分子生物学 基因功能研究1---基因打靶和转基因
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二、动物水平：转基因动物
第二节.外源基因导入受体细胞或生物体内
一、细胞水平：细胞的基因转染 (gene transfection)
如何建立基因转染的细胞模型？
Coding sequence
真核转染载体的必备元件：
-6-5-4-3-2-1+1+2+3+4
(gcc)gccRccAUGG----TAA
一般是嘌呤(A 或G)
Heterozygous transgenic mice
二、 转基因动物的应用
随机插入
一、基因功能的研究
1982年美国哈佛大学的一个科学家小组，将大 鼠的生长激素（rGH）基因与小鼠的金属硫蛋白（ MT）基因的启动子顺序连接，再引入质粒中。科学 家把这种重组的质粒直接注射入小鼠受精卵中，经 过充分发育后终于分娩出了21小鼠，其中有七只带 有融合基因，六只生长迅速，每只体重平均可达 44g，超过同窝无融合基因小鼠（平均体重29g） 的1.5倍，这就是闻名于世的“超级小鼠”。
ES cell (Embryonic stem cell)
为什么需要将打靶载体线性化？
二、基因敲除的基本流程*
•构建基因敲除载体 •将基因敲除载体导入ES细胞：重组置换＊
Homologous arms Neo HSV-Tk
Restriction enzyme
P
Targeting vector
ES cell 同源重组时可能遇到哪些问题，筛选标志在这个过程中发挥什么样的作用？
and gancyclovir
P53 gene
Other sites
P53 gene
HSV-Tk gene Neo gene
P53 gene is not replaced. Cells are resistant to neomycin
but sensitive to gancyclovir.
阴性筛选标记基因（HSV-Tk）的筛选原理
“人鼠” Produce humanize antibodies
如何理解基因剔除过程其实就是一个经过改造的基因敲入的过程？
小结：基因敲除的基本流程*
Gene knockout procedure
第二节.外源基因导入受体细胞或生物体内
一、细胞水平：细胞的基因转染 (gene transfection)
基本流程：
•转基因载体的构建 •将重组转基因导入受体细胞核内 •将转基因ES细胞移植胚泡中
一般认为，
•转基因是随机整合 到染色体上，因此， 转基因杂合子的几率 在10-20% 以下
•将嵌合胚泡、或转基因受精卵移植入假孕小鼠的子宫腔中
•鉴定并筛选转基因小鼠
转基因纯合子小鼠 的几率为1/4
Sister-brother Mate
外源基因随机插入到受体细胞的染色体DNA中， 从而获得携带目的基因并能稳定遗传的动物。
•转基因技术（Transgenic technology）* ： 产生转基因生物的技术。
二、 转基因小鼠模型的建立
基本流程*：
•转基因载体的构建
Enhancer
P
transgenic gene
NeoR
二、 转基因小鼠模型的建立
三、基因敲除的应用
(1) 基因敲除鼠是基因功能研究的活试管*
肿瘤基因
“ alive test tubes”.
Gene knockout mice is a powerful tool for studying gene function.
三、基因敲除的应用
(1) 基因敲除鼠是基因功能研究的活试管*
二、基因敲除的基本流程*
•构建基因敲除载体 •将基因敲除载体导入ES细胞，通过重组建立
杂合基因敲除的胚胎干细胞 •将杂合基因敲除的ES细胞发育成基因敲除的小鼠
???
a).基因敲除ES细胞注射入胚泡 b). 嵌合胚泡植入假孕小鼠子宫中 c). 嵌合体的杂交育种
a).基因敲除ES细胞注射入胚泡
Inject the gene knocked-out ES cells into a blastocyst.
