人噬菌体抗体库的构建及人源性bFGF抗体的筛选

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噬菌体抗体库的构建流程

噬菌体抗体库的构建流程一、获取抗体基因来源。

这可是构建噬菌体抗体库的第一步呢。

咱得先找到抗体基因从哪儿来呀。

一般来说呢，可以从免疫后的动物或者人的淋巴细胞里获取。

比如说，给小老鼠打了某种抗原，然后过一段时间，从小老鼠的脾脏或者淋巴结里把淋巴细胞分离出来。

这就像是去寻宝，淋巴细胞里就藏着咱们要的抗体基因这个大宝贝呢。

二、提取mRNA。

有了淋巴细胞，下面就得把里面的mRNA弄出来啦。

这个mRNA可重要了，它就像是抗体基因的信使。

我们要用特殊的方法，就像用一把很精细的小镊子，把mRNA从淋巴细胞这个大集体里挑出来。

这个过程可得小心点儿，就像呵护小幼苗一样，因为mRNA很容易被破坏掉呢。

三、反转录合成cDNA。

把mRNA弄出来之后呀，就得把它变成cDNA啦。

这就像是一场神奇的魔法，mRNA 的信息通过反转录酶这个魔法棒，变成了cDNA。

这个cDNA就相当于抗体基因的另一种形式，但是它更稳定，方便我们后面的操作。

四、扩增抗体基因片段。

有了cDNA，还得把抗体基因片段扩增出来。

这就好比是把一个小种子变成一大片花海的过程。

我们可以用PCR技术来做这件事。

这个技术就像一个超级复印机，能把我们想要的抗体基因片段复制好多好多份，这样我们就有足够的材料来构建抗体库啦。

五、构建重组载体。

接下来呢，要把扩增好的抗体基因片段放到一个载体上。

这个载体就像是一辆小卡车，把抗体基因片段运到噬菌体这个大工厂里。

我们要把载体和抗体基因片段连接起来，这个过程就像搭积木一样，得小心翼翼地让它们完美结合。

六、将重组载体导入噬菌体。

把重组载体构建好之后，就该把它送到噬菌体里去啦。

这就像把货物装上卡车，然后让卡车开到目的地一样。

我们可以通过一些特殊的方法，让噬菌体接受这个带着抗体基因片段的重组载体，这样噬菌体就变成了一个小小的抗体生产车间啦。

七、筛选阳性噬菌体。

最后一步也很关键哦。

在众多的噬菌体里，我们要把那些成功表达了我们想要的抗体的噬菌体找出来，这些就是阳性噬菌体啦。

噬菌体抗体库构建和筛选技术及应用研究进展

噬菌体抗体库构建和筛选技术及应用研究进展王志文【期刊名称】《蚌埠医学院学报》【年(卷),期】2015(040)001【总页数】3页(P131-133)【关键词】噬菌体;噬菌体抗体库;小分子抗体;免疫抗体库;综述【作者】王志文【作者单位】蚌埠医学院临床检验诊断学实验中心,安徽蚌埠233030;蚌埠医学院生物化学与分子生物学教研室,安徽蚌埠233030【正文语种】中文【中图分类】R373.9噬菌体抗体库技术是由噬菌体展示技术发展而来的一项新型抗体制备技术。

通过噬菌体表面表达技术，将抗体分子Fab段基因或Fv基因通过与噬菌体外壳蛋白Ⅲ或蛋白Ⅷ基因连接以融合蛋白的形式表达在噬菌体表面，从而形成噬菌体抗体。

继1988年Parmley等［1］首次阐明噬菌体表面表达技术以来，抗体分子是噬菌体表面表达的第一个具有天然蛋白质功能的蛋白质分子。

Hoogenboom等［2］将轻链基因插入噬菌体载体的左臂，重链基因插入噬菌体载体的右臂，连接后包装成噬菌体，建立了第一个噬菌体抗体文库。

随着噬菌体载体系统的改进，噬菌体抗体技术得到广泛的应用，为了提高抗体库的多样性，在CDR区随机引入核苷酸序列而构成人工合成噬菌体抗体库;在已获得的阳性克隆的基础上，在特异性抗体基因CDR区进行基因突变筛选［3］，以获得高亲和力的特异性抗体。

噬菌体表面展示技术的问世和噬菌体抗体表达筛选系统的逐渐完善，使人们可以完全跨越抗原免疫而直接获得丰富多样的特异性抗体。

本文就噬菌体抗体库构建和筛选技术及应用研究进展作一综述。

1 噬菌体抗体库技术噬菌体属DNA单链病毒，长约7 000 bp。

噬菌体在细菌内滚环复制，被噬菌体感染的细菌不会裂解，但生长速度减慢，同时分泌出大量成熟的噬菌体颗粒。

噬菌体基因组共编码11种蛋白，噬菌体展示技术通常选择在信号序列和p蛋白第一结构域之间插入外源蛋白编码序列，经过噬菌体的包装加工，外源蛋白即可表达在病毒颗粒的表面［4］。

Ward等［5］采用PCR技术从溶菌酶免疫后的小鼠脾细胞DNA中扩增出VH基因，测序证实了其多样性，并随后在大肠埃希菌中表达了该VH片段。

抗呼吸道合胞病毒免疫噬菌体抗体库的构建及初步鉴定

抗呼吸道合胞病毒免疫噬菌体抗体库的构建及初步鉴定（作者:___________单位: ___________邮编: ___________）作者：汪治华, 张国成*, 许东亮, 孙新, 李小青, 李思袖, 张学红, 聂晓晶, 豆玉凤【摘要】目的: 构建小儿呼吸道合胞病毒感染患者人源性噬菌体抗体库, 搭建人源性抗体制备的技术平台, 为小儿呼吸道合胞病毒感染发病机制的研究、诊断、治疗和预防提供新的有效途径。

方法: 从52例呼吸道合胞病毒感染患儿外周血淋巴细胞中提取总RNA, 并逆转录为cDNA。

用PCR扩增轻链和重链Fd段（即重链的可变区和第一恒定区）基因, 并将扩增的轻链和重链基因片段克隆于pComb3x噬粒载体, 电转化XL1Blue大肠杆菌, 经辅助噬菌体M13K07超感染后构建成Fab段噬菌体抗体库。

对此抗体库双酶切进行鉴定, 并用呼吸道合胞病毒颗粒作抗原进行初步筛选。

结果: 经过重轻链基因的重组, 成功构建一免疫噬菌体抗体基因库, 共有2.6×106个不同的克隆菌, 其中70%的克隆均含有轻链和重链Fd 基因。

因此, 所构建的噬菌体抗体库的库容量为1.8×106, 经初步筛选, 抗体库得到了不同程度的富集。

结论: 利用基因重组技术和噬菌体展示技术, 成功构建小儿呼吸道合胞病毒感染患者人源性免疫噬菌体抗体库, 为进一步的研究奠定了基础。

【关键词】抗体库; 噬菌体展示技术; Fab抗体; 呼吸道合胞病毒; 儿童随着分子生物学的发展, 基因工程抗体技术的出现, 尤其是噬菌体抗体库技术, 为各种不同免疫原人源性抗体的制备提供了新途径, 成为抗体工程领域革命性的进展［1］。

