
杆状病毒是一类以昆虫细胞为天然宿主的双链DNA病毒，具有高度的种属特异性，不感染脊椎动物，对人、畜无害。
目前研究较多的是苜蓿银纹夜蛾核多角体病毒(AcNPV) ，其宿主是草地贪夜蛾。
而sf9细胞，正是杆状病毒表达系统的宿主细胞之一。
sf9细胞属于半贴壁型细胞系，可以进行悬浮培养，也可以进行贴壁培养，在应用于蛋白的表达与制备纯化中，有着许多的优点。
杆状病毒表达系统的主要优越性有：①表达的重组蛋白能正确折叠，并形成二硫键；②翻译后可进行修饰加工如糖基化、磷酸化、酰胺化及信号肽切割等，使重组蛋白在结构和功能上更接近天然蛋白；③与其他真核表达系统相比，杆状病毒表达系统可以高效表达外源基因，表达量最高可达被感染昆虫细胞总蛋白量的5 0 ％；④可以容纳大片段外源基因。
SF21,sf9昆虫细胞
sf9昆虫细胞货号基因名称规格货期huayueyang-531sf9昆虫细胞1ml 现货细胞描述：Sf9昆虫细胞，可以用来包装扩增杆状病毒并表达蛋白。
Sf9昆虫细胞增殖能力取决于培养技术、培养条件等综合因素。
请按照正确的培养方法来复苏、传代，以此保证细胞具备良好的增殖能力，方便您的后继研究顺利进行。
质量控制：本细胞经过严格的质量检测，不含有细菌、真菌、病毒（HIV、HBV、HCV）和支原体等。
培养条件：27℃，PH值7.2~7.4，120–140rpm，无菌恒温培养。
用途：本产品仅供科研使用，不可用于治疗等其他用途。
细胞相关操作：sf9细胞复苏1.37°C水浴预热培养基；2.从液氮中取出细胞放入37°C水浴快速解冻（解冻后不要继续暖细胞）；3.在超净台中加入5ml的培养基重悬细胞，1000rpm离心5min；4.4.弃上清，加入5ml培养基重悬细胞，用血小球计数板进行细胞计数，按细胞密度3-5×105/ml接种到25ml无菌摇瓶中（带空气过滤通气孔的摇瓶）；5.摇瓶置于27°C培养箱中的摇瓶架上，120–140rpm培养。
sf9细胞传代1.取细胞计数(详见sf9细胞冻存)，当细胞密度达到1–3×106/ml时，可传代；2.37°C水浴预热培养基；3.在超净台中，加适量预热好的培养基到无菌摇瓶中，以细胞终密度为3-5×105/ml接种细胞（也可1000rpm，5min离心后弃上清，用预热好的培养基重悬并调整细胞密度为3-5×105/ml）；4.摇瓶置于27°C培养箱中的摇瓶架上，120–140rpm培养。
注：昆虫细胞对氧的要求较高，因此，悬浮培养必须具有高表面积体积比，否则细胞的生长会受到抑制。
培养基的体积不能超过摇瓶的五分之二；即100毫升的摇瓶不能超过40ml培养基，250ml摇瓶不能超过100ml培养基。
Sf9昆虫细胞悬浮培养工艺研究
Sf9昆虫细胞悬浮培养工艺研究李伟;秦红刚;张萍;漆世华;朱薇;王威;谢红玲;温文生;吴玉石【摘要】对Sf9昆虫细胞在不同培养基、培养基中是否添加血清及不同生物反应器中的培养工艺进行了研究,发现Sf9细胞在Sf900Ⅱ无血清培养基中生长比在添加10％小牛血清的Grace培养基中更好,在Sf900Ⅱ无血清培养基14 L搅拌式生物反应器分批培养细胞密度可达1.4×107/mL.过程生化特性分析表明,总氨基酸的消耗及主要代谢副产物特别是乳酸及游离氨的积累是培养后期细胞密度降低及活性下降的重要原因.本研究为Sf9细胞生物反应器培养工艺优化及利用昆虫杆状病毒蛋白表达系统高效表达重组蛋白生产亚单位疫苗奠定了良好基础.