Mating with normal mice→1/2 is heterozygous
Mating between offsprings with genotype of Neo(+/-)
Neo
（+/+）
（+/-）
（+/-）
（-/-）
Mating heterozygous offspring to produce homozygous gene knocked-out strain
•待敲除基因的同源臂序列 •阳性筛选标记基因 •阴性筛选标记基因
问题：如何构建打靶载体？
> 基因敲除载体的构建过程：
待敲除基因
P
Cloning vector
NeoR gene
Target gene P
Recombinant cloninLeabharlann Baidu vector
将待敲除基因切除大部分使其 失活，留下用于重组的同源臂
original inner cell mass
Mate→3 days
Inject
Provides normal blastocyst Normal Mouse embryo
Chimeric Blastocyst
b). 嵌合胚泡植入假孕小鼠子宫中
Implant into uterus of a pseudopregnant foster mother
Specific
第二节 转基因 一、定义 * 二、基本流程* 三、应用
Random
难点：HSV-TK基因: 阴性筛选标记基因
思考1： 如何鉴定发生了同源重组的基因敲除ES细胞？
Primer 1
Homologous arm
基本流程*：
•转基因载体的构建 •将重组转基因导入受体细胞核内
两种方法： 胚胎干细胞法 前核法
ES cells
pronuclei
Fertilized egg
二、 转基因小鼠模型的建立
基本流程：
•转基因载体的构建 •将重组转基因导入受体细胞核内 •将转基因ES细胞移植胚泡中
Blastocyst
二、 转基因小鼠模型的建立
•目的基因:起始密码和终止密码
Kozak sequence
•Kozak 序列：是核糖体识别序列
•+4G 和-6G 对于核糖体识别AUG 有显著的促进作用
•必要的顺式作用元件如启动子等 •筛选标记基因
二、 转基因小鼠模型的建立
•转基因动物 （Transgenic mouse ）* ： 指将外源基因导入胚胎干细胞或受精卵细胞中，
基本流程：
•转基因载体的构建 •将重组转基因导入受体细胞核内 •将转基因ES细胞移植胚泡中 •将嵌合胚泡、或转基因受精卵移植入假孕小鼠的子宫腔中
Psuedopregnant mouse
二、 转基因小鼠模型的建立
将目的基因通过转基因技术整合到小鼠的染色体中，从 而获得携带目的基因并能稳定遗传的转基因小鼠*
Genomic DNA/gene knocked out:
Homologous arm sequence Lost its original function
二、基因敲除的基本流程*
•构建基因敲除载体 Targeting vector
NeoR
P Targeting vector
打靶载体
基因敲除载体的特点：*
Transfection
Normal ES cells
Medium with G418 & Gancyclovir
Homologous recombinants
Positive-negative selection
G418 Neomycin (positive selection) kills the non-insertions; Gancyclovir (negative selection) kills the random insertions In survival cells, P53 gene is replaced by Neo, but only on 1 chr.
Two ways for Neo gene insertion
Homologous Recombination
Neo
HSV-Tk
P53 gene
in ES cells
Random Insertion
P53 gene
10-5-10-6
Neo gene P53 gene is replaced by Neo gene. Cells are resistant to both neomycin
分子生物学
基因功能的鉴定技术
Strategies for analyzing gene function
对题目的解析：
•基因的功能 基本思路：
GDeNnAe mRRNNAA
•利用生物信息学数据库预测的基因功能
•在DNA水平的技术 — 使相应基因缺失而失活: 基因敲除 — 细胞或动物获得新基因、或 额外拷贝的基因：转基因技术
Protein
•在mRNA水平的技术：封闭或降解mRNA —反义RNA， RNAi
基因功能的研究是21世纪生命科学研究的重点之一，这对于我们深 入理解疾病的发生机理、探索新的治疗途径非常重要！
第一节 使体内原有基因缺失的技术: 基因敲除 (gene knock-out)
