紫外-可见分光光度计操作规程

紫外-可见分光光度计操作规程

(TU1810)

1．目得：制订本标准得目得就是为规范检验人员在质量检验过程中得操作，保证检验结果得正确性。

2．适用范围：本标准适用于二厂检验员对产品质量得检验。

3．职责：QC检验员对本标准得实施负责。

4．程序：

4、1简述

紫外-可见分光光度法就是利用物质分子对紫外可见光谱区得辐射得吸收来进行分析得一种仪器分析方法。这种分子吸收光谱产生于价电子与分子轨道上得电子在电子能级间得跃迁，它广泛用于无机与有机物质得定性与定量分析。

朗伯—比耳定律（Lambert—Beer）就是光吸收得基本定律，俗称光吸收定律，就是分光光度法定量分析得依据与基础。当入射光波长一定时，溶液得吸光度就是吸光物质得浓度及吸收介质厚度（吸收光程）得函数。其常用表达式为，式中为系数：

A=ε·ι·C

式中A为吸光度；

ε为吸收系数；

C为溶液浓度；

ι为光路长度。

如溶液得浓度（C）为1%（g/ml），光路长度（L）为1cm，相应得吸光度即为吸收系数以E cm%11表示。如溶液得浓度（C）得摩尔浓度（mol/L），光路长度为1cm时，则相应有吸收系数为摩尔吸收系数，以ε表示。

4、2 仪器

紫外可见分光光度计就是基于紫外可见分光光度法得原理工作得常规分析仪器。根据光路设计得不同，紫外可见分光光度计可以分为单光束分光光度计、双光束分光光度计与双波长分光光度计。

4、2、1 仪器测量条件选择

1、测量波长得选择

通常都就是选择最强吸收带得最大吸收波长λmax作为测量波长，称为最大吸收原则，以获得最高得分析灵敏度。而且在λmax附近，吸光度随波长得变化一般较小，

波长得稍许偏移引起吸光度得测量偏差较小，可得到较好得测定精密度。但在测量高浓度组分时，宁可选用灵敏度低一些得吸收峰波长（ε较小）作为测量波长，以保证校正曲线有足够得线性范围。如果λmax所处吸收峰太尖锐，则在满足分析灵敏度前提下，可选用灵敏度低一些得波长进行测量，以减少比耳定律得偏差。

2、适宜吸光度范围得选择

任何光度计都有一定得测量误差，这就是由于测量过程中光源得不稳定、读数得不准确或实验条件得偶然变动等因素造成得。由于吸收定律中透射比T与浓度C就是负对数得关系，从负对数得关系曲线可以瞧出，相同得透射比读数误差在不同得浓度范围中，所引起得浓度相对误差不同，当浓度较大或浓度较小时，相对误差都比较大。因此，要选择适宜得吸光度范围进行测量，以降低测定结果得相对误差。

在实际工作中，可通过调节待测溶液得浓度或选用适当厚度得吸收池得方法，使测得得吸光度落在所要求得范围内。

3、仪器狭缝宽度得选择

狭缝得宽度会直接影响到测定得灵敏度与校准曲线得线性范围。狭缝宽度过大时，入射光得单色光降低，校准曲线偏离比耳定律，灵敏度降低；狭缝宽度过窄时，光强变弱，势必要提高仪器得增益，随之而来得就是仪器噪声增大，于测量不利。选择狭缝宽度得方法就是：测量吸光度随狭缝宽度得变化。狭缝得宽度在一个范围内，吸光度就是不变得，当狭缝宽度大到某一程度时，吸光度开始减小。因此，在不减小吸光度时得最大狭缝宽度，即就是所欲选取得合适得狭缝宽度。

4、3 紫外-可见分光光度计得检定

4、3、1 波长示值误差与重复性

仪器波长示值误差指标为±0、3nm，波长重复性指标为0、2nm，您可以用仪器氘灯得两条特征谱线检验，具体检验方法如下：

①确认仪器光谱宽带为“2、0nm”。开机初始化完成后，按数字5键进入系统应用界面，在系统应用界面中按数字键2强狭缝设定为“2、0nm”。

②在系统应用界面按RETURN键返回仪器主界面，按2键选择光谱测量功能。

③按F1键选择参数设定功能，按相应数字键设定采样间隔为0、2nm、扫描速度为中速、波长范围为660nm~480nm、纵坐标范围0-100、测光方式Es、光源选择氘灯

④按RETURN键返回光谱扫描界面。

⑤按START/STOP键并输入增益值为6，按ENTER键确认，开始扫描。

⑥扫描结束后，按F2键并输入阈值（1~100）后，按ENTER键进行峰值检出（如

果检出峰波长为0、000nm，则需要按键返回，然后重新按F2键输入比前次输入小得数值作为阈值，重新进行峰值检出）

⑦按F4键打印输出

重复扫描三次，并做峰值检出，氘灯得两个峰标准值为656、1nm与486、0nm。4、3、2基线平直度

样品池中不放任何遮挡物，以空气为空白进行测量，用波长扫描功能测量全波段得吸光度值，其具体测量方法如下

①首先确认仪器光谱宽带为2、0nm

②在仪器主界面俺2键选择光谱测量模式

③按F1键进入参数设置界面，按相应得数字键设置测光方式Abs、采样间隔为1nm、扫描速度为中速、波长范围为1100~190nm、纵坐标范围为-0、01Abs~、0、01Abs

④按RETURN键，返回光谱测量主界面，按AUTOZERO键进行基线校正。

⑤按START/STOP键进行扫描

⑥按F4键打印输出。

读取曲线得吸光度值，在1090nm~200nm波长，测量扫描图谱中起始点与最大偏移之差即为仪器得基线平直度。

分光光度法允差范围

测定透光率，应符合下表中规定。

4、4、1 计算分光光度法

按《中国药典》规定，计算分光光度法一般不宜用于含量测定，对于少数采用计算分光光度法得品种，应严格按各品种项下规定得方法进行。用本法时应注意：有一些吸光度就是在待测成分吸收曲线得上升或下降陡坡处测定，影响精度得因素较多，故应仔细操作，尽量使供试品与对照品得测定条件一致。若该品种不用对照品，如维生素A测定，则应在测定前对仪器作仔细得校正与检定。