孔雀石绿检测步骤
孔雀石绿检测标准
孔雀石绿检测标准介绍孔雀石绿是一种有机物，常用于染色、防腐、除草等领域。
然而，孔雀石绿的过量使用可能对人体健康产生负面影响。
为保护公众的健康，许多国家都制定了孔雀石绿的检测标准。
本文将深入探讨孔雀石绿的检测标准，包括其原理、方法和应用。
原理孔雀石绿的检测是基于其化学性质的特点进行的。
常见的检测方法有高效液相色谱法、气相色谱法等。
这些方法利用孔雀石绿分子的结构特征，通过色谱技术对孔雀石绿进行分离和测定。
高效液相色谱法高效液相色谱法（HPLC）是一种常用的分离和定量分析方法，它利用样品中不同成分在色谱柱中的差异分离出目标物质。
在孔雀石绿的检测中，也可以使用HPLC方法。
检测步骤1.样品制备：将待测样品进行处理，例如提取、稀释等。
2.色谱柱选择：选择适合的色谱柱，根据需要可使用反相柱、离子交换柱等。
3.流动相选择：根据孔雀石绿的特性选择合适的流动相，如甲醇、乙腈等。
4.柱温控制：控制色谱柱的温度，以优化分离效果。
5.检测器选择：选择合适的检测器，如紫外/可见光检测器、荧光检测器等。
6.方法验证：确定分析方法的准确性和重复性。
7.样品分析：将样品按照一定流速通过色谱柱，采集检测结果。
气相色谱法气相色谱法（GC）是另一种常用的孔雀石绿检测方法。
它利用样品中不同成分在固定相和流动相之间的差异分离出目标物质。
检测步骤1.样品制备：将待测样品进行提取和净化处理，通常使用溶剂提取法或固相萃取法。
2.气相色谱仪选择：选择适当的气相色谱仪，包括色谱柱、进样器和检测器等。
3.良好的进样技术：确保样品能够均匀地进入色谱柱。
4.标准曲线的建立：使用标准样品建立孔雀石绿的浓度与响应信号的关系曲线。
5.批内和批间精密度实验：评估方法的精密度和准确性。
6.样品分析：按照一定流速将样品进入气相色谱仪，记录检测结果。
应用孔雀石绿的检测标准广泛用于食品、环境和农产品等领域。
食品安全是社会关注的热点之一，特别是对于水产品、禽畜肉和加工食品等易污染食品，孔雀石绿的检测显得尤为重要。
KJ2017001水产品中孔雀石绿的快速检测胶体金免疫层析法
KJ2017001水产品中孔雀石绿的快速检测胶体金免疫层析法水产品中孔雀石绿的快速检测胶体金免疫层析法（KJ201701）1 范围本方法规定了水产品及其养殖用水中孔雀石绿和隐色孔雀石绿总量的胶体金免疫层析快速检测方法。
本方法适用于鱼肉及养殖用水中孔雀石绿和隐色孔雀石绿总量的快速测定。
2 原理样品中孔雀石绿、隐色孔雀石绿经有机试剂提取，吸附剂净化，正己烷除脂后，加入氧化剂将隐色孔雀石绿氧化成为孔雀石绿，经浓缩复溶后，孔雀石绿与胶体金标记的特异性抗体结合，抑制抗体和检测卡中检测线（T线）上抗原的结合，从而导致检测线颜色深浅的变化。
通过检测线与控制线（C线）颜色深浅比较，对样品中孔雀石绿和隐色孔雀石绿总量进行定性判定。
3 试剂和材料除另有规定外，本方法所用试剂均为分析纯，水为GB/T 6682规定的二级水。
3.1 试剂3.1.1 正己烷。
3.1.2 乙腈。
3.1.3 冰乙酸。
3.1.4 盐酸。
3.1.5 吐温-20。
3.1.6 氯化钠。
3.1.7 对-甲苯磺酸。
3.1.8 无水乙酸钠。
3.1.9 盐酸羟胺。
3.1.10 无水硫酸钠。
3.1.11 中性氧化铝：层析用，100目~200目。
3.1.12 二氯二氰基苯醌。
3.1.13 氯化钾。
3.1.14 磷酸二氢钾。
3.1.15 十二水合磷酸氢二钠。
3.1.16 饱和氯化钠溶液：称取氯化钠（3.1.6）200g，加水500mL，超声使其充分溶解。
3.1.17盐酸羟胺溶液（0.25g/mL）：称取2.5g盐酸羟胺（3.1.9），用水溶解并稀释至10mL，混匀。
3.1.18 乙酸盐缓冲液：称取4.95g无水乙酸钠（3.1.8）及0.95g 对-甲苯磺酸（3.1.7）溶解于950mL水中，用冰乙酸（3.1.3）调节溶液pH为4.5，用水稀释至1L，混匀。
3.1.19 二氯二氰基苯醌溶液（0.001mol/L）：称取0.0227g二氯二氰基苯醌（3.1.12）置于100mL棕色容量瓶中，用乙腈（3.1.2）溶解并稀释至刻度，混匀。
孔雀石绿检测卡说明书——组织
孔雀石绿免疫胶体金快速检测卡使用说明本产品用于快速检测水产品组织样品中的孔雀石绿残留，整个检测过程只需要40分钟左右，适用于各类企业及检测机构,本产品检测限如下表所示1、检测原理：孔雀石绿快速检测卡应用了竞争抑制免疫层析的原理，样品中的孔雀石绿在流动的过程中与胶体金标记的特异性单克隆抗体结合，抑制了抗体和NC膜检测线（T）上孔雀石绿－蛋白偶联物的结合。
如果样品中孔雀石绿含量大于1ppb，检测线（T）不显颜色或者检测线（T）比质控线（C）浅两个色差以上（含两个），结果为阳性；反之，检测线（T）显红色，结果为阴性。
需自备设备：均质器；电子天平；称量勺；离心机；氮（空）气吹干仪；微量移液器。
3、样品处理：组织样（虾要去掉头和壳后彻底清洗干净，鱼要去鳞后洗净）应当避光冷藏保存。
1.取切碎的一定量的组织样本，用均质器均质；2.称取2ｇ均质于1５ｍｌ离心管中；3.用微量移液器加入1.5ｍｌＭＧ提取剂１，然后加入4ml ＭＧ提取剂２和１管ＭＧ提取剂３于1５ｍｌ离心管中。
4.剧烈振荡3min后，加入一管MG提取剂4，剧烈振荡1分钟后，室温下4000r/min离心5min;5.用微量移液器移取3ml上清于15ml离心管中，用微量移液器加入1ml正己烷，上下颠倒6次，室温4000r/min离心1min,用微量移液器移取离心管刻度1ml到3ml之间的液体（大约2ml）到新的5ml离心管中，再加入MG氧化剂瓶内的下层黄色液体0.1ml,混合均匀1分钟后，65℃加热条件下，用空气吹干；6.用微量移液器向吹干的离心管中加入300ulMG复溶液，用微量移液器冲洗溶解试管内壁上残留物；静置2分钟；7.吸取待检样品溶液100微升于金标微孔中，用小滴管吹打完全溶解孔内红色物质，等待反应5分钟。