我们以52例呼吸道合胞病毒感染患儿外周血淋巴细胞作为基因来源, 成功地构建了一个人源性Fab段免疫噬菌体抗体库, 并对其进行了初步鉴定, 为研制诊断、治疗和预防小儿呼吸道病毒感染的基因工程药物奠定了基础, 同时也将解决鼠源性抗体在临床应用中存在的不足。

抗人肺癌单链抗体噬菌体库的构建及特异性单链抗体的鉴定

抗人肺癌单链抗体噬菌体库的构建及特异性单链抗体的鉴定罗弋;庞华;李少林;曹辉;李淑杰;王树斌;樊春波【期刊名称】《基础医学与临床》【年(卷),期】2009(029)011【摘要】目的构建人源噬菌体抗体库,并从中筛选出抗肺癌人源单链抗体.方法提取肺癌患者癌旁淋巴结组织,通过RT-PCR扩增出重链可变区基因(VH)和轻链可变区基因(VL),再经剪切-重叠-延伸PCR(SOE-PCR)将VH和VL连接得到单链抗体(ScFv).将双酶切后的ScFv基因片段克隆入噬菌体表达载体pCANTAB5E,得到初级噬菌体抗体库.以肺腺癌细胞株A549为抗原对抗体库进行4轮筛选富集,鉴定抗体库性能.将得到的阳性克隆用IPTG诱导表达并进行检测.结果成功构建噬菌体单链抗体库.经筛选富集,噬菌体收获率得到增加,第4轮是第1轮的115倍.随机选取10个克隆,通过ELISA法检测到其中7个与A549细胞呈阳性反应,阳性率为70%.SDSPAGE及ELISA检测证实得到人源抗肺癌单链抗体.结论成功构建人源单链抗体噬菌体库,从中获得具有较高特异性的抗人肺癌单链抗体.【总页数】6页(P1155-1160)【作者】罗弋;庞华;李少林;曹辉;李淑杰;王树斌;樊春波【作者单位】重庆医科大学放射医学教研室,重庆,400016;重庆医科大学附属第一医院核医学科,重庆,400016;重庆医科大学放射医学教研室,重庆,400016;重庆医科大学放射医学教研室,重庆,400016;重庆医科大学放射医学教研室,重庆,400016;包头市中心医院肿瘤科,内蒙古包头,014040;重庆医科大学放射医学教研室,重庆,400016【正文语种】中文【中图分类】Q78【相关文献】1.抗脱氧雪腐镰刀菌烯醇噬菌体单链抗体库的构建与鉴定 [J], 周艳红;祭芳;丁衬衬;史建荣2.抗速灭威噬菌体单链抗体库的构建、筛选及鉴定 [J], 李铁军;李德全3.抗人β-淀粉样肽特异性单链抗体的噬菌体抗体库的构建与初步鉴定 [J], 段朝晖;毛越苹;罗晓红;李民友;劳伟思;王英;朱振宇4.鼠源抗AFB1噬菌体单链抗体库的构建与鉴定 [J], 裴世春;孙大庆;郭德军;宋薇;蒋琛5.全人源抗结肠癌噬菌体单链抗体库的构建及筛选鉴定 [J], 谢平丽;李官成;李艳东;周国华;李跃辉;郭锋杰;王甲甲因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

scFv抗体的筛选和活性研究(Molecular Devices)

靶向FGFR3胞外区域的人scFv抗体的筛选和活性研究成纤维细胞生长因子(FGF)是最大的一类中胚层和上皮细胞生长分化多肽因子家族。

FGFs在许多生物学过程中发挥重要作用，比如胚胎发育，伤口愈合，血细胞生成及血管发生等。

此外，已有研究表明FGFs可以增加多种肿瘤细胞的浸润性，如前列腺、膀胱、肾脏、乳房、胰腺等部位肿瘤。

目前，共发现20多种FGFs，对不同类型细胞具有不同的作用。

但是，只发现了5种FGF受体(FGFR)。

在蛋白水平上，这些受体具有55%-72%的同源性。

FGFR结构包括一个胞外配体结合区域，一个跨膜区域以及一个胞内激酶区域。

配体结合区域包含三个不同的类似免疫球蛋白结构域(称为免疫球蛋白I，II和III)。

FGFR1-3 mRNA的不同的剪接作用形成两种亚型α和β。

其中FGFR3具有两种不同的突变体IIIb和IIIc。

这两种变体具有不同的亲和活性：IIIc分布更加广泛，能和多种FGFs结合(FGF1，FGF2，FGF4，和FGF9)；IIIb优先和FGF1结合，能够较低程度和FGF8和FGF9结合。

在有肝素(heparin)作用的情况下，FGFs和FGFRs结合后，FGFs诱导受体二聚化，引起胞内激酶区域的自身磷酸化以及下游信号级联反应的激活。

配体受体结合后，FGFs会启动多种信号转导途径：胞内钙离子水平升高，诱导丝裂原活化蛋白激酶和蛋白激酶C通路，激活腺苷酸环化酶以及诱导原癌基因c-myc 和c- fos。

已发现FGFR3会发生特殊突变，导致其酪氨酸激酶活性激活，引起一些与骨骼发育，多发性骨髓瘤，颈部肿瘤以及膀胱肿瘤相关的综合征。

最近的研究发现FGFR信号是前列腺肿瘤细胞在体外存活所完全必需的。

近来，FGFR3已被作为多发性骨髓瘤的可能治疗性靶点。

尽管已有确实证据表明激活的FGFR3突变存在于肿瘤组织中，但是关于FGFR3在肿瘤组织中的表达知道的非常少。

近来，使用基因芯片技术对基因表达分析后，发现和正常组织相比FGFR3在膀胱肿瘤样品中过表达。

人源乳腺癌噬菌体抗体库的构建及初步筛选

ＭＣ＿结合活性癌噬菌体抗体库中筛选到６特异性噬菌体抗体，下一步进行单链抗体的株为
乳腺癌放射性核素显影及治疗奠定了基础。
关键词：腺癌；菌体抗体库；乳噬筛选；链抗体单中图分类号：７７９Ｒ３．４Ｒ３．；７０４文献标识码：Ａ文章编号：６１８４（ＯＯ０ —５６Ｏ１７－３８２１）５０１一３
ＴＡＮＧｈ — ｉ，ｈｏｌｎ，ＳｕｂｎＬＩＳａ —ｉＰＥＮＧｅｅ１Ｊｉ，ｔ．ａ
．
（．ｅａｔｎｏｃｌｙ，ｉｓＰｏｌｓｓｉｌｆＮｅｉｎＮｅｉｎＳｃｕｎ６１０，ｌｎ；１ＤｐｒｍｅｔｆＯｎｏｇＦｒｔｅｐｅｐｔｉａｇ，ｉａｇ，ｉａ４００Ｃ￣ａｏＨｏａｏｊｊｈｉ２ＤｅａｔｎｆＮｕｌｒｄｃｅＣｌｇｆＢｓｄｃｅＣｏｇｉｇＭｅｉｌｎｖｒｉＣｏｇｉｇ４０１，ｈｎ）．ｐｒｍｅｔｃａｏｅＭｅｉｉ，ｏｌｅａｉＭｅｉｉ，ｈｎｑｎｄｃｉｅｓｔｈｎｑｎ００６ＣｉａｎｅｏｃｎａＵｙ，
ＥＬＳＲｅｕｔＡｈｇｎｉｏｙｏ．ＩＡ．ｓｌｓｐａｅａｔｄｆ４２× １ｗａｂａｎｄａｄｓｘａｔｖｌｎｓａａｎｔｂｅｓａｃｒｅｌＭＣＦ７ｗｅｅｇｉｅｂ０ｓｏｔｉｅｎｉｃｉｅｃｏｅｇｉｓｒａｔｃｎｅｅｌ－ｒａｎｄｆｏｔｅＳｆｉｒｒ．ｏｃｕｉｎＳｘａｔｏｙｂｎｉｇｔｒａｔｃｎｅｅｌｒｔｏｇｙｗｅｅｉｅｔｉｄｆｏｈｍａｉｅｐａｅａ — ｒｍｈｃｖｌａｙＣｎｌｓｏｉｎｉｄｉｄｎｏｂｅｓａｃｒｃｌｍｏｅｓｒｎｌｒｄｎｉｅｒｍｕｎｚｈｇｎｂｂｆｔｏｙｌｒｒ．ｉｗｏｋｐｏｉｅｓｔｅｂｓｓｆｒｒｄｏｕｌｅｉｇｎｎｈｒｐｏｒａｔｃｎｅ．ｉｄｉａｙＴｈｓｂｂｒｒｖｄｓｕｈａｉｏａｉｎｃｉｍａｉｇａｄｔｅａｙｆｒｂｅｓａｃｒｄ

