天津大学,生物化学,课件,ppt 第十二章(4-5节)-1.

（一）DNA体外重组中常用的酶5
8．细菌碱性磷酯酶：十分耐热，可将DNA或 RNA的5’-P除去，反应常在600C以上进行，以 抑制反应中其他内切酶。 9．核酸酶S1：催化单链DNA降解，产生5’-P 结尾的单核苷酸或寡核苷酸，用以切除双链 cDNA上的发夹形结构上的单链凸环。 10．脱氧核糖核酸酶I：是一种内切酶，降 解双链或单链DNA，产生以5’-P结尾的单核苷 酸及寡核苷酸的混合物。 11．polyA聚合酶：催化将AMP加到RNA的3’OH末端，形成3’-polyA的反应。
一、DNA指导下的RNA合成－转录2
（一）大肠杆菌RNA聚合酶
（二）RNA聚合酶催化的转录过程 （三）RNA的转录后加工
（一）大肠杆菌RNA聚合酶1
α β
β’
+
δ
α 核心酶
（一）大肠杆菌RNA聚合酶1
DNA指导下的RNA合成
OH
U
A P- P- P OH C P T P C P C P G P A
*
*
流感嗜血菌
EcoRII
5’-N-C-C-N-G-G-N-3 ’ 3’-N-G-G-N-C-C-N-5’
*
*
大肠杆菌
EcoRIII
5’-A-A-G-C-T-T-3 ’ 3’-T-T-C-G-A-A-5’
*
*
流感嗜血菌
（一）DNA体外重组中常用的酶2
1.限制性内切酶3
（一）DNA体外重组中常用的酶3
延长阶段1
恢复的DNA 双螺旋
5’ mRNA
在DNA的一条链上，通过碱基配对 合成RNA链，解链区沿DNA移动
3．延伸2
延长阶段2
解链区到达基因终端
4．终止1
终止阶段1
RNA和RNA聚合酶从DNA上脱落
4．终止2
终止阶段2：原核生物转录中止信号及产物
反义链
有义链 反义链 有义链 A G C C C G C AGCCCGC TCGGGCG GCGGGCT TTTTTTTT CGCCCGA AAAAAAAA DNA TTTTTTTT AAAAAAAA U C G G RNA产物 G C G DNA
二、RNA指导下的RNA合成－RNA复制
病毒正链为模板
pppG 5’
复制酶
3 ’ OHLeabharlann 病毒正链（具mRNA功能）
p
5’
3 ’ OH
复制中间体
5’ p
5’ 3’
3’ 5’
新合成的负链
三、依靠反转录的DNA生物合成1
1970年Temin和Baltimore同时分别从致癌RNA
病毒中发现RNA指导的DNA聚合酶。由于它催化 遗传信息从RNA流向DNA，与转录作用正好相反 ，故称为反转录酶或逆转录酶。
2．定向地改造生物基因组结构，使其具有
的某些有经济价值的功能得以成百倍地提高。
3．将DNA重组技术应用于基础研究。如在基
因组结构及基因组功能调节的研究。
二、重组中的酶及载体
（一）DNA体外重组中常用的酶 （二）载体
（一）DNA体外重组中常用的酶1
1．限制性内切酶 2．T4DNA连接酶 3．大肠杆菌 DNA聚合酶I 4．大肠杆菌DNA聚合酶大片段（klenow片段） 5．T4DNA聚合酶 6．T4多核苷酸激酶 7．反转录酶 8．细菌碱性磷酯酶 9．核酸酶S1 10．脱氧核糖核酸酶I 11．polyA聚合酶
（三）RNA的转录后加工
1．原核生物RNA的转录后加工
2．真核细胞RNA的转录后加工
1．原核生物RNA转录后加工1（mRNA）
原核生物的mRNA大多不需加工，一经转 录即可直接进行翻译。
1．原核生物RNA转录后加工2（rRNA1）
大肠杆菌共有7个rRNA的转录单位，它 们分散在基因组的各处。
1．原核细胞RNA转录后加工2（rRNA2）
1872个核苷酸
2．真核生物RNA转录后加工9（mRNA4）
2．真核生物RNA转录后加工10
（帽子结构形成过程）
pppN1N2N3…
RNA三磷酸酶 mRNA鸟苷酸 转移酶 Pi GTP Pii S-腺苷甲硫氨酸 S-腺苷高半胱氨酸 S-腺苷甲硫氨酸 S-腺苷高半胱氨酸 S-腺苷甲硫氨酸 S-腺苷高半胱氨酸
细菌rRNA的形成
P16S
P23S
P5S
16S
23S
5S
1．原核生物RNA转录后加工3（tRNA1）
大肠杆菌染色体基因组共有tRNA基 因约60个，这个数字远大于按变偶假说 所要求的反密码子数。即：某些反密码 子可能不只一个tRNA分子，或某些tRNA 基因不是一个拷贝。tRNA基因大多成簇 存在。tRNA转录时首先成为tRNA前体。