4、使用步骤：1. 在进行测试前先完整阅读使用说明书，使用前将试剂板和待检样本溶液恢复至室温（20℃~25℃）；2. 从原包装袋中取出试剂板，水平放置于观察者正面，如下图右侧所示（打开后请立即使用）；3. 吸取待检样品溶液60～80微升于加样孔中（滴管滴3滴），加样后开始计时；4. 结果应在8～10分钟读取，其他时间判读无效。
孔雀石绿的分析
加入抗体,标液(或样品稀释液)各100μL/孔,室温孵育1h。 包被在酶标板上的固定抗原(LMG-OVA)和添加的标液中的 LMG游离抗原与竞争抗体的结合位点。PBS洗涤扣干3次 ，游离的抗原抗体复合物被洗涤去除。
建立小分子免疫分析技术,关键点有3个:
人工抗原合成和抗体制备。 酶和抗体标记物的备。 检测技术方法学的建立。
LMG是小分子质,在免疫学上称半抗原,必须要同大分子 载体偶联后才能免疫动物制备抗体。
无色孔雀石绿的修饰
无色孔雀石绿的衍生化反应途径
一、免疫原及包被抗原的制备
利用重氮化法将无色孔雀石绿修饰物与牛血清白蛋白 (BSA)和卵清蛋白(OVA)交联,制成免疫原及包被抗原
加入5%硫酸,80μL/孔,终止反应。
结果处理：
用酶标仪于450nm处测定各孔溶液的吸光度(A)。标 准溶液中无色孔雀石绿的浓度越大,吸光度越小。以A～ logC作图得到测定无色孔雀石绿的标准曲线,从图中可以 算出检出限(DL)和IC50值。IC50值越小,灵敏度越高。待 测样品中无色孔雀石绿的浓度可根据其相应的吸光度从标 准曲线中求出。
2020/3/30
孔雀石绿(MG)的结构式： 无色孔雀石绿(LMG)的结构式:
孔雀石绿的检测方法
目前孔雀石绿的检测以理化检测法和免疫学检测法为主。
一、理化检LC) 液相色谱质谱串联检测法( LC-MS) 气相色谱质谱联用法( GC-MS)
加入用PBS稀释的山羊抗兔 IgG2辣根过氧化物酶偶合物 (GaRIgG-HRP), 200μL/孔,室温1h。形成抗原-抗体-酶标 二抗的复合物固定在酶标二抗上，洗板, 。PBS洗涤扣干3 次，游离的酶标二抗被洗涤除去。
水产品中孔雀石绿检测的固相萃取方法16316
APP ID NO. : FLM-S170009水产品中孔雀石绿检测的固相萃取方法（SuperClean AL-N）一、实验目的本研究利用固相萃取法作为样品的前处理方法，HPLC 法作为分析方法，检测水产品中孔雀石绿含量。
该方法可简化样品的前处理过程，节省有机溶剂的使用，操作简便。
二、实验目标物孔雀石绿(CAS:569-64-2)三、应用范围本方法适用于鲜活水产品中孔雀石绿的检测的HPLC 检测及确证。
四、参考标准《GB/T 19857-2005 水产品中孔雀石绿和结晶紫残留量的测定》五、实验材料NuAnalytical SuperClean Alumina-N 固相萃取柱1000mg/3mL。
六、实验方法1、样品待测溶液制备准确称取鱼肉样品5.0 g 于50 mL 离心管中，加入10 mL 乙腈，超声波振荡提取5 m in，涡旋1 min，4000r/min 离心5 min，上清液转移至50 mL 离心管中,残渣按照上述步骤重复提取一次；合并两次提取液，用乙腈定容至25 mL。
2、活化依次用5 mL 乙腈活化3、上样和洗脱在中性氧化铝固相萃取柱上加入5 mL 待净化样品，收集流出液，然后用 4 mL 乙腈洗脱，合并收集流出液。
4、重新溶解流出液45 ℃氮吹至近干，1 mL 乙腈定容，过0.45 μm 滤膜，，供高效液相色谱测定。
5、HPLC 条件色谱柱：SuperLu C18 (250×4.6mm, 5μm)检测器：UV-Vis@618 nm流动相：A-乙腈B-0.05 mol/L 乙酸铵缓冲溶液流速：1.2 mL/min 进样体积: 50 μL洗脱方式：梯度洗脱，洗脱程序如下：时间/min A/% B/%0.0 60 403.00 60 403.10 80 2010.00 80 2010.10 60 40 13.00 60 40七、实验结果1、0.5 mg/kg 鱼肉中孔雀石绿的添加回收结果表 1 0.5 mg/kg 鱼肉中孔雀石绿的添加回收结果回收率（%）名称平均回收率（%）RSD（%）1 2 3孔雀石绿91.0 91.8 87.2 90.0 2.73 2、添加水平为0.5 mg/kg 鱼肉中孔雀石绿检测的液相色谱图图 1 添加水平为0.5 mg/kg 鱼肉中孔雀石绿检测的液相色谱图。
水产品有机有害物的检测—孔雀石绿的测定
定量方法
四
内标法：
① 实验过程采用同位素内标法。 ② 内标物为：同位素内标氘代孔雀石绿(D5-MG)、
同位素内标氘代隐色孔雀石绿(D6-LMG)，纯度 大于98%。
检测原理
二
提取原理
试样中的孔雀石绿、隐色孔雀石绿、结晶 紫、隐色结晶紫残留用乙腈提取，中性氧 化铝和阳离子交换固相萃取柱净化。
定量方法
1.液相色谱串联质谱测定 2.内标法定量。
三
1.提取过程：
提取步骤
称取5g样品于50 mL塑料离心管中； 加入20 μL内标标准工作液,加人10 mL乙腈； 匀浆2 min(l0000 r/min)； 超声提取10 min,离心3 min(3000 r/min)； 取上清液再加人10 mL乙腈,重复提取一次；
提取步骤
三
2.净化过程：
活化：5 mL乙腈。 上样：准确吸取5mL过固相萃取柱。 洗脱：用4 mL乙腈淋洗收集。 浓缩：洗脱液氮吹至0.5mL(≤45℃)。 复容：1.0 mL乙腈溶解，再加入1mL 乙酸铵溶液，过0.45 μm滤膜测定。
检测范围
四
种类及项目参数：
① 鱼、虾、蟹、贝、鱼粉、植物源性饲 料、浓缩饲料、配合饲料、饲料添加 剂、精料补充料。
检测原理 提取步骤 检测范围
孔雀石绿 简介
一
孔雀石绿室一种带有金属光泽的绿色结晶体，易 溶于水，水溶液呈蓝绿色。曾经作为杀菌剂，杀虫剂， 消毒剂 广泛应用于养殖业中，预防水产品水霉病、 鳃霉病和寄生虫病等，也用于水产品的运输和存放过 程中消毒并延长鱼类的生存时间，经研究表明孔雀石 绿进入人体或动物体后，代谢产物有高毒性、高残留 具有致畸 致癌 致突变风险严重危害人体或水产品安 全，因此我国已将孔雀石绿列为水产养殖禁用药物。