噬菌体抗体库技术原理

噬菌体抗体库技术原理
嘿，朋友们！今天咱要来聊聊噬菌体抗体库技术原理，这可真的超级神奇呀！
你想想看，抗体就像是我们身体里的小战士，专门去对抗那些坏家伙。

那噬菌体呢，就像是一个个小车子。

而噬菌体抗体库技术呢，就像是给这些小车子都配上了厉害的武器！
比如说，我们可以把各种不同的抗体基因放到噬菌体里面，这就像是给小车子装上了不同功能的工具。

然后呢，让这些带着抗体基因的噬菌体们去到处闯荡！哇塞，这不就像一场盛大的冒险嘛！
当它们遇到目标的时候，就能发挥作用啦！好比有个坏细菌出现，那些有对应抗体基因的噬菌体就立刻冲上去，“嘿，你别跑！我来对付你啦！”这多酷啊！
再想想，如果我们能随心所欲地制造出各种我们想要的抗体，那能解决多少难题呀！像那些很难对付的疾病，说不定就能被这些特别的抗体给攻克掉呢！“这难道不让人兴奋吗？”
而且哦，这个技术还能不断地改进和优化，就像我们给小车子不断升级装备一样。

科学家们可以根据需要，去调整和创造出更厉害的抗体。

“这是多么有意义的事情呀！”
在这个过程中，大家都在努力探索，不断尝试。

研究者们就像一群智慧的探险家，在这个神奇的抗体世界里努力前行。

他们满怀激情地投入，只为了能让这个技术更加完美。

我觉得呀，噬菌体抗体库技术原理真的是充满了无限的可能和希望！它就像是一把神奇的钥匙，会为我们打开解决许多难题的大门！让我们一起期待它能带来更多的惊喜吧！。

抗体库的构建过程

抗体库的构建过程一、引言抗体库是指收集、保存和管理大量的抗体样本，可以应用于生物医学研究、药物研发等领域。

抗体库的构建过程包括样本采集、抗体制备、筛选和管理等多个环节。

本文将详细介绍抗体库的构建过程。

二、样本采集1.确定采集对象：根据研究目的和需求，确定采集对象。

常见的采集对象包括动物（如小鼠、大鼠、兔子等）、人类血清和细胞系等。

2.采集条件：在保证样本质量的前提下，选择合适的采集条件。

例如，在动物实验中应注意麻醉方式和剂量，避免对动物造成伤害；在人类血清采集中应注意消毒和针头选择等。

3.样本处理：对于不同类型的样本，需要进行不同的处理方法。

例如，对于血清样本需要离心分离血清，去除红细胞等。

三、抗体制备1.免疫原选择：根据研究目的和需求，选择合适的免疫原。

常见的免疫原包括蛋白质、多肽、细胞表面分子等。

2.免疫程序：根据免疫原的特性和抗体制备的需求，选择合适的免疫程序。

常见的免疫程序包括单次免疫、多次免疫等。

3.抗体纯化：通过蛋白A/G亲和层析、离子交换层析等方法纯化抗体。

四、筛选1.ELISA筛选：通过ELISA方法对抗体进行筛选。

将免疫原包被在96孔板上，加入抗体样本，然后加入二抗进行检测。

2.流式细胞术筛选：通过流式细胞术对抗体进行筛选。

将细胞表面分子作为免疫原进行免疫，然后用荧光标记的二抗进行检测。

五、管理1.样本存储：将制备好的抗体样本存储在低温冰箱或液氮罐中，保证其质量和稳定性。

2.信息管理：建立完整的信息管理系统，记录每个样本的来源、制备过程和特性等信息。

六、总结抗体库是生物医学领域中重要的资源之一，其构建过程需要经过样本采集、抗体制备、筛选和管理等多个环节。

在每个环节中，都需要注意细节，保证样本的质量和稳定性。

建立完整的信息管理系统，有助于提高抗体库的效率和可靠性。

抗体库筛选技术介绍

抗体库筛选技术介绍
1.抗体库构建：首先，需要构建一个包含大量不同抗体的抗体库。

常见的方法包括免疫化学方法、获得单个免疫球蛋白B细胞并进行单细胞PCR扩增、切割免疫球蛋白链并进行克隆等。

2.抗原或目标蛋白筛选：抗体库中的抗体会与抗原或目标蛋白发生特异性结合。

通常使用抗原或目标蛋白对抗体库进行筛选。

抗原或目标蛋白可以是合成的多肽、重组蛋白、整个细胞或其组分等。

3.高亲和力筛选：在已经进行了初步筛选的抗体库中，利用高亲和力进行筛选。

这可以通过几个方法实现，如亲和柱层析、溶液竞争结合、表面等的相互作用等。

目的是筛选出具有高亲和力的抗体。

4.特异性筛选：特异性是指抗体只与特定抗原结合，并且不与其他物质发生结合。

特异性筛选通常可以通过ELISA、胶体金或荧光标记等方法来进行。

通过多次筛选，以获取高特异性的抗体。

5.功能性和应用评估：在筛选过程结束后，需要对获得的抗体进行进一步的功能性和应用评估。

常见的评估方法包括免疫组织化学、流式细胞术、免疫印迹、细胞免疫活化等。

总之，抗体库筛选技术是一种快速有效的抗体筛选方法，可以获得高质量的抗体，为研究和医学进展提供了重要的工具。

噬菌体抗体淘筛方法

噬菌体抗体淘筛方法一、噬菌体展示技术原理噬菌体展示技术基于噬菌体颗粒表面的基因插入法。

通过将抗体片段的基因插入到噬菌体基因组中，使噬菌体能够在其表面展示抗体。

随后，将含有目标抗原的库经过一系列的筛选步骤，如淘洗、洗涤和分离，以筛选出与目标抗原特异性结合的抗体。

噬菌体核心蛋白质pIII等表面蛋白链通过基因插入的方法与外源基因连接，实现抗原展示。

二、噬菌体抗体淘筛方法的流程1.抗原制备：首先，需要制备目标抗原。

可以通过多种方法制备抗原，如重组蛋白表达系统、细胞和细胞溶解物、组织和分离物等。

2.抗体库构建：构建包含大量抗体片段的抗体库。

一般使用转录组或基因组DNA作为起始材料，使用PCR扩增抗体基因片段，并将其插入合适的载体中。

3.噬菌体包装：将构建好的抗体库与噬菌体粒子一起包装成噬菌体颗粒。

4.抗原吸附：将噬菌体抗体库与目标抗原进行反应，使抗体与抗原结合。

5.淘洗分离：用洗涤缓冲液对混合物进行混洗，以除去非特异性结合的噬菌体。

6.噬菌体放大：将经过淘洗分离的噬菌体在培养基中进行放大培养。

7.ELISA筛选：使用ELISA检测噬菌体是否与目标抗原的特异结合。

将阴性和阳性对照样品和待测样品加入到蛋白质包被的酶标板孔中，通过检测酶标物质的生成或反应物颜色的变化，判断噬菌体是否与目标抗原结合。

8.质粒DNA提取和测序：选择特异性结合抗原的噬菌体进行质粒DNA 提取和测序，以获取抗体的DNA序列。

9.后续鉴定和分析：鉴定筛选出的抗体的亲和力、特异性、敏感性等性质，以及进行进一步的功能分析。

三、噬菌体抗体淘筛方法的注意事项1.抗原的选择：选择合适的抗原非常关键，抗原应具有特异性且容易从培养基或生物样品中提取。

2.抗体库的构建：构建抗体库时，要确保插入的抗体片段多样性和覆盖性。

3.抗原吸附条件的优化：抗原吸附条件的优化对淘洗分离步骤的效果具有重要影响。

4.筛选条件的优化：在ELISA筛选过程中，需要对反应温度、时间、缓冲液浓度等条件进行优化，以提高筛选效果。

噬菌体抗体库筛选操作流程tomlinsonij

噬菌体抗体库筛选操作流程tomlinsonijtheLibrariesGeneral Introduction toOver the past 10 years Greg Winter’s lab at the MRC Laboratory of Molecular Biology and the MRC Centre for Protein Engineering (Cambridge, UK) has created a number of artificial libraries of antibodies that can be used to derive binders to almost any target molecule using phage display and selection. These binders can be used for all the same applications as conventional monoclonal antibodies (ELISA, Western blotting, FACS, immunohistochemistry etc) but can be isolated in a fraction of the time and without the need for animal immunisation. To date these so called “na?ve” or “single pot” phage-antibody libraries have been used successfully in hundreds of molecular biology labs world-wide to derive highly specific antibody reagents to a wide range of different proteins, peptides or small molecule compounds.The latest libraries (Tomlinson I and J) that are being distributed by the MRC HGMP Resource Centre each comprise over 100 million different scFv fragments cloned in an ampicillin resistant phagemid vector and transformed into TG1 E. Coli cells (scFv fragments comprise a single polypeptide with the VH and VL domains attached to one another by a flexible Glycine-Serine linker). By carefully following the protocol provided, large numbers of phagemids can be produced and used to select specific binders to target molecules that are attached to the surface of a tube or biotinylated and captured by streptavidin coated beads (so called “panning”). After each round of panning, the non-binders are washed away and the phagemids bound to the target molecule/s are eluted and amplified by infection into fresh TG1 cells. After producing new phagemids from the previous round of panning, the process can be repeated. Typically two or three rounds of panning are required to ensure that more than half the different scFvs in the selected population bind to the target molecule. The monoclonal scFvs can then be screened for binding (using a simple ELISA based protocol) and then used for further analysis of the target molecule. Since all the functional scFvs in the Tomlinson I and J libraries bind Proteins A and L, either of these secondary reagents can be used for detection, purification or immobilisation. Alternatively, secondary reagents that bind the attached myc or HIS6 tags can be used, although in our experience it is better to use the Protein A or L reagents.Finally, we would like to emphasise that these libraries represent a valuable resource. Whether you are familiar with phage display or not we recommend that you perform test selections and subsequent ELISA screening using the anti-bovine serum albumin and anti-bovine ubiquitin controls provided. Only when these experiments have been