5第五章核酶

(2).多功能R-酶 1986年，切克等人发现四膜虫26SRNA前体通过自我剪接作用， 切下的间隔序列(IVS)经过自身环化作用，最后得到一个在其 5′-末端失去19个核苷酸的线状RNA分子，称为L-19IVS。它是 一种R-酶，能够催化其它RNA分子进行下列多种类型的反应： 剪切反应: 2CpCpCpCp=CpCpCpCpCp+CpCpCp 末端剪切反应: CpCpCpCp=CpCpCp+Cp 限制性内切作用: -CpCpCpCpNp-=-pCpCpCpC+Np-转磷酸作用: CpCpCpCp+UpCpU=CpCpCpC+UpCpUp 去磷酸作用: CpCpCpCpCp= CpCpCpCpC+Pi 2.作用于DNA的R-酶 3.作用于多糖的R-酶 4.作用于氨基酸脂的R-酶
G-p-A以2Байду номын сангаас5'-二 磷酸酯键链接 形成套环结构
CpU 外显子 U Nn N 3' A A G G U A G U A AA U C C
5'
外显子 U 3'OH U 外显子 U U 外显子
套环状IVS
C 3'
5'
3'
成熟的RNA
三、分子间催化R-酶
分子间催化R-酶是催化其他分子进行反应的核酸类酶。根据所作用的底 物分子的不同，可以分为若干亚类。
5' CH2
G O
新5'-羟基
O 3' OH
Me2+
H A位点
O
O－ Me2+ B位点
Me2+=Mn2+,Mg2+ 以Mn2+替代Mg2+活性提高
锤头丁型肝炎病毒(HDV)的可能催化机制:
5' 5' C C O P O CH2 O P O CH2 O O NH2 O O O :OH :N O O C76 = =
(1)Ⅰ类内含子的自我剪接 (2)Ⅱ类内含子的自我剪接 (3) 自身催化剪切型 (4)异体催化剪切型
2.根据酶作用的机制分类
(1)剪接型 主要催化自身分子的剪切和连接反应的R-酶。相当于具有 内切和连接酶两种活性。 (2)剪切型 催化自身RNA或其它异体RNA一段RNA的剪除，相当于 具有内切核酸酶活性。
O =P O O－ O O- P O O－
O－
O－
NH2 H :N O
+
5' C O P O CH2 O 76 O C O 2' 3' O =
P O O－
O－
CH2
G O
CH2
G O
2'3'-环状磷酸酯
OH
O 3' :OH
O 3' OH
5' CH2 新5'-羟基
G O
中间过渡态
O 3' OH
发夹型核酶
3' 5'
形似工具“锤头”
NNN G
N C A A A G
N' G U X C GU
剪切位点
NNNN N'N'N'N'
N'N'N' A
N A
发夹型核酶结构
3' 5' 3' A gu U AUAUU n G U U C CUGG nnnn GUG nnn--nnn U CAC A GACCA NNNN NNN---NNN 5' G A AG A CA A 螺旋1 螺旋4 螺旋3 螺旋2 A G
二、自我剪接酶(self-splicing ribozyme) Ⅰ型内含子 Ⅱ型内含子
锤头型核酶结构 (hammerhead structure ribozyme) R.Symons等人研究比较植物类病毒、抗病毒和卫星病毒RNA 自身剪切规律后提出锤头结构状二级结构模型。 二级结构特征： 13个保守核苷酸残基 3个螺旋结构域 整个结构似锤头 锤头右上方GUX序列3' 端为切割位点，X可以是 A、U、C，但不能为G。
经过亿万年的进化，生物界选择催化剂具有以下特点： 1.组成的元件比较丰富，有利于针对不同的反应形成特定的 复杂空间结构； 2.在催化分子活性部位具有多种活性基团； 3.能够遗传保持稳定性，并通过变异来适应环境变化。
蛋白质作为催化剂是最佳选择，20种氨基酸、多种活性侧链 基团、线性的一级结构使蛋白质通过中心法则具备了遗传和 变异的特性。核酸分子尽管具备甲基化等几种修饰，但是分 子组成的简单化，总体上的催化潜力远不及蛋白质，由于也 能遗传和变异，催化功能被生物界保留下来。
Per-tRNA
RNaseP
5′-端成熟的tRNA
A G C C C U U C pppG