孔雀石绿检测步骤
水产品中孔雀石绿和结晶紫残留量的测定高效液相色谱荧光检测法的改进与实践心得1范围本标准规定了水产品中孔雀石绿及其代谢产物隐性孔雀石绿残留总量、结晶紫及其代谢产物隐性结晶紫残留量的高效液相色谱荧光测定方法。
2规范性引用文件本文主要参考了GB20361-2006水产品中的孔雀石绿和结晶紫残留量的测定高效液相色谱荧光检测法以及Determination of Malachite Green and Leucomalachite Green in Salmon with In-Situ Oxidation and Liquid Chromatography with Visible Detedction并结合实践进行报告。
3原理样品中残留的孔雀石绿或结晶紫用硼氢化钾还原为其相应的代谢产物隐性孔雀石绿或隐性结晶紫，乙腈-乙酸铵缓冲溶液混合提取，二氯甲烷溶液液萃取，固相萃取柱净化，反相色谱柱分离，荧光检测器检测，外标法定量。
4试剂除另有规定外，所有的试剂均为分析纯，实验用水应为二级水。
4.1 乙腈：色谱纯。
4.2 二氯甲烷：色谱纯。
4.3 酸性氧化铝：分析纯，粒度0.071mm-0.150mm。
4.4 二甘醇。
4.5 硼氢化钾。
4.6 无水乙酸铵。
4.7 冰乙酸。
4.8 氨水。
4.10 硼氢化钾溶液（0.2mol/L）：称取0.27g硼氢化钾于烧杯中，加入25mL水溶解，现配现用。
4.11 20%盐酸羟胺溶液：溶解12.5盐酸羟胺在50ml水中。
4.12 对甲苯磺酸（0.05mol/L）：称取0.95g对甲苯磺酸，用水稀释至100mL容量瓶中。
4.13 乙酸铵缓冲溶液（0.1mol/L）：称取7.71g无水乙酸铵溶于1000mL水中，氨水调pH 到10.0。
4.14 乙酸铵缓冲溶液（0.125mol/L）：称取9.64g无水乙酸铵溶解于1000mL水中，用冰乙酸调pH到4.5。
4.15 酸性氧化铝固相萃取柱：500mg，3mL。
DM-P-049 水产品中孔雀石绿和结晶紫及其代谢产物的检测
水产品中孔雀石绿和结晶紫及其代谢物的检测序列号：DM-P-049 1 适用范围本方法适用于水产品中孔雀石绿和结晶紫及其代谢物的检测。
2 样品准备/提取1、称取已粉碎（已均质）的样品1 g于15 mL离心管中，加入1 mL 0.05 mol/L 苯磺酸溶液、1 mL0.25 g/mL盐酸羟铵溶液、0.4 mL0.1 mol/L乙酸铵溶液(pH4.5)和8 mL乙腈，涡旋混合2 min，4000 rpm离心1 min；2、将上清液转移至50 mL离心管中，残渣按照步骤1重复提取一次；3、合并两次提取液，并加入6 mL三氯甲烷和7 mL水，涡旋混合1 min，4000 rpm离心1 min；4、取下层清液于旋蒸瓶中，向上层清液加入6 mL三氯甲烷，重复提取一次；5、合并两次下层三氯甲烷溶液，40℃减压蒸至近干，加入5 mL乙腈待净化。
3 SPE柱净化——ProElut Al-N（1 g/6 mL）（Cat.#：65306）上层ProElut SCX（500 mg/3 mL）（Cat.#：63604）下层(1)活化：加入10 mL乙腈，流出液弃去；(2)上样：将待净化液加入小柱，流出液弃去；(3)淋洗：加入5 mL乙腈淋洗小柱，流出液弃去，并去掉上层Al-N小柱；(4)洗脱：加入5 mL5%氨水乙腈，收集洗脱液；(5)重新溶解：将洗脱液在40 ℃下减压蒸干，1 mL定容液*溶解残渣，过微孔滤膜供HPLC分析。
*定容液：乙酸铵缓冲液：盐酸羟铵溶液=2：1乙酸铵缓冲液：乙腈：0.05 mol/L乙酸铵溶液(pH4.5)=75:25；盐酸羟铵溶液：取1 mL0.25 g/mL盐酸羟铵溶液用水定容至100mL。
4 分析条件色谱柱：Platisil ODS，250 x 4.6 mm，5μm（Cat.# 99503）流速： 1.0 mL/min检测器：UV 591 nm和UV 266 nm柱温：30 ℃进样量：20 μL流动相：A：乙腈B：0.05 mol/L乙酸铵溶液(pH4.5)梯度：5添加回收结果5.1孔雀石绿和结晶紫检测图谱(UV 591nm)Tim e (m in)V o l t s5.2 鳕鱼中孔雀石绿和结晶紫(添加水平1.0 mg/kg)检测图谱(UV 591nm)Tim e (m in)V o l t s5.3 鳕鱼中孔雀石绿和结晶紫(空白)检测图谱(UV 591nm)2468101214Tim e (m in)0.000.020.040.06V o l t s5.4隐色孔雀石绿和隐色结晶紫检测图谱(UV 266nm)Tim e (m in)V o l t s5.5鳕鱼中隐色孔雀石绿和隐色结晶紫(添加水平1.0 mg/kg)检测图谱 (UV 266nm)Tim e (m in)V o l t s5.6鳕鱼中隐色孔雀石绿和隐色结晶紫(空白)检测图谱(UV 266nm)2468101214Tim e (m in)0.000.020.040.06V o l t s。
水产品中孔雀石绿快速检测方法
水产品中孔雀石绿快速检测方法
组织检测步骤：
鱼虾等去皮、脂肪，用均质器均质样本，称取2±0.05g均质物于15ml离心管；加入1瓶去脂试剂，振荡2min，室温4000rpm，离心3min。
倒掉上清液，把肉样弄松散（若要做添加实验，请在此刻加入添加物）；加入1瓶提取剂A，立即摇匀，然后加入1瓶提取剂B，充分振荡混合5min，室温4000rpm，离心5min；取上层有机层4ml到15ml离心管中，加入20ul衍生化试剂，涡旋1min，加入4ml净化剂，颠倒混匀1min，静置1min；取下层（溶液显紫红色）2ml，55℃下使用便携式空气吹干仪吹干；然后加入0.5ml缓冲液剧烈涡旋2min，待检。