successfully carried out should you defrost the libraries and start preparing library phage.Derivation of librariesBoth libraries are based on a single human framework for V H (V3-23/DP-47 and J H 4b) and V κ (O12/O2/DPK9 and J κ1) with side chain diversity incorporated at positions in the antigen binding site that make contacts to antigen in known structures and are highly diverse in the mature repertoire. The canonical structure (V H : 1-3, V κ: 2-1-1) encoded by this framework is by far the most common in the human antibody repertoire. The CDR3 of the heavy chain was designed to be as short as possible yet still able to form an antigen binding surface. Both libraries can be selected and affinity matured without knowing the sequences of selected clones. Libraries are in phagemid/scFv format and have been pre-screened for binding to Protein A and Protein L so that the majority of clones in the unselected libraries are functional.Constructed in pIT2 (HIS myc tag). Diversified (DVT) side chains based mainly on those positions which are diverse in the primary repertoire (total of 18 residues - H50, H52, H52a, H53, H55, H56, H58, H95, H96, H97, H98, L50, L53, L91, L92, L93, L94 and L96). After selection, can be matured by incorporating additional diversity based on somatic mutation. Library size (with insert): 1.47 x 108 Percentage insert: 96%As above but with NNK side chains. Library size (with insert): 1.37 x 108 Percentage insert: 88%1. Check that you have received:a tube of Library I (~500 µl)a tube of Library J (~500 µl)a glycerol stock of a positive control anti-ubiquitin ScFv in bacterial strain TG1 (labeled TG1-antiubi)a glycerol stock of a positive control anti-BSA ScFv in bacterial strain TG1 (labeled 13CG2)a glycerol stock of T-phage resistant E. Coli. TG1 for propagation of phage (labeled TG1Tr)(lac-proAB) supE thi hsdD5/F' traD36 proA+B lacI q lacZM15)(K12a glycerol stock of E. Coli. HB2151 for expression of antibody fragmentsara ?(lac-proAB) thi/F' proA+B lacI q lacZ?M15)(K12KM133 (~100 µl with 107 pfu/ml)Phage2. Check the library is still frozen and make sure you keep it frozen at -70°C until needed.3. Make stock of KM13 according to Protocol G.4. Run through the protocols using the control clones before you use the library: Streak the controlson TYE plates containing 100 µg/ml ampicillin and 1 % glucose. After overnight growth at 37°C in an incubator pick a single colony from each and grow these overnight (shaking at 37°C) in 5 ml 2xTY1 containing 100 µg/ml ampicillin and 1 % glucose. Make phage for the positive and negative controls separately (use 500 µl of overnight in D1-D10). Use a 1:100 mixture of phage produced from the positive and the negative controls and perform one round of selection (C1-C11) using 100 µg/ml of ubiquitin2 in PBS for coating. Check for enrichment of ubiquitin binders (should be over 50% after one round of selection) by monoclonal phage ELISA (E9-E14).5. Wherever possible use devoted pipettes and disposable plastic ware. The use of polypropylenetubes is recommended as phage may adsorb non-specifically to other plastics.6. For efficient infection of phage, E. coli must be grown at 37°C and be in log phase (OD at 600 nmof 0.4). To prepare this:i. Transfer a bacterial colony from a minimal media plate into 5 ml of 2xTY medium (no antibioticsor glucose). Grow shaking overnight at 37°C.ii. Next day dilute overnight 1:100 into fresh 2xTY medium. Grow shaking at 37°C until OD 600 is0.4 (1.5-2 hrs)7. All centrifugations, except those performed in a micro centrifuge, are performed at 4°C.8.Libraries I and J must be used separately and preferably in parallel. This will ensureselecting the most antigen binding clones.In advanceGather all equipment and reagents (product details are given in the notes at the end of all the protocols). Make sure you have all the necessary media and plates for bacterial growth (the large Bio-Assay plates need to be air-dried in a sterile environment for 2 hrs before use).Plan your time - most of the daily procedures can be performed simultaneously, so read through each protocol carefully before starting.StepsProcedureDay 1 (5 hrs) A1-A6 Grow libraries I and J and make phageB1-B3 Make secondary stock of librariesDay 2 (6 hrs) A7-A12 Grow libraries I and J and make phage (cont.)C1 Coat immunotubes for 1st round of selectionDay 3 (6.5 hrs) C2-C11 1st round of selectionDay 4 (3 hrs) D1-D6 Make phage from 1st round of selectionC1 Coat immunotubes for 2nd round of selectionDay 5 (6.5 hrs) D7-D11 Make phage from 1st round of selection (cont.)C2-C11 2nd round of selectionDay 6 (3 hrs) D1-D6 Make phage from 2nd round of selectionC1 Coat immunotubes for 3nd round of selectionDay 7 (6.5 hrs) D7-D11 Make phage from 2nd round of selection (cont.)C2-C11 3rd round of selectionDay 8 (3 hrs) D1-D6 Make phage from 3rd round of selectionE1 Coat 96 well plate for polyclonal phage ELISADay 9 (6.5 hrs) D7-D11 Make phage from 3rd round of selection (cont.)E2-E8 Polyclonal phage ELISAFurther characterisation of individual clones can be performed by monoclonal phage ELISA (protocol E), monoclonal ELISA using soluble scFv fragments (protocol F), PCR screening (to check for insert, protocol H) and sequencing (protocol I).1. Add the library stock to 200 ml pre-warmed 2xTY containing 100 µg/ml ampicillin and 1 %glucose.2. Grow shaking at 37°C until the OD 600 is 0.4 (1-2 hrs).3. Take 50 ml of this and add 2x1011 KM13 helper phage3. (Use the remaining 150 ml to make asecondary bacterial stock of the library by following protocol B).4. Incubate without shaking in a 37°C water bath for 30 min.5. Spin at 3,000 g for 10 