基因表达沉默技术

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发现历史
antisense
1995年． ． ． ． ． ．
sense
注射
注射
秀丽线虫
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． ． ． ． ． ． 1998年
反义RNA(antisense RNA)对基因抑制效应比较微弱； 而双链RNA（dsRNA）能够高效特异性阻断靶基因的 表达。
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2006 Nobel Prize in Physiology or Medicine
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基本概念
掌握
➢RNA 干 扰 (RNA interference, RNAi): 由 小双链RNA诱发的、同源mRNA高效特异性降 解的现象。
➢小干扰RNA: 具有干扰功能的这种短双链RNA
就 称 为 小 干 扰 RNA （ Small interfering
RNA,siRNA)。 基因表达沉默技术
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1）靶序列的调出
National Center for Biotechnology Information
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2）利用免费设计软件进行siRNA设计 Invitrogen Takara Oligoegine
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靶
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siRNA 在 ATP 参 与 下 形
成RISC复合体，被RNA
解旋酶解旋成单链，并
由其中的反义链指导移
至 靶 mRNA ， 靶 mRNA
被切割后诱发宿主细胞
针 对 这 些 mRNA 的 降 解
反应。
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siRNsAiR实N验A 设计
难点
19 bp duplex
21 nt
2 nt 3’ overhangs
mRNA 反义 核酸
RNase H
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反义核酸应用
论著超过１６０００篇。 •基因功能研究（ 1994年流行） •如抗病毒或抗肿瘤基因治疗研究等领域。
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1998年8月27日，美国食品药品管理局（FDA）正 式批准了由ISIS公司开发的全球第一个反义药物 “Vitravene” （福米韦生，fomivirsen）在美国 上市。 该药抗病毒作用较强，是更昔洛韦的1000倍，用 于治疗巨细胞病毒性视网膜炎和艾滋病人并发巨 细胞视网膜炎,有效率高达80%-90%。 Vitravene为注射剂，患者每月只需注射一次药物 （利用专用针头直接注射进眼球内），不良反应 有虹膜炎、玻璃体炎，发生率为25％，用糖皮质 激素治疗可缓解或消除其炎性反应。
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3 mg/ml 正向引物 1 μl 3 mg/ml 反向引物 1 μl
90°C 4 min
70°C 10 min
室温
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4) siRNA working?
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mRNA:Real-time PCR Protein: Western blot
17siRNA Mock
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我用的软件：siDirect
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3）siRNA合成或表达
RNA聚合酶Ⅲ启动子（包括U6或H1）： 转录起始点明确； 转录生成小RNA； 转录产物无polyA尾； 转录终止为5个连续的U。
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6）体外导入细胞
a.脂质体转染：
＋＋ －－－－
＋
＋进行
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b.电穿孔导入：
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c.病毒感染（以腺病毒为例）：
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第二节 反义核酸技术
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历史由来
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5)合成or构建载体？
A. 化学合成siRNA： 瞬时转染 实验花费高 使用的时候，要用二乙基焦碳酸酯（DEPC）处理过的灭 菌蒸馏水溶解，这是因为siRNA易被RNA酶降解。
B.载体：为了长期观察基因沉默后的影响，需要长期表达 siRNA。
C. 载体选择：易转染的细胞用质粒载体，难转染的细胞 用逆转录载体或慢病毒载体。
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软件的选择原则
1、选择可读框内、翻译起始位点之后50～100nt
的序列作为靶序列；
2、选择的靶位5’端之前的两个碱基为AA；
3、GC含量控制在35%～65%,最好50%左右；
4、碱基数目控制在19～21nt；
5、避免连续3个或3个以上的相同碱基；
6、避免重复序列或回文结构以免形成发夹状结构；
7、靶序列同数据库进行BLAST同源性比对。
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基本概念
• 反义寡核苷酸概念：正义链互补的一段核苷酸序 列，包括反义DNA和反义RNA。
反义DNA 技术
反义RNA 技术
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反义抑制的主要机理
直接作用于靶mRNA的SD序列或部分编码区，直 接抑制翻译，或与靶mRNA结合形成双链RNA， 从而易被RNA酶H降解。
➢1978年，Stephenson 和Zamecnik首次报道了 反义寡脱氧核苷酸可抑制劳斯肉瘤病毒RSV的 复制现象。
➢1984 年，Izant weintraub提出了“反义核
酸技术”的概念。
Inhibition of Rous sarcoma viralRNA translation by a specific oligodeoxyribonucleotide. Proc Natl Acad Sci USA , 1978 ;75 : 285 - 288.
Andrew Z. Fire Craig C. Mello
安德鲁·菲尔基因表达沉默技术克雷格·梅洛
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RNAi现象的普遍性
随后陆续发现RNAi也存在于水稻、烟草、果 蝇、小鼠及人等几乎所有的真核生物中。
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RNAi 机制
重点
外 源 长 dsRNA 在 ATP 作 用下被RNaseⅢ Dicer切 割 成 21nt 左 右 、 由正 义 和反义链组成的siRNA
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2010.06.18
基因表达沉默技术
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教学内容及要求
1 RNA干扰 技术
重点
2 反义核酸技术
3 核酶技术
4 基因敲除技术
熟悉
基因表达沉默技术
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参考资料
《基因工程及其分子生物学基础-基因 工程分册》，北京大学出版社，静国 忠编
自备材料（个人实践经验）
基因表达沉默技术
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第一节 RNA干扰技术