美国犹他大学Eccles 人类遗传学研究所 马里奥·卡佩奇 Mario R. Capecchi
二、 As animal models ： HBV transgenic mice
三、转基因的“动物药厂” blood clotting factor IX transgenic
sheep: To produce the protein
四、改良动物（植物）品种？
【重点内容】
第一节 基因敲除 一、定义 * 二、基本流程* 三、应用
P
Recombinant cloning vector
HSV-Tk gene
P
在同源臂的外侧 P
线性化载体
P
Targeting vector
打靶载体
二、基因敲除的基本流程*
•构建基因敲除载体 •将基因敲除载体导入ES细胞：重组置换＊
Brown mouse
基因敲除载体
小鼠受精卵发育第4～5天的胚泡细胞； 能在体外培养，具有发育的全能性。
细胞的培养基含单核苷酸类似物 (gancyclovir)
单核苷酸 类似物是 无毒的
但如果细胞中如果有HSV-TK 基
因的表达，即存在TK (thymidine kinase)，单核苷酸类似物将被其 磷酸化成有毒的产物…
细胞生长良好 细胞死亡
阴性筛选目的：
用打靶载体转染ES细胞时，我们只需要同源部分重组入 ES cell的genome，而Tk基因等载体的其它部分是不可以 进入ES cell的genome(by随机重组)。用单核苷酸类似物筛 选转染后的细胞，存活的细胞基本上不含载体的其它序列
设想：
•各种基因缺陷小鼠将成为研究基因功能、解释人类疾病的模型。
三、基因敲除的应用
(1) 基因敲除鼠是基因功能研究的活试管* (2) 获得疾病的动物模型* (3) 基因敲入技术----生物制药
人Ig基因敲入
Mouse Ig genes were knocked out Human Ig genes were knocked in
英国卡迪夫大学卡迪夫生命科学学院
马丁·埃文斯 Martin J. Evans
美国北卡罗来纳州大学教会山分校医学院 奥利弗·史密斯 Oliver Smithies
一、基因敲除的定义 *
•利用DNA同源重组的原理，在活体内将特定基因从染色体 上剔除的过程。
Genomic DNA: Targeting DNA fragment:
事实上，目前至少500种基因已经获得了基因敲除小鼠！
基因敲除小鼠工程
2006年，
•美国NIH推出knockout Mouse Project (KOMP) •将系统敲除或破坏小鼠的2万个基因 •计划投入5200万美元建立小鼠基因组突变基因数据库 •此计划与加拿大North American Conditional Mouse Mutagenesis Project (NorCOMM)及European Conditional Mouse Mutagenesis Program (EUCOMM)合作，以避免重复工作
Psuedopregnant black mouse
Neo (+/-)
Test offspring for presence of gene by PCR
c). 嵌合体的杂交育种
Neo
(生殖细胞+/-)
所有细胞Neo
（+/-）
（-/-） （-/-）
如果某些嵌合体小鼠的生 殖细胞恰巧是由基因敲除 的ES细胞发育成的，
第二节.外源基因导入受体细胞或生物体内
一、细胞水平：细胞的基因转染 (gene transfection)
如何建立基因转染的细胞模型？
Coding sequence
真核转染载体的必备元件：
-6-5-4-3-2-1+1+2+3+4
(gcc)gccRccAUGG----TAA
一般是嘌呤(A 或G)
Heterozygous transgenic mice
二、 转基因动物的应用
随机插入
一、基因功能的研究
1982年美国哈佛大学的一个科学家小组，将大 鼠的生长激素（rGH）基因与小鼠的金属硫蛋白（ MT）基因的启动子顺序连接，再引入质粒中。科学 家把这种重组的质粒直接注射入小鼠受精卵中，经 过充分发育后终于分娩出了21小鼠，其中有七只带 有融合基因，六只生长迅速，每只体重平均可达 44g，超过同窝无融合基因小鼠（平均体重29g） 的1.5倍，这就是闻名于世的“超级小鼠”。
ES cell (Embryonic stem cell)
为什么需要将打靶载体线性化？
二、基因敲除的基本流程*
•构建基因敲除载体 •将基因敲除载体导入ES细胞：重组置换＊
Homologous arms Neo HSV-Tk
Restriction enzyme
P
Targeting vector
ES cell 同源重组时可能遇到哪些问题，筛选标志在这个过程中发挥什么样的作用？
and gancyclovir
P53 gene
Other sites
P53 gene
HSV-Tk gene Neo gene
P53 gene is not replaced. Cells are resistant to neomycin
but sensitive to gancyclovir.