min (3,600 rpm in Centra 8 or equivalent). Resuspend in 100 ml of 2xTYcontaining 100 µg/ml ampicillin, 50 µg/ml kanamycin and 0.1% glucose.6. Incubate shaking at 30°C overnight.7. Spin the overnight culture at 3,300 g for 30 min (4,000 rpm in Centra 8 or equivalent).8. Add 20 ml PEG/NaCl (20 % Polyethylene glycol 6000, 2.5 M NaCl)to 80 ml supernatant. Mix welland leave for 1 hr on ice.9. Spin 3,300 g for 30 min (4,000 rpm in Centra 8 or equivalent). Pour away PEG/NaCl. Respinbriefly and aspirate any remaining dregs of PEG/NaCl.10 Resuspend the pellet in 4 ml PBS and spin at 11,600 g for 10 min in a micro centrifuge to removeany remaining bacterial debris.11. Store the phage at 4°C for short term storage or in PBS with 15 % glycerol for longer termstorage at -70°C.12. To titre the phage stock dilute 1µl phage in 100µl PBS, 1µl of this in 100µl PBS and so on untilthere are 6 dilutions in total. Add 900µl of TG1 at an OD 600 of 0.4 to each tube and incubate at 37°C in a waterbath for 30 mins. Spot 10 µl of each dilution on a TYE5 plate containing 100 µg/ml ampicillin and 1 % glucose and grow overnight at 37°C. Phage stock should be 1012-1013/ml, enough for at least 10 selections.1. Grow the remaining 150 ml from A3 for a further 2 hr shaking at 37°C.2. Spin down the cells at 10,800 g for 10 min. Resuspend in 10 ml of 2xTY containing 15 % glycerol.3. Store this secondary stock in 20x 500 µl aliquots at -70°C. Use one aliquot for each phagepreparation according to protocol A - this will only be necessary if you wish to do more than 10 selections.(Alternatively, phage can be selected using biotinylated antigen in solution or affinity chromatography. For details see Winter et al. (1994) Annu. Rev. Immunol.12, 433)immunotube6 overnight with 4 ml of the required antigen. The efficiency of coating can1. Coatdepend on the antigen concentration, the buffer and the temperature. Usually 10-100 µg/mlantigen in PBS is used.2. Next day wash tube 3 times with PBS (pour into the tube and then pour it immediately out again).3. Fill tube to brim with 2 % MPBS (2 % Marvel milk powder7 in PBS). Incubate at rt. Standing onthe bench for 2 hr to block.4. Wash tube 3 times with PBS.1012 to 1013 phage from A11 in 4 ml of 2 % MPBS. Incubate for 60 min at rt. rotating using 5. Addan under-and-over turntable and then stand for a further 60 min at rt. Throw away supernatant.6. Wash tubes 10 (round 1)-20 (rounds 2 and 3) times with PBS containing 0.1 % Tween 20.7. Shake out the excess PBS and elute phage by adding 500 µl of trypsin-PBS (50 µl of 10mg/mltrypsin stock solution8 added to 450 µl PBS) and rotating for 10 min at rt using an under-and-over turntable.8. Take 1.75 ml of TG1 at an OD 600 of 0.4 and add 250 µl of the eluted phage (the remaining 250µl should be stored at 4°C). Incubate for 30 min at 37°C in a water bath without shaking.µl, 10 µl of a 1:102 dilution and 10 µl of a 1:104 dilution on TYE plates containing 1009. Spot10µg/ml ampicillin and 1 % glucose and grow overnight at 37°C to titre the phage.10. In round 1 if using a complex antigen (eg cells, cell lysates etc): take the remaining TG1 cultureand spin at 11,600 g in a micro centrifuge for 5 min. Resuspend the pelleted bacteria in 1 ml of 2xTY and plate on a large square Bio-Assay dish9 containing TYE, 100 µg/ml ampicillin and 1 % glucose.In round 1 if using a single hapten, carbohydrate or protein antigen and in subsequent rounds for all antigens: take the remaining TG1 culture and spin at 11,600 g in a micro centrifuge for 5 min.Resuspend the pelleted bacteria in 50 µl of 2xTY and plate on a regular TYE plate containing 100 µg/ml ampicillin and 1 % glucose.11. Grow plates at 37°C overnight.The first round of selection is the most important. Any errors made at this point will be amplified in subsequent rounds of selection. After each round you should get back at least 100 infective phage. If you get less than this it is probable that a mistake has occurred. If so, try repeating the infection with a freshly grown TG1 culture (from a new overnight) at an OD 600 of 0.4 using the remaining 250 µl of eluted phage from C7. If this still yields less than 100 phage, repeat the selection starting at C1.1. After overnight growth add 7 ml of 2xTY 15 % glycerol to the large square Bio-Assay dish or 2mlsto the regular plates and loosen the cells with a glass spreader, mixing them thoroughly. After inoculating 50 µl of the scraped bacteria to 50 ml of 2xTY containing 100 µg/ml ampicillin and 1 % glucose, store 1 ml of the remaining bacteria at -70°C in 15% glycerol.2. Grow shaking at 37°C until the OD 600 is 0.4 (1-2 hrs).3. Take 10 ml of this culture and add 5x1010 helper phage.4 Incubate without shaking in a 37°C water bath for 30 min.5. Spin at 3,000 g for 10 min. Resuspend in 50 ml of 2xTY containing 100 µg/ml ampicillin, 50 µg/mlkanamycin and 0.1% glucose.6. Incubate shaking at 30°C overnight.7. Spin the overnight culture at 3,300 g for 15 min.8. Add 10 ml PEG/NaCl (20 % Polyethylene glycol 6000, 2.5 M NaCl)to 40 ml supernatant. Mix welland leave for 1 hr on ice.9. Spin 3,300 g for 30 min. Pour away PEG/NaCl. Respin briefly and aspirate any remaining dregsof PEG/NaCl.10. Resuspend the pellet in 2 ml PBS and spin at 11,600 g for 10 min in a micro centrifuge to removethe remaining bacterial debris.11. Use 1 ml of this phage for the next round of selection (protocols C and D) and store 1 ml at 4°C.12. Repeat selection for another 2 rounds.Populations of phage produced at each round of selection can be screened for binding by ELISA to identify "polyclonal" phage antibodies. Phage from single colonies can then be