检测:从包装中取出微孔，用移液器吸取待检液体80ul至微孔中充分吸打均匀，然后全部滴加至检测卡加样孔（检测卡平放），静置8-15分钟，根据示意图判读结果（见彩图）水样检测步骤：
①用移液器吸取80µl样本液至样品孔中。
②静置5-8分钟，根据示意图判读结果。
结果判定及示意图：
在试纸卡的中央判读区喷有2条线，上面一条为对照线(C线)，下面一条为测试线(T线)。
若样品液中孔雀石绿的浓度小于检测限时，则T线显色比C线强，或显色与C线相近；若样品液中孔雀石绿的浓度大于检测限时，则T线显色比C线浅很多或T线显绿色。
实验设备：
1、孔雀石绿快速检测卡；
2、PRO-12L空气吹干仪;
3、HH-1水浴锅；
4、80-2离心机；
5、均质器；
6、掌上电子天平。
有关孔雀石绿检测卡的说明之方法二
关于孔雀石绿快速检测卡的使用说明（组织）【概述】孔雀石绿是一种带有金属光泽的绿色结晶体，又名碱性绿、严基块绿、孔雀绿，其既是杀真菌剂，又是染料，易溶于水，溶液呈蓝绿色。
长期以来，渔民都用它来预防鱼的水霉病、鳃霉病、小瓜虫病等，而且为了使鳞受损的鱼延长生命，在运输过程中和存放池内，也常使用孔雀石绿。
科研结果表明，孔雀石绿在鱼内残留时间太长，且其具有高毒性、高残留和致癌、致畸、致突变等副作用，鉴于此，许多国家均将孔雀石绿列为水产养殖禁用药物。
【用途】本试纸卡为定性检测,可用于检测组织，鱼、虾、以及鱼池或者鱼缸水样中的孔雀石绿残留。
适于现场监控和大量样本筛查，注意，去离子水不能作为阴性对照。
【试剂组份】需自备设备：搅拌器振荡器电子天平离心机空气吹干仪移液器【检测原理】本检测卡采用胶体金免疫层析方法，在NC膜上预包被偶联抗原和羊抗鼠IgG抗体，样本中残留的孔雀石绿药物和NC膜上预包被的偶联抗原竞争孔雀石绿抗体，抑制抗原和孔雀石绿抗体的结合。
从而通过对检测线和质控线的观察就可以判断样品中孔雀石绿药物是否超过检测限。
【技术指标】孔雀石绿快速检测试纸条技术指标为水样2ppb组织2ppb。
【样品处理】1. 鱼虾蟹、畜禽肉、内脏等去皮、脂肪，用均质器均质样本，取1g去脂肪组织样本，加入到配套的15ml离心管中。
2．向离心管中准确加入2ml MG提取液1和2ml MG提取液2，将瓶塞盖紧密封，用力振荡5分钟，4000rpm离心1分钟（备注：如实验室没有大离心机设备，可以用小离心管取1.5ml上清液，用小离心机离心）。
3．用吸管取0.6mL上清液到小玻璃杯中，吹干滤液（空气吹干仪），然后用0.3ml MG复溶液复溶杯底固体。
此溶解液即为检测液.4．取出试纸，开封后平放在桌面，用滴管向试纸孔缓慢而准确地逐滴加入3滴检测液。
5．10分钟判断结果，半小时后的结果判读无效。
（ps：鱼池或鱼缸中水样检测前，需将采取的水样PH调节到中性后，直接进行检测）【使用步骤】1.在进行测试前先完整阅读使用说明书，使用前将试剂板和待检样本溶液恢复至室温(20℃~30℃)。
孔雀石绿的测定
孔雀石绿的测定本实验主要目标是通过酶标仪测定水产品中的孔雀石绿以及其衍生物的含量1 试验试剂：乙腈，试剂A，试剂B，酶标记浓缩物，酶标记稀释液，孔雀石绿样品稀释液，孔雀石绿100ppb标准液，氧化铝，底物溶液，停止液，蒸馏水2 实验仪器分析天平，组织粉碎机，精密移液器，50ml离心管,均质振荡器，通风柜，离心机，10ml塑料蓝盖试管，2ml 带塞小试管，水浴锅，氮气机，微孔计数板，酶标仪3 实验步骤1 先将所有试验试剂从冰箱中拿出来，于25-28度室温中放置1到2个小时后待用2 样品处理：将所测水产品去头去尾，去皮去骨取可吃部位，称20克左右，放入组织粉碎机充分粉碎后待用3 样品前处理：用分析天平称取5克样品，准确到0.0001克，放至50ml试管内，在通风柜内打开通风柜后。
用精密移液器使用5ml 一次性塑料移液管移取共10ml的乙腈到样品试管，用均质振荡器震荡10分钟，使样品鱼肉和乙腈充分混合。
再通过离心机（4200转/分钟）离心5分钟，（注意：使用离心机的时候，需要再加多一个离心管装水10ml保持离心机平衡，以免损坏离心机）4 精确称取3克中性氧化铝，准确到0.0001克，加入离心好的样品试管，再用离心机进行离心5分钟5 离心后的样品溶液取上层清液2ml到新的10ml蓝盖试管中，打开氮气机，当水浴锅温度设置在68度，放入试管，用氮气将样液吹干为止6 试剂A配制用2ml的带塞小试管配制，先移0.5ml 的试剂A入带塞小试管，再加入1.5ml乙腈，比例为1:3配制7将配制好1:3的试剂A移0.5ml至吹干的样品试管中，用振荡器混合三秒，静置30分钟8 称0.1克的试剂B加入静置30分钟后的样品试管，再静置10分钟9 从加入试剂B静置10分钟后的样品试管中，移取50ul(微升)上清液到10ml 带塞试管后再加入0.95ml 样品稀释液10 酶标记物配制：先移2.9ml酶标记物至10ml带塞试管后再加入0.1ml酶标记浓缩物即可11 取5个10ml带塞分别用笔0.405,0.135,0.045,0.015,0.0 05数字(a) 配制0.405ppb溶液：3.69ml标准稀释液到试管后再移取15ul（微升）100ppb孔雀石绿标准溶液混合即可配制完成(b)配制0.135ppb溶液：先移1ml标准稀释液到10ml 试管，再加入配制好的0.405ml溶液0.5ml混合即可成为0.135ppb溶液(c) 配制0.015ml溶液：先移1ml标准溶液到10ml试管，再加入配制好的0.135 ml溶液0.5ml混合即可成为0.015 ppb溶液（d）配制0.005 ml溶液: 先移1ml标准溶液到10ml 试管，再加入配制好的0.015ml溶液0.5ml混合即可成为0.005 ppb溶液12 取出混合板后，按0.405,0.135,0.045,0.015,0.0 05数字从小到大顺序分别移120ul（微升）到混合孔，最后移取样品液共6个孔，再加入120ul（微升）酶标记物溶液混合，轻轻震荡10秒13 