阴性筛选标记基因（HSV-Tk）的筛选原理
“人鼠” Produce humanize antibodies
如何理解基因剔除过程其实就是一个经过改造的基因敲入的过程？
小结：基因敲除的基本流程*
Gene knockout procedure
第二节.外源基因导入受体细胞或生物体内
一、细胞水平：细胞的基因转染 (gene transfection)
基本流程：
•转基因载体的构建 •将重组转基因导入受体细胞核内 •将转基因ES细胞移植胚泡中
一般认为，
•转基因是随机整合 到染色体上，因此， 转基因杂合子的几率 在10-20% 以下
•将嵌合胚泡、或转基因受精卵移植入假孕小鼠的子宫腔中
•鉴定并筛选转基因小鼠
转基因纯合子小鼠 的几率为1/4
Sister-brother Mate
外源基因随机插入到受体细胞的染色体DNA中， 从而获得携带目的基因并能稳定遗传的动物。
•转基因技术（Transgenic technology）* ： 产生转基因生物的技术。
二、 转基因小鼠模型的建立
基本流程*：
•转基因载体的构建
Enhancer
P
transgenic gene
NeoR
二、 转基因小鼠模型的建立
三、基因敲除的应用
(1) 基因敲除鼠是基因功能研究的活试管*
肿瘤基因
“ alive test tubes”.
Gene knockout mice is a powerful tool for studying gene function.
三、基因敲除的应用
(1) 基因敲除鼠是基因功能研究的活试管*
二、基因敲除的基本流程*
•构建基因敲除载体 •将基因敲除载体导入ES细胞，通过重组建立
杂合基因敲除的胚胎干细胞 •将杂合基因敲除的ES细胞发育成基因敲除的小鼠
???
a).基因敲除ES细胞注射入胚泡 b). 嵌合胚泡植入假孕小鼠子宫中 c). 嵌合体的杂交育种
a).基因敲除ES细胞注射入胚泡
Inject the gene knocked-out ES cells into a blastocyst.
Mating with normal mice→1/2 is heterozygous
Mating between offsprings with genotype of Neo(+/-)
Neo
（+/+）
（+/-）
（+/-）
（-/-）
Mating heterozygous offspring to produce homozygous gene knocked-out strain
•待敲除基因的同源臂序列 •阳性筛选标记基因 •阴性筛选标记基因
问题：如何构建打靶载体？
> 基因敲除载体的构建过程：
待敲除基因
P
Cloning vector
NeoR gene
Target gene P
Recombinant cloninLeabharlann Baidu vector
将待敲除基因切除大部分使其 失活，留下用于重组的同源臂
original inner cell mass
Mate→3 days
Inject
Provides normal blastocyst Normal Mouse embryo
Chimeric Blastocyst
b). 嵌合胚泡植入假孕小鼠子宫中
Implant into uterus of a pseudopregnant foster mother
Specific
第二节 转基因 一、定义 * 二、基本流程* 三、应用
Random
难点：HSV-TK基因: 阴性筛选标记基因
思考1： 如何鉴定发生了同源重组的基因敲除ES细胞？
Primer 1
Homologous arm
基本流程*：
•转基因载体的构建 •将重组转基因导入受体细胞核内
两种方法： 胚胎干细胞法 前核法
ES cells
pronuclei
Fertilized egg
二、 转基因小鼠模型的建立
基本流程：
•转基因载体的构建 •将重组转基因导入受体细胞核内 •将转基因ES细胞移植胚泡中
Blastocyst
二、 转基因小鼠模型的建立
•目的基因:起始密码和终止密码
Kozak sequence
•Kozak 序列：是核糖体识别序列
•+4G 和-6G 对于核糖体识别AUG 有显著的促进作用
•必要的顺式作用元件如启动子等 •筛选标记基因
二、 转基因小鼠模型的建立
•转基因动物 （Transgenic mouse ）* ： 指将外源基因导入胚胎干细胞或受精卵细胞中，
基本流程：
•转基因载体的构建 •将重组转基因导入受体细胞核内 •将转基因ES细胞移植胚泡中 •将嵌合胚泡、或转基因受精卵移植入假孕小鼠的子宫腔中
Psuedopregnant mouse
二、 转基因小鼠模型的建立
将目的基因通过转基因技术整合到小鼠的染色体中，从 而获得携带目的基因并能稳定遗传的转基因小鼠*
Genomic DNA/gene knocked out:
Homologous arm sequence Lost its original function
二、基因敲除的基本流程*
•构建基因敲除载体 Targeting vector
NeoR
P Targeting vector
打靶载体
基因敲除载体的特点：*
Transfection
Normal ES cells
Medium with G418 & Gancyclovir
Homologous recombinants
Positive-negative selection
G418 Neomycin (positive selection) kills the non-insertions; Gancyclovir (negative selection) kills the random insertions In survival cells, P53 gene is replaced by Neo, but only on 1 chr.