screened by ELISA to identify "monoclonal" phage antibodies. Alternatively, after a polyclonal phage ELISA you could proceed directly to making monoclonal soluble antibody fragments, see protocol F. In general, we have found that 2% Marvel in PBS is best for blocking during phage ELISA whereas 3% BSA in PBS is best for blocking during scFv ELISA.1. Coat a 96 well flexible assay plate10 overnight with 100 µl per well of antigen in the same bufferand at the same concentration as used for selection.2. Wash wells 3 times with PBS. Plates can be immersed in a shallow bath containing PBS but youshould check that all wells fill with wash solution (if they do not you may create false positivesduring later washes). Discard liquid by flipping plate over and then shaking it. Add 200 µl per well of 2 % MPBS (2 % Marvel in PBS) or 3% BSA-PBS (3% bovine serum albumin in PBS) to block and incubate for 2 hr at rt.3. Wash wells 3 times with PBS. Add 10 µl PEG precipitated phage from the end of each round ofselection in 100 µl 2 % MPBS (or 3 % BSA-PBS).4. Incubate for 1 hr at rt. Discard phage solution and wash 3 times with PBS-0.1 % Tween 20.5. Add 1 in 5000 dilution of HRP-anti-M1311 in 2 % MPBS (or 3 % BSA-PBS). Incubate for 1 hr atrt., wash 3 times with PBS-0.1 % Tween 20.µl of substrate solution (100 µg/ml TMB12 in 100 mM sodium acetate, pH 6.0. with10 µl 1006. Addof 30 % hydrogen peroxide added to 50 ml of this solution directly before use) to each well and leave at rt. for 2-15 min. A blue colour should develop.7. Stop the reaction by adding 50 µl 1 M sulphuric acid. The blue colour should turn yellow.9. Inoculate individual colonies from the titration plates from each round of selection (see C11) into100 µl 2xTY containing 100 µg/ml ampicillin and 1 % glucose in 96 cell-well plates13. Growshaking (250 rpm) overnight at 37°C.10. Use a 96 well transfer device14 to transfer a small inoculum (about 2 µl) from this plate to asecond 96 cell-well plate containing 200 µl of 2xTY with 100 µg/ml ampicillin and 1 % glucose per well. Grow shaking (250 rpm) at 37°C for 2 hr. (Make glycerol stocks of the original 96-well plate, by adding glycerol to a final concentration of 15 %, and then storing the plates at -70°C).11. After 2 hr incubation (of the second plate) add 25 µl 2xTY containing 100 µg/ml ampicillin, 1 %glucose and 109 helper phage.12. Shake (250 rpm) at 37°C for 1 hr. Spin 1,800 g for 10 min, then aspirate off the supernatant.13. Resuspend pellet in 200 µl 2xTY containing 100 µg/ml ampicillin and 50 µg/ml kanamycin. Growshaking (250 rpm) overnight at 30°C.14. Spin at 1,800 g for 10 min and use 50 µl of the supernatant in phage ELISA as detailed above.Individual colonies picked from the various rounds of selection (as plated on the dilution series) can be induced in TG-1 to produce soluble scFv (F2-F6). This will ensure the expression of all selected clones including those in which the scFvs contain TAG stop codons (TG-1 as able to suppress termination and introduce a glutamate residue at these positions). Unfortunately, since the TAG stop codon between the scFv and the gIII gene is also suppressed this leads to co-expression of the scFv-pIII fusion which tends to lower the overall levels of scFv expression, even in clones where there are no TAG stop codons in the scFv itself. To circumvent this problem, the selected phage can be used to infect HB2151 (a non-suppresor strain) which is then induced to give soluble expression of antibody fragments (scFv genes that do not contain TAG stop codons will now yield higher levels of soluble scFv than in TG-1, but those that contain TAG stop codons will not produce any soluble scFv) (F1-F6). The expressed scFvs can then be used in ELISA. Detection of bound scFv can be performed using either Protein A-HRP15 or Protein L-HRP16 conjugates.1. From each selection take 10 µl of eluted phage and infect 200 µl exponentially growing HB2151bacteria (OD 600 of 0.4) for 30 min at 37°C in a water bath. Plate 50 µl, 50 µl of a 1:102 dilution,50 µl of a 1:104 dilution and 50 µl of a 1:106 dilution on TYE plates containing 100 µg/mlampicillin and 1 % glucose and grow overnight at 37°C.2. Pick individual colonies into 100 µl 2xTY 100 µg/ml ampicillin and 1 % glucose in 96 cell-wellplates and grow shaking (250 rpm) overnight at 37°C./doc/d1ca22bb960590c69ec376eb.html e a 96 well transfer device14 to transfer a small inocula (about 2 µl) from this plate to a second96 cell-well plate containing 200 µl 2xTY containing 100 µg/ml ampicillin and 0.1 % glucose perwell. Grow shaking (250 rpm) at 37°C until the OD 600 is approximately 0.9 (about 3 hr). (A stock can be made of the first plate, by adding glycerol to a final concentration of 15 % and storing at -70°C).4. Once OD 0.9 is reached (wells look quite cloudy) add 25 µl 2xTY containing 100 µg/ml ampicillinand 9 mM IPTG (isopropyl β-D-thiogalactoside, final concentration 1 mM IPTG). Continueshaking (250 rpm) at 30°C overnight.5. Coat a 96 well flexible assay plate overnight with 100 µl per well of antigen in the same buffer andat the same concentration as used for selection.6. Spin the plate from step F4 at 1,800 g for 10 min and use 50 µl of the supernatant (take care notto transfer any bacteria) for ELISA in 3% BSA-PBS (final concentration) (protocol E) except usinga 1:5000 dilution of Protein A-HRP15 or Protein L-HRP16 to detect binding in step E5.