从铝箔袋中拿出新的两条微孔条（注意：铝箔袋装的微孔条应避光收藏），再从混合板中移取200ul（微升）到微孔条的测试孔中，25-28摄氏度避光孵育30分钟14 孵育后，将微孔条的测试孔中溶液倒到水槽中，再用多管移液器移蒸馏水到各个孔眼中，震荡后倒掉，重复三次，总共四次洗板后，再在吸水纸上拍打微孔条，尽量将水拍干15 拍干水后，在各个孔眼中加入100ul（微升）底物溶液，在5-28摄氏度避光孵育30分钟16 孵育好的测试孔加入100ul（微升）停止液即可进行读数17 酶标仪先提早预热半个小时，再把样板微孔条放入酶标仪测试平台，再按下PLATE键送至酶标仪机内，打开电脑点击酶标仪桌面图标—点击登录—点击新建文件夹---出现新建程序---点击光度测量---选择上次测定数据（6孔眼的为孔雀石绿测定，7孔目为兽药测定）---点击运行---出现数据---记录数据---复制至另外文件夹附：通风柜的遥控器操作，A开关机 B 通风C 调风D 开关灯。
孔雀石绿液相方法
孔雀石绿液相方法
孔雀石绿可是个挺特别的东西呢，在检测它的时候，液相方法可很重要哦。
咱先来说说啥是孔雀石绿吧。
这孔雀石绿啊，颜色可漂亮啦，就像孔雀羽毛那种翠绿翠绿的。
不过呢，它可不能随便出现在不该出现的地方，像在水产养殖里，要是违规使用了孔雀石绿，那可就糟糕啦。
那液相方法检测孔雀石绿是咋回事呢？液相色谱法就像是给孔雀石绿安排了一场特殊的赛跑比赛。
把含有孔雀石绿的样品准备好，就像让参赛选手站到起跑线上。
这个样品要经过一系列的前处理呢，比如说提取啦，净化啦，就好比给选手整理好着装，做好热身。
然后呢，把处理好的样品注入到液相色谱仪这个超级跑道里。
液相色谱仪里有流动相带着样品跑，就像跑道上有气流带着选手往前冲。
不同的物质在这个跑道里跑的速度不一样，孔雀石绿也有它自己独特的速度。
仪器就会根据它跑的时间啊，速度啊之类的来识别它。
在这个过程中，流动相的选择就很关键啦。
就好像选择合适的跑道环境一样。
流动相的成分、比例啥的都得精心调配。
要是没调好，孔雀石绿可能就跑乱了，就检测不准啦。
还有啊，液相色谱仪的柱子也很重要。
柱子就像是赛道上的特殊关卡，不同的柱子对孔雀石绿的分离效果不一样。
有的柱子就像很严格的裁判，能把孔雀石绿和其他类似的物质分得清清楚楚，有的柱子可能就没那么厉害啦。
检测孔雀石绿的液相方法，还得考虑检测的灵敏度呢。
毕竟有时候孔雀石绿的含量可能特别少，就像在一大群人中找一个穿特定衣服的人一样难。
所以仪器得足够灵敏，能把那一点点孔雀石绿都给找出来。
水溶性非食用色素(含孔雀石绿)的快速检测说明书
商品名称：水溶性非食用色素（含孔雀石绿）的快速检测规格：50批次/盒检测项目：水溶性的非食用色素：罗丹明B、孔雀石绿产品简介：本产品利用水溶性食用色素被试棉吸附后，可以漂洗干净；而非食用色素被试棉吸附后，不容易去除的原理，快速筛查是食用色素还是非食用色素使用方法产品前处理：1液体食品直接备用。
汽水、色酒等加热除去二氧化碳或酒精后备用。
2辣椒粉、茶叶等粉叶状食物，取约10克置于烧杯中，加30ml水，振摇使色素溶于水中备用。
3表面有颜色的豆腐皮、豆腐干、黄花鱼等，取10克以上的样品，加入适量能够淹没样品的100℃的纯净水，放置2分钟，观察样品表面的颜色是否溶入水中，有溶出时，基本上可以判断加入了色素，即使是食用色素也是法规所不允许的。
4辣椒油或带有颜色的油状食物，采用“油溶性非食用色素速测盒”进行检测。
5取处理后的样品液10ml于试管中，滴入A试剂调PH到8～9之间，加入B试棉少许，将试管放入90℃以上的水浴中1分钟，搅拌试棉后将其取出，用清水漂洗试棉，试棉上的颜色不退为非食用色素。
为便于判断，可取B试棉少许，用水浸湿后对比观察。
孔雀石绿的检测：取10ml蓝色或绿色可疑液体放入试管中，滴入A试剂调PH 到10～11之间，将试管放入90℃以上的水浴中5分钟后，如果蓝色或绿色退去变为无色，再滴入C试剂调PH到2～3之间，放至室温，5分钟后又变回原有颜色，可初步判断样品中含有孔雀石绿。
此时，可用A试剂回调PH到7～8之间（不要高于9），加入B试棉少许，将试管放入90℃以上的水浴中1分钟，搅拌试棉后将其取出，用清水漂洗试棉，试棉上的颜色不退可进一步判断样品中含有孔雀石绿，有条件时将样品送实验室进一步确证。
注意事项：1.A试剂为饱和碱液,温度低时可能会有结晶出现,如果不易滴出时,可用滴管从中吸取液体使用。
2.罗丹明B检出浓度1.0µg/ mL，孔雀石绿检出浓度10µg/mL。
3.试剂闭光常温保存，有效期为2年。
孔雀石绿的快速检测方法
水中孔雀石绿、结晶紫、隐色孔雀石绿、隐色结晶紫
快速检验方法
一、【检测原理】
水中的孔雀石绿、结晶紫及其代谢产物隐色孔雀石绿、隐色结晶紫经过孔雀石绿专用SPE小柱富集、衍生化后在小柱上形成有色环带，可初步判断水样中是否含有待检物质。
用洗脱剂洗脱，收集洗脱液，即可定性检测。
二、【检测范围】
水体
三、【技术指标】
检测下限：2.0μg/kg
四、【检验步骤】
1、取样：取待检水样约50mL，若样品杂质较多可先用滤纸过滤去除杂质。
2、过层析柱：将50mL注射器与层析柱串接，将1中水样加入注射器中。
从上口加压，加快流速，建议样本通过柱子的时间为10min左右。
3、观察结果：去掉注射器，加入2mL蒸馏水洗涤，用吸耳球从上口加压挤干，观察层析柱中吸附剂颜色变化，若吸附剂逐渐形成绿色环带，可初步判断样本中含有孔雀石绿；若吸附剂逐渐形成紫色环带，可初步判断样本中含有结晶紫。
4、检测孔雀石绿或结晶紫含量：取0.8mL洗脱液于富集有待检样品的层析柱中,用比色管收集洗脱液判断是否含有孔雀石绿或结晶紫。
5、隐色孔雀石绿及隐色结晶紫检验：用2mL蒸馏水洗涤4中洗脱后的层析柱挤干，取1瓶衍生化试剂全部加入层析柱中后再加入2mL蒸馏水，挤干后将4中的洗脱剂全部加入层析柱中挤干，用比色管接收洗脱液，再加入0.8mL 洗脱液挤干，合并洗脱液，加入0.5mL蒸馏水及0.5mL萃取剂，振荡混匀后静置观察下层，既可判断是否含有所检物质。
