孔雀石绿检测步骤

水产品中孔雀石绿和结晶紫残留量的测定高效液相色谱荧光检测法

的改进与实践心得

1范围

本标准规定了水产品中孔雀石绿及其代谢产物隐性孔雀石绿残留总量、结晶紫及其代谢产物隐性结晶紫残留量的高效液相色谱荧光测定方法。

2规范性引用文件

本文主要参考了GB20361-2006水产品中的孔雀石绿和结晶紫残留量的测定高效液相色谱荧光检测法以及Determination of Malachite Green and Leucomalachite Green in Salmon with In-Situ Oxidation and Liquid Chromatography with Visible Detedction并结合实践进行报告。

3原理

样品中残留的孔雀石绿或结晶紫用硼氢化钾还原为其相应的代谢产物隐性孔雀石绿或隐性结晶紫，乙腈-乙酸铵缓冲溶液混合提取，二氯甲烷溶液液萃取，固相萃取柱净化，反相色谱柱分离，荧光检测器检测，外标法定量。

4试剂

除另有规定外，所有的试剂均为分析纯，实验用水应为二级水。

4.1 乙腈：色谱纯。

4.2 二氯甲烷：色谱纯。

4.3 酸性氧化铝：分析纯，粒度0.071mm-0.150mm。

4.4 二甘醇。

4.5 硼氢化钾。

4.6 无水乙酸铵。

4.7 冰乙酸。

4.8 氨水。

4.10 硼氢化钾溶液（0.2mol/L）：称取0.27g硼氢化钾于烧杯中，加入25mL水溶解，现配现用。

4.11 20%盐酸羟胺溶液：溶解12.5盐酸羟胺在50ml水中。

4.12 对甲苯磺酸（0.05mol/L）：称取0.95g对甲苯磺酸，用水稀释至100mL容量瓶中。4.13 乙酸铵缓冲溶液（0.1mol/L）：称取7.71g无水乙酸铵溶于1000mL水中，氨水调pH 到10.0。

4.14 乙酸铵缓冲溶液（0.125mol/L）：称取9.64g无水乙酸铵溶解于1000mL水中，用冰乙酸调pH到4.5。

4.15 酸性氧化铝固相萃取柱：500mg，3mL。使用前用约9mL已经活化。

4.16 Varian PRS柱：500mg。3mL。使用前用约9mL乙腈活化。

4.17 标准品：孔雀石绿分子式未（C23H25N2）（C2HO4）2C2H2O4、结晶紫分子式为C25H29ClN3,纯度大于98%。

4.18 标准溶液：分别准确称取适量的隐形孔雀石绿、隐形结晶紫标准品约1.50mg，用乙腈稀释至250ml容量瓶，低温避光保存。

5仪器设备

5.1 高效液相色谱

5.2 匀浆机

5.3 离心机：4000r/min

5.4 漩涡震荡机

5.5 固相萃取装置

5.6 旋转蒸发仪

6样品制备

6.1取样

鱼去鳞、、去骨、去皮，沿背脊取肌肉部分；虾去头、壳、肠腺，取肌肉部分；蟹、甲鱼等取可食用部分、样品切为不大于0.5cm×0.5cm×0.5cm的小块后混合。

6.2提取

称取5g以上不超过5.5g的样品于50ml离心管内，加入10ml乙腈，先用小烧杯盛载乙腈清洗匀浆机刀头，约13000r/min 对试样进行匀浆提取直到把鱼样打碎，约30秒。

（若要进行加标测回收率，此时加入标准溶液200μl）加入5ml乙酸铵溶液（3.14），加入25μl对甲苯磺酸（4.12），1ml盐酸羟胺（4.11）再加入100μl的对甲苯磺酸（4.12）。盖上盖子，漩涡震荡30s。加入25ml乙腈，盖上盖子，振摇30s。加入10g或以上的氧化铝，盖上盖子，振摇15s。于4000r/min离心5min。

放置250ml分液漏斗，于其中加入50ml蒸馏水、2ml二甘醇。把离心管的上清液倾倒于分液漏斗中。向含有残余物的离心管加入25ml乙腈，盖上盖子，漩涡震荡30s，振摇30s，然后于4000r/min离心5min。把离心管的上清液倾倒于含有第一次萃取液的分液漏斗中。于分液漏斗中加入1ml硼氢化钾。于分液漏斗中加入35ml二氯甲烷，盖上盖子，注意及时放气，往返震荡约10次，打开盖子，静置分层。取下层溶液，收集于150ml茄形瓶中，需要定量时，最后几滴的下层有机溶液也要收集。再往250ml的分液漏斗中加入25ml二氯甲烷，重复一次上述的萃取步骤。静置后，继续收集下层溶液，于盛有第一次萃取液的茄形瓶中。