µl TG1 at an OD 600 of 0.4 with 10 µl of 100-fold serial dilutions of KM13 helper 2001. Infectphage3 (in order to get well separated plaques) in a 37°C water bath (without shaking) for 30 min.Add to 3 ml molten H-top agar (42°C) and pour onto warm TYE plates (no antibiotics). Allow to set and incubate overnight at 37°C.2. Pick a small plaque into 5 ml of fresh TG1 at an OD 600 of 0.4. Grow for about 2 hr shaking at37°C.3. Add to 500 ml 2xTY in a 2 litre flask and grow shaking at 37°C for 1 hr. Add kanamycin to a finalconcentration of 50 µg/ml (no glucose). Grow overnight shaking at 30°C.4. Spin overnight culture at 10,800 g for 15 min. Add 100 ml PEG/NaCl (20 % polyethylene glycol6000, 2.5 M NaCl) to 400 ml supernatent and leave for 1 hr on ice.5. Spin 10,800 g for 30 min. Pour away PEG/NaCl.6. Resuspend the pellet in 8 ml PBS and add 2 ml PEG/NaCl. Mix well and leave for 20 minutes onice.7. Spin 3,300 g for 30 min. Respin briefly and aspirate any remaining dregs of PEG/NaCl.8. Resuspend pellet in 5 ml PBS and spin at 11,600 g for 10 min in a micro centrifuge to remove anyremaining bacterial debris.9. Store the helper phage at 4°C for short term storage or in PBS with 15 % glycerol for longer termstorage at -70°C.10. To titre the helper phage take 45µl phage and add 5µl trypsin stock solution. Incubate for 30 minsat 37 °C. Dilute 1µl of trypsin treated phage in 1ml PBS and make five 100 fold serial dilutions of this in 1ml aliquots of PBS. Add 50µl of the six dilutions to six separate tube containing 1ml of TG1 at an OD 600 of 0.4. Mix, add 3 ml molten H-Top and pour evenly onto TYE plates.Perform the same dilution series using 1µl of non-trypsin treated phage. The titre of the trypsin treated phage should be 105-108 lower than for the non-trypsin treated phage. If not, pickanother plaque and repeat helper phage preparation.Once the libraries have been selected you may wish to check individual clones for the presence of full length VH and Vκinsert. All PCRs are at annealing temperature of 55°C. 1 min extension for V H or Vκon their own, 2 min extension for V H and Vκ together.For V H only use LMB3: CAG GAA ACA GCT ATG AClink seq new: CGA CCC GCC ACC GCC GCT Gwith insert = 527 bpwithout insert = 227 bpFor Vκ only use DPK9 FR1 seq: CAT CTG TAG GAG ACA GAG TCpHEN seq: CTA TGC GGC CCC ATT CAwith insert = 368 bpwithout insert = no bandFor V H and Vκ use LMB3: CAG GAA ACA GCT ATG ACpHEN seq: CTA TGC GGC CCC ATT CAwith insert = 935 bpwithout insert = 329 bpFor sequencing of selected clones the following primers are recommended.For V H use link seq new CGA CCC GCC ACC GCC GCT GFor Vκ use pHEN seq CTA TGC GGC CCC ATT CAXhoI NotIRBS CAGGAAACAGCTATGACCATGATTACGCCAAGCTTGCATGCAAATTCTATTTCAAGGAGACAGTCATA ATG AAA TAC CTA ----------------> M K Y L LMB3SfiI __NcoI__TTG CCT ACG GCA GCC GCT GGA TTG TTA TTA CTC GCG GCC CAG CCG GCC ATG GCC GAG GTG TTT L P T A A A G L L L L A A Q P A M A E V F XhoI linkerGAC TAC TGG GGC CAG GGA ACC CTG GTC ACC GTC TCG AGC GGT GGA GGC GGT TCA GGC GGA GGTD Y W G Q G T L V T V S S G G G G S G G GSalI NotI HIS-tag GGC AGC GGC GGT GGC GGG TCG ACG GAC ATC CAG ATG ACC CAG GCG GCC GCA CAT CAT CAT CACG S G G G G S T D I Q M T Q A A A H H H H<------------------------link seq newmyc-tagCAT CAC GGG GCC GCA GAA CAA AAA CTC ATC TCA GAA GAG GAT CTG AAT GGG GCC GCA TAG ACTH H G A A E Q K L I S E E D L N G A A * T<---------------------pHEN seq1. 2xTY is 16g Tryptone, 10g Yeast Extract and 5g NaCl in 1 litre.2. Bovine ubiquitin (5 mg) is available from Fluka, Chemika-BioChemika, Industriestrasse 25, CH-9470 Buchs, Switzerland, Tel +41 81 755 2511, Fax +41 81 756 5449.3. KM13 is the protease cleavable helper phage described i n Kristensen and Winter, Folding andDesign3, 321-328 (1998).4. PBS is5.84 g NaCl, 4.72 g Na2HPO4 and 2.64 g NaH2PO4.2H20, pH 7.2, in 1 litre.5. TYE is 15g Bacto-Agar, 8g NaCl, 10g Tryptone, 5g Yeast Extract in 1 litre.6. Nunc Maxisorp immuno test tubes (Cat. No. 4-44202) are available from Gibco BRL, LifeTechnologies Ltd., P. O. Box 35, Trident House, Washington Road, Paisley, PA3 4EF, Scotland, U.K, Tel +44 141 814 6100, Fax +44 141 887 1167.7. 'Marvel' is dried skimmed milk powder.8. Trypsin (T-1426 Type XIII from Bovine Pancreas - Sigma Chemical Company Ltd., Fancy Rd.,Dorset, BH17 7NH, U.K, Tel +44 1202 733114; Fax +44 1202 715460) made up in 50mM Tris-HCl pH7.4, 1mM CaCl2 and stored at -20°C9. Nunc Bio-Assay dish is available from Gibco BRL (see note 6).10. Falcon MicroTest III flexible 96 well flat bottomed assay plates are available from BectonDickinson Labware, Becton Dickinson and Co., 2 Bridgewater Lane, Lincoln Park, NJ 07035,USA.11. HRP-anti-M13 is available from Amersham International plc, Amersham Place, Little Chalfont,Buckinghamshire, HP7 9NA, UK. Tel: +44 01494 544000; Fax: +44 01494 542929.12. TMB is 3,3',5,5'-tetramethylbenzidine and is available from Sigma (see Note 8). A 10 mg/ml stocksolution can be made by dissolving the TMB in DMSO.13. Corning 'Cell Wells' flat-bottomed multiple well tissue culture treated plates are available fromCorning Glass Works, Corning N.Y. 14831. USA.14. The 96 well transfer device is a piece of wood the size of a microtitre plate with a handle on oneside and 96 metal pins (each 7 cm long with a concave end) on the other. This can be sterilised between bacterial transfer by immersion in a bath of ethanol and then by flaming (hold well away from your body and any flamable objects). If you haven't got one of these (or something similar) you will have to make one yourself or alternatively use a multichannel pipette for bacterialtransfer.15. Horse Radish Peroxidase conjugated Protein A is available from Amersham International plc (seenote 11)14. Horse Radish Peroxidase conjugated Protein L is available from Actigen Ltd, 5 Signet Court,Swanns Road, Cambridge, CB5 8LA, UK. Tel: +44 01223 319101; Fax: +44 01233 316443.。