【期刊名称】《中国兽药杂志》【年(卷),期】2012(046)008【总页数】4页(P39-42)【关键词】Sf9细胞;生物反应器;生化分析【作者】李伟;秦红刚;张萍;漆世华;朱薇;王威;谢红玲;温文生;吴玉石【作者单位】武汉中博生物股份有限公司,武汉430070;武汉中博生物股份有限公司,武汉430070;武汉中博生物股份有限公司,武汉430070;武汉中博生物股份有限公司,武汉430070;武汉中博生物股份有限公司,武汉430070;武汉中博生物股份有限公司,武汉430070;武汉中博生物股份有限公司,武汉430070;武汉中博生物股份有限公司,武汉430070;武汉中博生物股份有限公司,武汉430070【正文语种】中文【中图分类】Q962昆虫细胞杆状病毒表达系统是20世纪80年代发展起来的新型表达载体系统，据报道现已成功应用于500多种外源蛋白的表达［1］。
相比贴壁依附型的哺乳动物细胞，昆虫细胞可直接进行悬浮培养而更具有优越性。
不同昆虫细胞系在不同培养基中的生长动力学及代谢参数已有文献报道［2］。
理论及实验表明，利用重组杆状病毒感染高密度的Sf9细胞可获得高水平的外源蛋白的表达［3］。
应用激流式生物反应器大规模悬浮培养昆虫细胞(sf9)的工艺研究
应用激流式生物反应器大规模悬浮培养昆虫细胞(sf9)的工艺研究赵立民;蒋天华;罗乃杰【摘要】应用激流式生物反应器对大规模悬浮培养sf 9细胞的工艺进行了研究,通过摸索细胞接种密度、溶解氧(DO)、反应器转速3项工艺参数,成功实现了sf 9细胞的大规模悬浮培养,细胞密度最高可达到0.8~1.5×106/ml,生长状态良好【期刊名称】《山东畜牧兽医》【年(卷),期】2012(000)008【总页数】2页(P12-13)【关键词】激流式生物反应器;sf9细胞;接种密度;DO;转速【作者】赵立民;蒋天华;罗乃杰【作者单位】广东温氏食品集团有限公司研究院广东新兴 527400;广东温氏食品集团有限公司研究院广东新兴 527400;广东温氏食品集团有限公司研究院广东新兴 527400【正文语种】中文【中图分类】Q962sf 9细胞由G.E. Smith和C.L. Cherry在1983年从细胞株IPLB-SF 21 AE得来的一个克隆，是目前国际上常用的细胞株之一，可作为猪圆环病毒(PCV)等多种病毒的宿主细胞，用于生产兽用疫苗，也可用于昆虫细胞/杆状病毒表达系统，制备各种农业杀虫剂等，用途广泛[1]。
相比哺乳动物细胞，昆虫细胞对生长环境要求苛刻，所需培养液营养丰富，添加的血清须是高质量的胎牛血清[2]。
细胞本身娇弱，对剪切力敏感，较难以反应器发酵的方式进行大规模培养。
激流式生物反应器是目前国内新兴的一次性生物反应器，具有剪切力小、控制精准、操作简单、规模易放大等特点。
本文采用该反应器，通过对相关工艺参数的摸索，进行了sf 9细胞大规模悬浮培养工艺的实验研究。
1.1.1 细胞系 sf 9昆虫细胞，购自武汉生物所，100～150代。
1.1.2 细胞培养液 Grace干粉培养基(Gibco)，每升添加0.35gNaHCO3、1.3g水解乳蛋白、3g酵母提取物，用Millipore超纯水溶解，稀HCl调节pH至6.2后，0.22mm滤芯除菌过滤；使用时添加10%热灭活胎牛血清(Hyclone)。
昆虫细胞培养手册
昆虫细胞系的生长和维持细胞系简介：本手册包括Sf9、Sf21和H5昆虫细胞以及提供相关昆虫细胞生长和维持的一般信息。
Sf9、Sf21和H5细胞系适于用杆状病毒或其他昆虫表达系统表达重组蛋白。