于50℃旋转蒸发，直到把茄形瓶中的溶液蒸至近干。

用2.5mL乙腈溶解茄形瓶中的残渣。

6.3净化

将PRS柱安装在固相萃取柱装置上，上端连接酸性氧化铝固相萃取柱，用乙腈活化，一般需要活化3次以上，转移提取液到柱上，再用乙腈洗茄形瓶2次，每次2.5mL，依次过柱，弃去酸性氧化铝住，吹PRS柱近干，再不抽真空的情况下，加入等体积混合的乙腈和乙酸铵溶液（4.13），收集洗脱液，再加入等体积混合的乙腈和乙酸铵溶液（4.14），再次收集洗脱液，收集洗脱液用玻璃瓶，乙腈定容至3mL，供液相色谱测定。

注意事项

标准溶液配置时，隐形孔雀石绿及隐形结晶紫分别称量 1.50mg，需准确记下质量。标准样品（固体）称量完毕，需马上将其低温避光保存。

进行取样步骤时，应尽量把鱼肉反复剁碎。

取鱼样前先要将样品解冻。每次称量样品，需要准确记录样品的质量。

匀浆操作注意尽量不要使匀浆机连续操作1分钟以上，因其发热，匀浆时间过长容易导致机

器的损坏。若鱼肉确实没有打碎，也应停顿后再继续匀浆。

每次使用匀浆机前，需要拆卸刀头，先用自来水清洗，再用蒸馏水清洗。处理鱼样前，先用小杯乙腈清洗刀头数十秒，此时匀浆机应处于工作状态。每一次处理鱼样后，需要重复上述步骤。

如果需要加标，应在匀浆之后加标。

第一次使用移液管时，应先用自来水洗，在用蒸馏水洗，最后用待移取的溶液润洗3次，再贴好标签，每支移液管只取对应的一种溶液，不要混用，以后每次使用移液管时不必再进行清洗。

在提取步骤中，加入了2次对甲苯磺酸，其中使用量程为50μL的移液枪来吸取25μL的对甲苯磺酸，使用量程为200μL的移液枪来吸取100μL的对甲苯磺酸。其中，加入25μl 的对甲苯磺酸，是根据FDA文献方法的要求，出于补偿酸性缓冲乙酸铵溶液的需要。

氧化铝可处理鱼肉中的脂肪等物质，应该根据鱼样的质量来决定氧化铝的用量，一般5g的鱼样需要大约10g的氧化铝，若鱼样较多或较多脂肪，应适当增加氧化铝的用量，否则实验会失败。

离心时，注意离心管的液体体积，尽量使其平衡。

使用分液漏斗前，一定要先验漏。往分液漏斗倾倒溶液前，一定要将分液漏斗的活塞关闭。

加入了二氯甲烷，进行液液萃取时，应上戴橡胶手套，一定要注意及时放气，应在通风处放气，放气口不要对着人。

静置分层时，注意打开分液漏斗的盖子，务必确认活塞处于关闭状态。

分液萃取操作时，静置分层约5分钟，过快收集容易同时收集少量微粒的乙腈，使旋转蒸发操作更困难，大大增加旋蒸时间。

第一次使用旋转蒸发仪时，需要把所有部件拆除，逐一清洗干净。以后不必再清洗。每次旋蒸样品前，应先旋蒸大约15-20ml的乙腈至近干，然后再旋蒸萃取液。旋蒸时需要及时加冰。旋蒸时，先开自来水，打开真空泵，再打开旋蒸仪；关闭时，先关闭旋蒸仪，再关水泵，最后关自来水。

过柱操作时，加入乙腈溶解茄形瓶中的残液时，应充分摇晃，使其溶液后再转移至固相萃取柱上。

进行净化时，活化的次数可以适当增加，一般不能少于3次。如果发现液体停止滴下，可以适当抽真空以提高速度（真空度低于0.2），若发现其开始滴下，应尽快停止抽真空泵。但是收集洗出液时不能抽真空。