孔雀石绿实验报告
孔雀石绿实验报告引言孔雀石绿（malachite green）是一种有机合成染料，常用于染色、标记和医药领域。
然而，孔雀石绿对环境和生物体产生毒性影响，因此需要对其毒性进行深入研究。
本实验旨在通过对孔雀石绿在不同浓度下对水生生物的影响进行观察，以评估其毒性和安全使用范围。
实验方法实验材料1. 孔雀石绿溶液2. 水生生物（例如小型鱼类、水生昆虫等）3. 鱼缸4. 不同浓度的孔雀石绿水溶液（浓度分别为0ppm、1ppm、10ppm、100ppm）实验步骤1. 准备四个鱼缸，并将每个鱼缸注满相同量的水。
2. 在每个鱼缸中添加不同浓度的孔雀石绿水溶液，分别为0ppm、1ppm、10ppm、100ppm。
3. 将相同数量的水生生物放入每个鱼缸中。
4. 观察及记录水生生物在不同浓度孔雀石绿溶液中的行为及状况。
实验结果观察记录在观察实验中，我们记录了水生生物在不同浓度孔雀石绿溶液中的行为及状况。
孔雀石绿浓度（ppm）水生生物行为及状况0 水生生物正常活动，无异常1 水生生物活动稍微减缓，有时出现呼吸困难或异常行为10 水生生物活动明显减缓，有时停止进食，出现明显的异常行为100 水生生物活动明显减弱，大部分生物无法正常呼吸和进食，有生物死亡或濒临死亡的迹象结果分析根据实验结果，我们发现孔雀石绿的浓度与水生生物的行为及状况呈现一定的关联。
在低浓度孔雀石绿溶液中，水生生物仍然能够正常活动，没有明显异常。
然而，随着孔雀石绿浓度的增加，水生生物的活动明显受到抑制，出现了呼吸困难、异常行为甚至死亡的情况。
这表明孔雀石绿对水生生物具有一定的毒性。
由于孔雀石绿主要用于染色、标记和医药领域，这个实验结果提醒我们在使用孔雀石绿时需小心谨慎，确保其使用浓度在安全范围内。
结论在本实验中，我们观察了孔雀石绿在不同浓度下对水生生物的影响。
实验结果表明，孔雀石绿的毒性与浓度呈正相关关系，高浓度孔雀石绿会对水生生物产生明显的毒性效应，包括减缓活动、呼吸困难、异常行为乃至死亡。
实验水产品中孔雀石绿和结晶紫残留量的测定
实验十五、水产品中孔雀石绿和结晶紫残留量的测定标准依据：GB/T 19857—2005 水产品中孔雀石绿和结晶紫残留量的测定一、实验目的：学习水产品中孔雀石绿及其代谢物隐色孔雀石绿（Leucomalachite green）、结晶紫及其代谢物隐色结晶紫(Leucocrystal violet)残留量的高效液相色谱的测定方法。
二、实验原理：试样中的残留物用乙腈-乙酸盐缓冲混合液提取，乙腈再次提取后，液液分配到二氯甲烷层并浓缩，经酸性氧化铝柱净化后，高效液相色谱-PbO2柱后衍生测定，外标法定量。
三、实验试剂与仪器：（一）试剂(除另有规定外，试剂均为分析纯，水为重蒸馏水。
)乙腈：液相色谱纯。
二氯甲烷。
甲醇：液相色谱纯。
乙酸盐缓冲液：溶解4.95g 无水乙酸钠及0.95g对-甲苯磺酸于950mL水中,用冰乙酸调节溶液pH到4.5, 最后用水稀释到1L。
20%盐酸羟胺溶液。
1.0 mol/L对-甲苯磺酸：称取17.2g对-甲苯磺酸，并用水稀释至100mL 。
50 mmol/L乙酸铵缓冲溶液：称取3.85g无水乙酸铵溶解于1000mL水中，冰乙酸调pH到4.5。
二甘醇。
酸性氧化铝：80-120目。
二氧化铅。
硅藻土545：色谱层析级。
标准品：孔雀石绿（MG）、隐色孔雀石绿（LMG）、结晶紫（CV）、隐色结晶紫（LCV），纯度大于98%。
标准溶液：准确称取适量的孔雀石绿、隐色孔雀石绿、结晶紫、隐色结晶紫，用乙腈分别配制成100µg/mL的标准贮备液，再用乙腈稀释配制1µg/mL的标准溶液。
-18℃避光保存。
混合标准工作溶液：用乙腈稀释标准溶液（3.2.13），配制成每毫升含孔雀石绿、隐色孔雀石绿、结晶紫、隐色结晶紫均为20ng的混合标准溶液。
-18℃避光保存。
（二）仪器和设备1、高效液相色谱仪：配有紫外-可见光检测器。
2、匀浆机。
3、离心机：4 000 r/min。
4、固相萃取装置。
5、25% PbO2氧化柱：不锈钢预柱管(5cm(4mm i.d)，两端附2(m过滤板，抽真空下，填装含有25% PbO2的硅藻土，添加数滴甲醇压实，旋紧。
孔雀石绿物测定作业指导书
1．5．3 1ppb标样：40ul 100ppb储存液和4mL标样稀释液
1．5．4 0.5ppb标样：1mL 1ppb标样和1mL标样稀释液
1．5．5 0.1ppb标样：10ul 1ppb标样和1.8mL标样稀释液
1．8．7试剂变质的迹象：显色液若有任何颜色表明变质，应当弃之。0标准的吸光度值小于0.5时，表示试剂可能变质。
1．8．8该试剂盒最佳反应温度为25℃，温度过高或过低将导致检测吸光度值和灵敏度发生变化。
1．9储藏条件和保质期
1．9．1储藏条件：试剂盒于2-8℃保存，不要冷冻。
1．9．2保质期：该产品有效期为1年，生产日期见包装盒。
1．7结果判定
利用试剂盒专业分析软件进行计算，更便于大量样本的准确、快速分析。
1．8注意事项
1．8．1室温低于1℃或试剂及样本没有回到室温（1-25℃）会导致所有标准的OD值偏低。
1．8．2在洗板过程中如果出现板孔干燥的情况，则会伴随着出现标准曲线不成线性，重复性不好的现象。所以洗板拍干后应立即进行下一步操作。
1．6．8每孔加入酶标记物150µl，盖板膜盖板后置25℃环境中反应30min。将孔内液体甩干，用洗涤液充分洗，4-5遍（同上），用吸水纸拍干（拍干后未被清除的气泡可用干净的枪头刺破）。
1．6．9显色：每孔加入底物液150µl，轻轻振荡混匀，25℃环境中避光显色30min。
1．6．10测定：每孔加入终止液100µl，轻轻振荡混匀，设定酶标仪于450nm（在5min内读完数据），测定每孔OD值。
1．3样品处理
高效液相色谱法测定水产品中孔雀石绿及其代谢物的含量