运输与储存：运输：置于干冰上。
储存和传代：置于液氮储存。
收到细胞即可开始，详见14页。
细胞系比较：下面的表格总结了Invitrogen细胞系一般特征。
订购信息见下页。
细胞 倍增时间 细胞外观 初始培养基Sf9 72h 规则的带有颗粒球形。
贴壁紧。
TNM-FHSf21 24h 不同大小带有颗粒球形。
贴壁紧。
TNM-FHH5 18h 不同大小带有颗粒球形。
贴壁松。
Express Five SFM重要事项：Invitrogen（生命技术部分）通过RT-PCR证实H5细胞藏匿有内生的野田病毒。
在一定条件下，H5产生野田病毒粒子。
如此产生的病毒粒子未表现出对内原蛋白表达的不利的影响，或着在限制使用证书66号下已延伸和提供对H5细胞其它研究应用（见35页）。
更多信息请联系技术支持。
用途：仅供研究使用。
禁止用于动物或人的疾病治疗和诊断。
Sf9和Sf21细胞系：来源：Sf9（货号B825-01）和Sf21（货号B821-01）细胞系是传统的用于杆状病毒表达的细胞系，源于美国农业部昆虫病理实验室。
此细胞系适用于InsectSelect系统。
这两株细胞衍生于IPLBSF-21细胞系，来源于秋蝇蠕虫（草地夜蛾）蛹的卵巢组织。
特征：Sf9和Sf21有下列共同特征：易于形成单层和悬浮培养、适用无血清培养基。
大小不同：Sf9细胞系克隆分离于IPLBSF21-AE(Sf21)。
体积较小大小规则的使其易于形成单层和铺培养板。
Sf21在大小和形成单层以及铺板规则上有一些不同。
用途：两者都适于转染、纯化、生产高滴度病毒、铺板以及表达重组蛋白。
如果你是第一次使用杆状病毒，你会发现Sf9细胞易于从斑块中分离。
在一些结构上Sf21细胞可能比Sf9细胞表达蛋白量高。
昆虫sf9细胞培养
Sf9培养要点：温度：27-28摄氏度pH：，sf9最适的pH6.2，随培养时间的延长，Ph值会增加传代时间：72h（三天左右）细胞来源：Sf9（货号B825-01）和Sf21（货号B821-01）细胞系是传统的用于杆状病毒表达的细胞系，源于美国农业部昆虫病理实验室。
此细胞系适用于InsectSelect系统。
这两株细胞衍生于IPLBSF-21细胞系，来源于秋蝇蠕虫（草地夜蛾）蛹的卵巢组织。
（以上来自invitrogen）细胞特点：规则的带有颗粒球形。
贴壁紧。
标准条件的定义：培养最低密度：0.6/ml（健康对数生长期细胞活率至少应不低于90％。
活率低于90％细胞不是在最佳条件下培养不能用于实验）1×/mL将出现对数生长状态传代培养：传代培养需将细胞调整到维持对数生长状态和最大活率。
贴壁培养: 贴壁细胞传代需在细胞长成单层（如下定义）然后1：5（细胞体积：最后培养基体积）稀释维持对数生长。
形成单层细胞可以传代培养悬浮培养：在细胞密度达到2.0×-2.5×细胞/mL后将密度调整至0.7×-1.0×细胞/mL进行悬浮传代。
确保传代细胞密度不高于4×个/mL或保持密度高于1×个/mL以达到对数生长状态。
Sf9悬浮培养所需要的细胞数培养基：sf-900 Ⅲ SFM（添加2%的血清减小感染过程中蛋白水解量）培养瓶与培养体积：冻存：一旦细胞系建立且倍增规律则可以进行冻存。
细胞需达到90％活率和80-90％融合的要求（如：低代次）推荐冻存几管。
当融解细胞，它将会达到最佳使用状态。
1. 用细胞计数板计数细胞。
需要足够的如上表所示密度的细胞冻存2-4管。