Two ways for Neo gene insertion
Homologous Recombination
Neo
HSV-Tk
P53 gene
in ES cells
Random Insertion
P53 gene
10-5-10-6
Neo gene P53 gene is replaced by Neo gene. Cells are resistant to both neomycin
分子生物学
基因功能的鉴定技术
Strategies for analyzing gene function
对题目的解析：
•基因的功能 基本思路：
GDeNnAe mRRNNAA
•利用生物信息学数据库预测的基因功能
•在DNA水平的技术 — 使相应基因缺失而失活: 基因敲除 — 细胞或动物获得新基因、或 额外拷贝的基因：转基因技术
Protein
•在mRNA水平的技术：封闭或降解mRNA —反义RNA， RNAi
基因功能的研究是21世纪生命科学研究的重点之一，这对于我们深 入理解疾病的发生机理、探索新的治疗途径非常重要！
第一节 使体内原有基因缺失的技术: 基因敲除 (gene knock-out)
美国犹他大学Eccles 人类遗传学研究所 马里奥·卡佩奇 Mario R. Capecchi
二、 As animal models ： HBV transgenic mice
三、转基因的“动物药厂” blood clotting factor IX transgenic
sheep: To produce the protein
四、改良动物（植物）品种？
【重点内容】
第一节 基因敲除 一、定义 * 二、基本流程* 三、应用
P
Recombinant cloning vector
HSV-Tk gene
P
在同源臂的外侧 P
线性化载体
P
Targeting vector
打靶载体
二、基因敲除的基本流程*
•构建基因敲除载体 •将基因敲除载体导入ES细胞：重组置换＊
Brown mouse
基因敲除载体
小鼠受精卵发育第4～5天的胚泡细胞； 能在体外培养，具有发育的全能性。
细胞的培养基含单核苷酸类似物 (gancyclovir)
单核苷酸 类似物是 无毒的
但如果细胞中如果有HSV-TK 基
因的表达，即存在TK (thymidine kinase)，单核苷酸类似物将被其 磷酸化成有毒的产物…
细胞生长良好 细胞死亡
阴性筛选目的：
用打靶载体转染ES细胞时，我们只需要同源部分重组入 ES cell的genome，而Tk基因等载体的其它部分是不可以 进入ES cell的genome(by随机重组)。用单核苷酸类似物筛 选转染后的细胞，存活的细胞基本上不含载体的其它序列
设想：
•各种基因缺陷小鼠将成为研究基因功能、解释人类疾病的模型。
三、基因敲除的应用
(1) 基因敲除鼠是基因功能研究的活试管* (2) 获得疾病的动物模型* (3) 基因敲入技术----生物制药
人Ig基因敲入
Mouse Ig genes were knocked out Human Ig genes were knocked in
英国卡迪夫大学卡迪夫生命科学学院
马丁·埃文斯 Martin J. Evans
美国北卡罗来纳州大学教会山分校医学院 奥利弗·史密斯 Oliver Smithies
一、基因敲除的定义 *
•利用DNA同源重组的原理，在活体内将特定基因从染色体 上剔除的过程。
Genomic DNA: Targeting DNA fragment:
事实上，目前至少500种基因已经获得了基因敲除小鼠！
基因敲除小鼠工程
2006年，
•美国NIH推出knockout Mouse Project (KOMP) •将系统敲除或破坏小鼠的2万个基因 •计划投入5200万美元建立小鼠基因组突变基因数据库 •此计划与加拿大North American Conditional Mouse Mutagenesis Project (NorCOMM)及European Conditional Mouse Mutagenesis Program (EUCOMM)合作，以避免重复工作
Psuedopregnant black mouse
Neo (+/-)
Test offspring for presence of gene by PCR
c). 嵌合体的杂交育种
Neo
(生殖细胞+/-)
所有细胞Neo
（+/-）
（-/-） （-/-）
如果某些嵌合体小鼠的生 殖细胞恰巧是由基因敲除 的ES细胞发育成的，