U A A G G G A A G C CAGGCCAGUAAAAAGCAUUACCCCG C p U A Portion removed by RNaseP G C G C 水解3′-磷酸酯键留下成熟的5′-端的p-G U A G C G C G C A GA C G C CUUCCU A G G GCCC U U G C GAAGG UU C CU C A A A GGG Per-tRNA UC A G CC A G GU C G C A UC A U RNaseP对per-tRNA的剪切 G C A U A C A U A C U
Substrate
Cleavage site 3' 5' NNNNNNN N'N'N'N'N'N'N' N 5' C C
酶蛋白部分
3'
E.coli RNase P 蛋白和M1RNA
四膜虫rRNA前体剪接结构
3' Cleavage site Substrate --------CUCU p N+----+G GGGAGG 5'
第Ⅰ类剪 接 在G、GMP、GDP或GTP辅因子参与下， RNA能自身剪接
pG-3'-OH作为亲核基团进攻内含子5'末端剪切接点的磷酸基团使3'-磷酸酯 键准确断裂，产生新5'-端和新3'-端。
5' per-rRNA
Mg2+ UpCpUpApApApNN---NN GpUpApAp
3'
pG3'-OH 5' pGpApApAp 5' 5'
第三节 核酶催化类型与催化机制
自剪切、接酶的结构特点和催化特性 R 酶 四膜虫26S rRNA前体 红色面包霉菌细胞色素b mRNA前体 Ⅰ 酵母核糖体大亚基rRNA前体 酵母细胞色素b mRNA前体
E.coli T4噬菌体dTMP合成酶mRNA前体
辅助因子 鸟苷或5'鸟苷酸 + + + + + +
切割位点
Ribozyme
50个核苷酸和14个核苷酸的底物形成了发夹状二级结构。 切割底物RNA后的产物是: 2'3'-环状磷酸酯 和新5'-羟基 蛋白质-RNA复合酶结构 这类核酶主要用于tRNA的前体加工过程，例如S.Altman和 N.Pace两个研究组合作发现E.coli tRNA5'-端成熟酶(RNase P)。 这种酶由蛋白质和M1RNA两个组分构成，其中蛋白质的分子只 是维护M1RNA的构象。实验证明，来自不同原核生物细胞蛋白 质-RNA复合酶中的M1RAN具有相似的三维结构。与前面几种 剪切型核酶不同的是，蛋白质-RNA复合酶催化得到的产物的3'端是羟基，5'-端是磷酸。
3' 5' 3' A gu U AUAUU n G U U C CUGG nnnn GUG nnn--nnn U CAC A GACCA NNNN NNN---NNN 5' Ribozyme G A G A CAA A 螺旋1 螺旋4 螺旋3 螺旋2 A G
切割位点
切割底物RNA后的产物是: 2'3'-环状磷酸酯 和新5'-羟基
UpCpU3'-OH
亲核进攻UpA间磷原 子使3'-磷酸酯键断裂
GpUpApApAp
3'
UpCpUpU pApApAp
3'
rRNA
5' pGpApApApNN---NNG-OH 3' Interveming Sequence (G-IVS)
5' pGpApApApNN---NNG-OH 3' Interveming Sequence G- IVS(433nt) 19nt
Mg2+
环状 结构 + + + + + +
套环 结构
+ + + + + + + + + +
酵母核糖体大亚基rRNA前体 酵母脱辅基细胞色素bmRNA前体 Ⅱ 酵母细胞色素氧化酶 mRNA前体 酵母细胞色素c氧化酶 mRNA前体 细胞核mRNA前体
+ + + +
一、自剪切型机制 核酶William B.Lott 催化假说： 单金属氢氧化物离子模型(one-metal-hydroxide-ion)机制:
第四章 核 酶 (ribozyme) 发现
核酶是美国科学家Cech(1981)和Altman(1983)发现的具有酶的 催化特异性功能的一类RNA。 核酶多功能性 核酶主要指具有生物催化功能的RNA，亦称RNA催化剂。进 一步研究发现核酶除了具有催化RNA剪切或剪接催化功能外， 还具有催化DNA与RNA的特异性水解、模版RNA连接、核苷 转移、氨酰-tRNA合成及多核苷酸的磷酸化作用等。 前景迷人 现在发现，蛋白质生物合成中肽键形成步骤可由RNA单独催 化进行。随着研究深入，核酶催化反应种类在不断增多，新 的功能还在不断发现，不久将会有新的突破。人工合成的核 酶位基因干预和治疗提供了新的手段，为病毒和癌症治疗提 供了新的武器，具有诱人的应用前景。