UUUUUU
5’
5．原核生物的转录过程
（三）RNA的转录后加工
在细胞内，由RNA聚合酶合成的原初 转录物往往需要经过一系列的变化，包 括链的裂解、5’端与3’端的切除和特殊结 构的形成，碱基修饰和糖苷键的改变， 以及拼接等过程。使其能转变为成熟的 RNA分子，此过程总称为RNA的成熟或转 录后加工。
卵清蛋白基因(7700个核苷酸) L 1 2 3 4 5 6 7 A B C D E F G
5’
L
1 2 3 4 A B C D E 1 2 3 4 A B C D E 12345 6
转录
5
6
7
F
5 6
G
7
3’
3’
PolyA尾
加帽子和尾巴
5’
CAP
L
F
7
G
内含子RNA的除去
L
和拼接作用
成熟的mRNA
3’
P G
P
P
5’
P
（二）RNA聚合酶催化的转录过程
1．RNA聚合酶与模板DNA结合
2．起始
3．延伸
4．终止
1．RNA聚合酶与模板DNA结合1
RNA聚合酶结合到模板DNA的特定位臵上
1．RNA聚合酶与模板DNA结合2
这一特定部位有RNA聚合作用的起动 基因，即启动子
起始部位
－35（识别位） －10（Pribnow框）＋1
依赖于RNA的DNA聚合酶
核糖核酸酶H
5’ 3’
依赖DNA的DNA聚合酶
5’ 3’
3’ 5’
新合成的双链DNA整合到 寄主染色体DNA中
第五节 基因的重组与DNA“克隆”
DNA重组技术是指将不同的DNA片段按人们的
设计方案定向地连接起来，并在特定的受体细 胞中，与载体一起得到复制与表达，使受体细 胞获得新的遗传特性。
（2）HnRNA转变成mRNA的加工过程：
①5’ 端 形 成 特 殊 的 帽 子 结 构 （ M7G5’PPP5’NmpNp-）
②在链的3’端切断并加上多聚腺 苷酸（polyA）尾巴
③通过拼接除去由内含子转录来 的序列 ④链内部核苷被甲基化
2．真核生物RNA转录后加工8（mRNA3）
卵清蛋白基因产生mRNA的过程：
②tRNA前体分子被修饰：其一是有些尿嘧啶
残基转变为拟尿嘧啶或二氢尿嘧啶残基；其二 是甲基化作用。此变化是在甲基转移酶的催化 下，由s-腺苷蛋氨酸供给甲基，在多核苷酸水 平上进行。
2．真核生物RNA转录后加工5（tRNA2）
tRNA的生成
核仁 细胞核 tRNA基因
5’
转录 切断
nCH3 拟尿苷生成
从某种意义上来说，DNA重组技术也可理解
为基因工程，也是使生物基因结构得到改造的 技术。
第五节 基因的重组与DNA“克 隆”2
一、DNA重组技术的用途 二、重组中所用的酶和载体 三、重组的大致步骤
一、DNA重组技术的用途
1．利用DNA重组技术大量生产一些在正常组
织代谢中产量很低的多肽物质，如多肽激素、 多肽抗生素、酶类、抗体及各种肽类。
pppN1N2N3 … G5’ ppp5 ’ N1N2N3 … m7G5’ ppp5 ’ N1N2N3 … m7G5’ ppp5 ’ N1 mN2N3 … m7G5’ ppp5 ’ N1 mN2mN3 …
mRNA(鸟嘌呤-7-) 甲基转移酶
mRNA(核苷-2’-) 甲基转移酶
mRNA(核苷-2’-) 甲基转移酶
TTGACA AACTGT
DNA
TATAAT ATATTA
3’
5’
原核生物启动子结构
1．RNA聚合酶与模板DNA结合3
双链DNA局部解开
2．起始1
磷酸二酯键的形成1
2．起始2
磷酸二酯键的形成2
OH U A P C P G P P- P- P
3’
OH
T
P C
A
P G P
P
C P P
5’
3．延伸1
真核生物rRNA的生成与成熟
45S 5S 核仁 细胞核 细胞质 18S 核蛋白体 41S→32S 5S 20S 18S 32S 5S
28S 5.8S
5S
28S 5.8S
2．真核生物RNA转录后加工4（tRNA1）
从tRNA前体转变到tRNA的过程
①在酶的催化下，切掉部分核苷酸分子（包
括14分子的UMP、7分子CMP、8分子GMP及少于1 分子的AMP）。
II
mRNA的前体
5SrRNA、tRNA、及其他多种 小分子核仁和核浆RNA前体
核质
III
核质
2．真核生物RNA转录后加工2（rRNA2）
真核生物rRNA前体的加工
45S
18S 5.8S
甲基化作用
核酸内切酶
28S
18S RNA
5.8S RNA
28S RNA
2．真核生物RNA转录后加工3（rRNA3）