分析检测高效液相色谱法测定水产品中孔雀石绿及其代谢物的含量黄昌兴（汕头市检验检测中心，广东汕头 515041）摘 要：建立了高效液相色谱-荧光法测定水产品中孔雀石绿和隐色孔雀石绿的方法。
样品经乙腈超声提取、硼氢化钾还原、离心、旋转蒸发及中性氧化铝柱净化后，经微孔滤膜过滤，滤液经液相色谱柱分离，荧光检测器检测，外标法定量。
结果表明，孔雀石绿和隐色孔雀石绿在1.0～20.0 μg·mL-1均具有很好的线性关系，相关系数≥0.999 8，检出限为0.5 μg·kg-1，定量限为1.5 μg·kg-1，加标回收率为88.1%～96.6%，RSD为0.9%～3.8%。
关键词：孔雀石绿；水产品；液相色谱；荧光法Determination of Malachite Green and Its Metabolitesin Aquatic Products by High Performance LiquidChromatographyHUANG Changxing(Shantou Inspection and Testing Center, Shantou 515041, China)Abstract: A method for the determination of malachite green and leucomalachite green in aquatic products by high performance liquid chromatography with fluorescence detection was established. After ultrasonic extraction with acetonitrile, reduction with potassium borohydride, centrifugation, rotary evaporation, purification with neutral aluminum oxide column, the sample is filtered by microporous membrane, and the filtrate is separated by liquid chromatography column, detected by fluorescence detector, and quantified by external standard method. The results showed that malachite green and leucomalachite green showed good linearity in the range of 1.0～20.0 μg·mL-1 with the correlation coefficients ≥0.999 8, the limits of detection of 0.5 μg·kg-1 and the limits of quantification of 1.5 μg·kg-1, and the recoveries of spiked standards ranged from 88.1% to 96.6% with the RSD of 0.9%～3.8%.Keywords: malachite green; aquatic products; liquid chromatography; fluorimetry孔雀石绿（Malachite Green，MG），别名孔雀绿、孔雀绿草酸盐、碱性绿、草酸孔雀石绿等，是人工合成的一种三苯甲烷类化学物，可杀真菌、细菌、寄生虫，因其对养殖水域中的水霉病、鳃霉病、小瓜虫病和寄生虫病等具有良好的疗效，被作为杀菌剂在水产养殖业广泛使用[1-2]。
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水产品中孔雀石绿和结晶紫残留量的测定高效液相色谱荧光检测法
的改进与实践心得
1范围
本标准规定了水产品中孔雀石绿及其代谢产物隐性孔雀石绿残留总量、结晶紫及其代谢产物隐性结晶紫残留量的高效液相色谱荧光测定方法。
2规范性引用文件
本文主要参考了GB20361-2006水产品中的孔雀石绿和结晶紫残留量的测定高效液相色谱荧光检测法以及Determination of Malachite Green and Leucomalachite Green in Salmon with In-Situ Oxidation and Liquid Chromatography with Visible Detedction并结合实践进行报告。
3原理
样品中残留的孔雀石绿或结晶紫用硼氢化钾还原为其相应的代谢产物隐性孔雀石绿或隐性结晶紫，乙腈-乙酸铵缓冲溶液混合提取，二氯甲烷溶液液萃取，固相萃取柱净化，反相色谱柱分离，荧光检测器检测，外标法定量。
4试剂
除另有规定外，所有的试剂均为分析纯，实验用水应为二级水。
4.1 乙腈：色谱纯。
4.2 二氯甲烷：色谱纯。
4.3 酸性氧化铝：分析纯，粒度0.071mm-0.150mm。
4.4 二甘醇。
4.5 硼氢化钾。
4.6 无水乙酸铵。
4.7 冰乙酸。
4.8 氨水。
4.10 硼氢化钾溶液（0.2mol/L）：称取0.27g硼氢化钾于烧杯中，加入25mL水溶解，现配现用。
4.11 20%盐酸羟胺溶液：溶解12.5盐酸羟胺在50ml水中。
4.12 对甲苯磺酸（0.05mol/L）：称取0.95g对甲苯磺酸，用水稀释至100mL容量瓶中。
4.13 乙酸铵缓冲溶液（0.1mol/L）：称取7.71g无水乙酸铵溶于1000mL水中，氨水调pH 到10.0。
4.14 乙酸铵缓冲溶液（0.125mol/L）：称取9.64g无水乙酸铵溶解于1000mL水中，用冰乙酸调pH到4.5。
4.15 酸性氧化铝固相萃取柱：500mg，3mL。
使用前用约9mL已经活化。
4.16 Varian PRS柱：500mg。
3mL。
使用前用约9mL乙腈活化。