C A A C G 细胞核类 U 2'OH U L-19IVS Nn G A A A U 外显子 UpG A U U Cp U 外显子 C C
内含子环中距3'-剪切点78位腺嘌呤核苷酸残基2'OH作为亲核剂进攻5'-端 剪切点形成的套索结构。
3'
5'
U Nn N
A A G G U A G A AAU U
RNAseP(核糖核酸酶P) 由蛋白质和RNA构成的复合体，是一种核酸内切酶。这种 酶真正的活性中心是在RNA分子中，其成分高度保守，而 蛋白质只是起支持结构的功能。
(2)小分子核酶
锤头型(hammerhead) 发夹型(hairpin) 肝炎δ病毒(hepatitis delta virus) VS核酶(Neuropora Varkud satellite ribozyme)
3'
5'
NNN G
N C A A A
N' G U X UC G NA
剪切位点
NNNN N'N'N'N'
N'N'N' A G
二、自剪接型机制
Cech小组研究四膜虫26s per-rRNA基因转录问题时，发现转录产物很不稳 定，几秒钟之内自动切除413nt的内含子片段，并产生成熟的rRNA分子， 此过程没有任何蛋白质或酶存在情况下发生。
O－ C O P O CH2 自剪切 O O O :O H Oδ H δ+ =
O =P O Me2+ O－
O－ O P O CH2 O O = O
P O OH O－
C O
2'3'-环状磷酸酯
Me (OH)2
双金属离子模型机制: 自剪切
O－ C O P O CH2 O O O :O H Oδ =
+ O =Pδ
第一节 核酶的分类
核酶和此后发现的脱氧核核酶(deoxyribozyme)，目前统称 为酶性RNA(或RNAzyme)和酶性DNA(或DNAzyme)。 现在已经发现核酶广泛存在于从低等生物到高等多种生物 中，它们参与细胞内RNA及其前体的加工和成熟过程。自 然界存在的核酶可有以下几种分类法。
1.根据催化反应的种类分类
第二节 天然核酶结构特征
根据已发现核酶催化反应分两大类： 一、自我剪切酶(self-cleavage ribozyme) 自我剪切酶自身能够剪切除去本分子一端部分寡核苷酸片 段，保留部分具有另外的生物功能。催化自身或者异体 RNA分子的切割，相当于核酸内切酶。主要有四个类型： 锤头型核酶 发夹型核酶 丁型肝炎病毒(HDV)核酶 蛋白质-RNA复合酶(RNaseP)
3.根据酶作用的底物分类
(1)自身催化 大多数核酶是以自身为底物的自身催化，包括自剪切和自剪接。 (2)异体催化 催化DNA与RNA的特异性水解、模版RNA连接、核苷转移、 氨酰-tRNA合成及多核苷酸的磷酸化作用。
4.根据酶分子的大小分类
(1)大分子核酶 由几百个单核苷酸组成。 Ⅰ类内含子(groupⅠintron) 存在于各类生物的细胞器基因和核基因中，甚至在噬菌体 中也已发现。典型例子：四膜虫per-mRNA，藻类线粒体 mRNA和tRNA前体，玉米及豆类叶绿体rRNA前体，T4噬 菌体胸腺嘧啶合成酶转录产物，其中四膜虫的大rRNA前 体已经相当清楚。 Ⅱ类内含子(groupⅡintron) 典型代表: 酵母线粒体细胞色素氧化酶per-mRNA、真核per-snRNA。
自剪接
L-19IVS (414nt) 5'-GA------------G3' 5'-GA(15nt)
自剪接
环状(399nt) 4nt
自剪接
环状(395nt) L-19IVS(395nt)
第Ⅱ类RNA的自剪接机制:
Ⅱ型IVS是与细胞核mRNA前体的IVS结构相似的间隔序列。 Ⅱ型IVS剪接 不需要鸟苷或鸟苷酸，担仍然需要Mg2+。
1、异体催化剪切型
(1)RNA剪切酶：E.coli中核糖核酸酶P(RNase P)的核酸组分M1RNA， 在高浓度镁离子存在的条件下，具有催化tRNA前体的剪切反应，使 tRNA前体除去部分RNA片段，而成为成熟的tRNA分子。随后证明， 许多原核生物中的核糖核酸酶P中的RNA(Rnase P-RNA)也具有剪切 tRNA前体生成成熟的tRNA的功能。 1983年Altman和Pace报道RNaseP可催化per-tRNA加工。