细胞可是悬浮或贴壁培养；2. 将无菌冻存管立于冰上，做好标记；3. 室温400-600×g离心10min。
移除上清。
4. 以给定的密度在冻存液中重悬细胞；5. 移取1mL细胞悬液置于无菌冻存管中；6. 置于-20℃1h，然后移至-80℃24-48h；7. 储存于液氮中。
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Sf9培养要点：
温度：27-28摄氏度
pH：，sf9最适的pH6.2，随培养时间的延长，Ph值会增加
传代时间：72h（三天左右）
细胞来源：Sf9（货号B825-01）和Sf21（货号B821-01）细胞系是传统的用于杆状病毒表达的细胞系，源于美国农业部昆虫病理实验室。
此细胞系适用于InsectSelect系统。
这两株细胞衍生于IPLBSF-21细胞系，来源于秋蝇蠕虫（草地夜蛾）蛹的卵巢组织。
（以上来自invitrogen）细胞特点：规则的带有颗粒球形。
贴壁紧。
标准条件的定义：
培养最低密度：0.6×106/ml（健康对数生长期细胞活率至少应不低于90％。
活率低于90％细胞不是在最佳条件下培养不能用于实验）1×106/mL将出现对数生长状态
传代培养：传代培养需将细胞调整到维持对数生长状态和最大活率。
贴壁培养: 贴壁细胞传代需在细胞长成单层（如下定义）然后1：5（细胞体积：最后培养基体积）稀释维持对数生长。
形成单层细胞可以传代培养
悬浮培养：在细胞密度达到2.0×106-2.5×106细胞/mL后将密度调整至0.7×106-1.0×106细胞/mL进行悬浮传代。
确保传代细胞密度不高于4×106个/mL或保持密度高于1×106个/mL以达到对数生长状态。
Sf9悬浮培养所需要的细胞数
培养基：sf-900 ⅢSFM（添加2%的血清减小感染过程中蛋白水解量）
培养瓶与培养体积：
冻存：一旦细胞系建立且倍增规律则可以进行冻存。
细胞需达到90％活率和80-90％融合的要求（如：低代次）推荐冻存几管。
当融解细胞，它将会达到最佳使用状态。
1. 用细胞计数板计数细胞。
需要足够的如上表所示密度的细胞冻存2-4管。
细胞可是悬浮或贴壁培养；
2. 将无菌冻存管立于冰上，做好标记；
3. 室温400-600×g离心10min。
移除上清。
4. 以给定的密度在冻存液中重悬细胞；
5. 移取1mL细胞悬液置于无菌冻存管中；
6. 置于-20℃1h，然后移至-80℃24-48h；
7. 储存于液氮中。
转染的细胞：需要的是对数期的细胞＞95%发育能力，可以完成成功的转染。
载氧：对于最优生长条件和蛋白的表达，昆虫细胞要求被动的通氧。
积极的通氧系统要求溶氧饱和在10%-50%
Sf900II和sf900Ⅲ的区别：一般推荐Sf900II来大量表达蛋白
Sf900II含有表面活性剂（剪切力保护剂（保护细胞在转瓶中培养时不会受到剪切力伤害））
当设计纯化多聚组氨酸标签蛋白的计划时，注意无血清培养基不能直接用于螯合树脂，因为培养基的成分会除去树脂中的镍离子。
细胞培养的一般顺序：复苏——传代——传代稳定——冻存
应当遵循的一般过程：复苏——贴壁培养——悬浮——悬浮扩大培养（产生目标蛋白）（也可不经过贴壁培养，直接悬浮培养）
贴壁时间：45min
悬浮的转速：80rpm
附：离心机rcf与g的换算：
无血清培养基可以选择性加入一定的抑菌剂防止细菌或者真菌污染：
培养基：GIBCO-SFM900
加青霉素链霉素抑制细菌生长两性霉素B抑制真菌生长。