4.17 标准品：孔雀石绿分子式未（C23H25N2）（C2HO4）2C2H2O4、结晶紫分子式为C25H29ClN3,纯度大于98%。
4.18 标准溶液：分别准确称取适量的隐形孔雀石绿、隐形结晶紫标准品约1.50mg，用乙腈稀释至250ml容量瓶，低温避光保存。
5仪器设备
5.1 高效液相色谱
5.2 匀浆机
5.3 离心机：4000r/min
5.4 漩涡震荡机
5.5 固相萃取装置
5.6 旋转蒸发仪
6样品制备
6.1取样
鱼去鳞、、去骨、去皮，沿背脊取肌肉部分；虾去头、壳、肠腺，取肌肉部分；蟹、甲鱼等取可食用部分、样品切为不大于0.5cm×0.5cm×0.5cm的小块后混合。
6.2提取
称取5g以上不超过5.5g的样品于50ml离心管内，加入10ml乙腈，先用小烧杯盛载乙腈清洗匀浆机刀头，约13000r/min 对试样进行匀浆提取直到把鱼样打碎，约30秒。
（若要进行加标测回收率，此时加入标准溶液200μl）加入5ml乙酸铵溶液（3.14），加入25μl对甲苯磺酸（4.12），1ml盐酸羟胺（4.11）再加入100μl的对甲苯磺酸（4.12）。
盖上盖子，漩涡震荡30s。
加入25ml乙腈，盖上盖子，振摇30s。
加入10g或以上的氧化铝，盖上盖子，振摇15s。
于4000r/min离心5min。
放置250ml分液漏斗，于其中加入50ml蒸馏水、2ml二甘醇。
把离心管的上清液倾倒于分液漏斗中。
向含有残余物的离心管加入25ml乙腈，盖上盖子，漩涡震荡30s，振摇30s，然后于4000r/min离心5min。
把离心管的上清液倾倒于含有第一次萃取液的分液漏斗中。
于分液漏斗中加入1ml硼氢化钾。
于分液漏斗中加入35ml二氯甲烷，盖上盖子，注意及时放气，往返震荡约10次，打开盖子，静置分层。
取下层溶液，收集于150ml茄形瓶中，需要定量时，最后几滴的下层有机溶液也要收集。
再往250ml的分液漏斗中加入25ml二氯甲烷，重复一次上述的萃取步骤。
静置后，继续收集下层溶液，于盛有第一次萃取液的茄形瓶中。
于50℃旋转蒸发，直到把茄形瓶中的溶液蒸至近干。
用2.5mL乙腈溶解茄形瓶中的残渣。
6.3净化
将PRS柱安装在固相萃取柱装置上，上端连接酸性氧化铝固相萃取柱，用乙腈活化，一般需要活化3次以上，转移提取液到柱上，再用乙腈洗茄形瓶2次，每次2.5mL，依次过柱，弃去酸性氧化铝住，吹PRS柱近干，再不抽真空的情况下，加入等体积混合的乙腈和乙酸铵溶液（4.13），收集洗脱液，再加入等体积混合的乙腈和乙酸铵溶液（4.14），再次收集洗脱液，收集洗脱液用玻璃瓶，乙腈定容至3mL，供液相色谱测定。
注意事项
标准溶液配置时，隐形孔雀石绿及隐形结晶紫分别称量 1.50mg，需准确记下质量。
标准样品（固体）称量完毕，需马上将其低温避光保存。
进行取样步骤时，应尽量把鱼肉反复剁碎。
取鱼样前先要将样品解冻。
每次称量样品，需要准确记录样品的质量。
匀浆操作注意尽量不要使匀浆机连续操作1分钟以上，因其发热，匀浆时间过长容易导致机
器的损坏。
若鱼肉确实没有打碎，也应停顿后再继续匀浆。
每次使用匀浆机前，需要拆卸刀头，先用自来水清洗，再用蒸馏水清洗。
处理鱼样前，先用小杯乙腈清洗刀头数十秒，此时匀浆机应处于工作状态。
每一次处理鱼样后，需要重复上述步骤。
如果需要加标，应在匀浆之后加标。
第一次使用移液管时，应先用自来水洗，在用蒸馏水洗，最后用待移取的溶液润洗3次，再贴好标签，每支移液管只取对应的一种溶液，不要混用，以后每次使用移液管时不必再进行清洗。
在提取步骤中，加入了2次对甲苯磺酸，其中使用量程为50μL的移液枪来吸取25μL的对甲苯磺酸，使用量程为200μL的移液枪来吸取100μL的对甲苯磺酸。
其中，加入25μl 的对甲苯磺酸，是根据FDA文献方法的要求，出于补偿酸性缓冲乙酸铵溶液的需要。
氧化铝可处理鱼肉中的脂肪等物质，应该根据鱼样的质量来决定氧化铝的用量，一般5g的鱼样需要大约10g的氧化铝，若鱼样较多或较多脂肪，应适当增加氧化铝的用量，否则实验会失败。
离心时，注意离心管的液体体积，尽量使其平衡。
使用分液漏斗前，一定要先验漏。
往分液漏斗倾倒溶液前，一定要将分液漏斗的活塞关闭。
加入了二氯甲烷，进行液液萃取时，应上戴橡胶手套，一定要注意及时放气，应在通风处放气，放气口不要对着人。
静置分层时，注意打开分液漏斗的盖子，务必确认活塞处于关闭状态。
分液萃取操作时，静置分层约5分钟，过快收集容易同时收集少量微粒的乙腈，使旋转蒸发操作更困难，大大增加旋蒸时间。
第一次使用旋转蒸发仪时，需要把所有部件拆除，逐一清洗干净。
以后不必再清洗。
每次旋蒸样品前，应先旋蒸大约15-20ml的乙腈至近干，然后再旋蒸萃取液。
旋蒸时需要及时加冰。
旋蒸时，先开自来水，打开真空泵，再打开旋蒸仪；关闭时，先关闭旋蒸仪，再关水泵，最后关自来水。
过柱操作时，加入乙腈溶解茄形瓶中的残液时，应充分摇晃，使其溶液后再转移至固相萃取柱上。
进行净化时，活化的次数可以适当增加，一般不能少于3次。
如果发现液体停止滴下，可以适当抽真空以提高速度（真空度低于0.2），若发现其开始滴下，应尽快停止抽真空泵。
但是收集洗出液时不能抽真空。
净化操作应注意先移除氧化铝柱，再抽干PRS柱，避免氧化铝柱中有杂质抽进PRS柱中，造成污染。
洗脱操作为先碱洗，再酸洗，洗脱液因收集于同一容器，容器避免使用塑料瓶。
收集的洗脱液若发现存在浑浊，可适当稀释后进行离心操作。
避免使用滤膜，因其易使未知物质混入洗脱液，导致污染。
白色的柱管和红色的小连接器每次使用后，用少量乙腈（或甲醇）浸泡超声30分钟，再用自来水加洗洁精，超声清洗30分钟，然后再蒸馏水超声清洗30分钟，待其风干后使用。
固相萃取装置上的白色板有许多小孔，每次使用后需要用需要针筒盛载乙腈清洗3次，每次使用前需要用针筒盛载乙腈清洗不少于5次。
注意确保固相萃取装置以及其各部分的干净，是实验成功的关键。
色谱上机测定及数据处理等操作参考GB/T 20361-2006。