噬菌体抗体库技术的基本方法

常用标记抗体试剂有 ①HBsAg放射性核素标记抗体诊断试剂
②HBeAg放射性核素标记抗体诊断试剂
③HAV抗原放射性核素标记抗体诊断试剂
④AFP放射性核素标记抗体诊断试剂
⑤CEA放射性核素标记抗体诊断试剂
三、导向诊断药物
放射性核素标记抗体肿瘤放射免疫显像放射免疫显像优点： ①在体内确切肿瘤定位作用，准确性达90%，灵敏度达100%。 ②在体内可检出0.5cm大小的病灶，并可检出肺脑的转移灶。
认为P蛋白是ATP酶依赖性药泵，药物进入细胞后与P蛋白结合，利用ATP水解释放的能量将药物泵出胞外，使胞内药物蓄积减少，因而产生耐药性。
三、毒素偶联的抗体药物
⒈免疫毒素及其换代制品
在导向药物中，毒素和抗体的交联物称为免疫毒素。
第一代免疫毒素是包含有A、B链完整毒素和抗体的交联物，其中B链非特异性结合，使其仅在体外应用。
一、血清学鉴定用的抗体类试剂 ⒈鉴定病原菌的抗体试剂 ⑴常用诊断血清的品种和用途
①沙门氏菌属诊断血清 ②志贺氏菌属诊断血清 ③病原性大肠埃希氏菌诊断血清
⑵诊断血清的制备步骤 ①制备细菌抗原 ②免疫动物和制备抗体血清
⑶诊断血清诊断方法
⒉乙型肝炎病毒表面抗原的反向被动血凝诊断试剂
⒊妊娠诊断试剂 ⒋抗ABO血型系统血清
第二代免疫毒素是利用抗体或抗体片段与毒素的A链或与A链相似的单链核糖体失活蛋白的结合物。因避免了第一代免疫毒素的非特异性，故能在体内有一定的抗肿瘤作用。
第三代免疫毒素重组免疫毒素用基因克隆方法改造毒素基因和小分子抗体基因重组表达。特异性好、稳定性强、渗透性佳、免疫源性低、可大量制备。
二、抗癌药物偶联的抗体药物
⒈常用的抗癌药物

噬菌体抗体库技术

在抗体片段如ScFv和Fab的可变区基因序列的5‘端加入细菌的信号肽
序列,抗体片段即可分泌到（ZHOU）质腔,并在那里完成折叠,成为有功能
的蛋白质分子,
3有效筛选系统的建立
传统的筛选方法使用固相化的纯化抗原,依赖噬菌体颗粒对目的抗原的
亲和力差异来获得较高亲和力的抗体,而目前,可以在体外用完整的固化哺
3.2噬菌体抗体库载体的构建
首先提取细胞的总RNA,经过RTPCR扩增可变区基因
Standard template
酶切轻链PCR产物和表达载体
二者连接,转入感受态细胞中扩增
重链的PCR产物
酶切
成为轻链库
酶切
二者按照一定比例连接
转化入感受态细胞
加入噬菌体
收集噬菌体颗粒
噬菌体总抗体库
Apply to courseware production
简单的PEG沉淀方法就足以将噬菌体与其他所有污染的细胞蛋白分开,
Apply to courseware production
2.2噬菌体展示所使用的衣壳蛋白
Standard template
次要衣壳蛋白pIII

406aa组成,5个拷贝,位于噬菌体的尾部,
由三个功能区组成：
N1穿膜区：作用于E.coli细胞膜上的TolA
有Helperphage,噬菌粒就像质粒
一样进行扩增,
包装后的噬菌体含有两种不同
来源的成分：噬菌体质粒和
Helperphage,
使用野生型辅助噬菌体会导致
噬菌体污染,使得仅有很少部分
子代噬菌体带有抗体片段,
当有噬菌质粒时,由于噬菌质粒
含有野生型M13或者f1复制起

邓宁简历——精选推荐

邓宁简历邓宁简历邓宁，博⼠，暨南⼤学⽣科院教授，博⼠⽣导师,暨南⼤学抗体⼯程研究中⼼副主任,细胞⼯程教研室主任，⼴东省免疫学会理事。

《中国⽣物⼯程杂志》、《暨南⼤学学报》杂志审稿专家。

主要学历和经历：1987年本科毕业于华中师范⼤学⽣物系，1993年硕⼠研究⽣毕业于华中师范⼤学昆⾍学研究所，2003年博⼠毕业于中⼭⼤学⽣科院。

1987年⾄1990年，湖北三峡⼤学⽣物系教师，1993-2000年在湖北三峡⼤学医学院教师，2003-现在，暨南⼤学⽣科院教授。

主要研究⽅向：基因⼯程抗体与抗体药物，肿瘤多肽疫苗，肿瘤⾎管新⽣的分⼦机制。

近年来主要围绕抗体⼯程和肿瘤多肽疫苗的研究开展⼯作，开展了抗体库的构建、⼈源抗体的筛选、抗体亲和⼒成熟和抗体的⼈源化、抗体的⾼效表达和纯化，抗肿瘤作⽤的单克隆抗体的研究与开发，进⼀步开展抗体药物研究。

开展了抑制肿瘤⾎管新⽣的肿瘤多肽疫苗等研究。

建⽴了⼯程抗体的表达、纯化技术平台，实现了抗⼄肝表⾯抗原Fab抗体在酵母的⾼效表达。

建⽴了抑制肿瘤⾎管⽣长的细胞模型和⼩⿏动物模型。

探讨了肿瘤多肽疫苗在肿瘤⾎管新⽣和抑制肿瘤⽣长转移的作⽤。

探讨肿瘤⾎管新⽣的分⼦机制及其与肿瘤发⽣发展的关系等。

科研项⽬和研究成果：主持了国家“863”专题课题、国家⾃然科学基⾦、教育部科学技术研究重点项⽬，⼴东省⾃然科学基⾦和⼴州市科技攻关重点等科研项⽬。

建⽴了⼈噬菌体抗体库，并筛选到抗bFGF⼈源性抗体。

探讨并阐明了bFGF单克隆抗体抑制肿瘤的作⽤，并构建了抗bFGF ⼈⿏嵌和抗体。

成功构建了具有较强免疫原性的抑制肿瘤⽣长的VEGF/bFGF多肽疫苗。

申报国家发明专利2项，在国内外学术期刊发表研究论⽂45篇。

参编教材《⽣物技术实验精选》（暨南⼤学出版社）。

指导本科学⽣挑战杯作品获⼴东省第九届挑战杯竞赛三等奖。

承担的《动物细胞⼯程》课程为校级精品课程。

近年发表的相关研究论⽂1）Ning Deng, Hong Wang, Junjian Xiang, et al. Construction of natural phage display library and the screening of anti-bFGF antibody，Journal of Immunology Mehtods, (in press)2）Hu Zhiyi, Lai Wenshan, Zhang Wenze, Deng Ning, et al. Secretion Expression and Activity Assay of a Novel Fusion Protein of Thrombopoietin and Interleukin-6 in Pichia pastoris，J.Biochem. 142, 17–24 (2007)3）Deng Ning, Xiang Junjian, Zhang Qing, et al. Production of recombinant humanized anti-HBsAg Fab antibody in Pichia pastoris by fermentation，Journal of Biochemistry and molecular Biology , 2005, 38(3): 293-2994）Xiang Junjian, Zhong Zhenyu, Deng Ning, et al. Screening antigen epitope of bFGF by phage display, Journal of Biochemistry and molecular Biology , 2005, 38(3):290-293 (邓宁通讯作者)5）Deng Ning, Xiang Junjian，Wang Xunzhang，et al. Expression, purification and characterization of humanized anti-HBs Fab fragment, J Biochemistry. 2003，134（6）：813-8176）邓宁，关⽂达，王宏，等. bFGF⼈源性抗体Fab段基因克隆及其在⼤肠杆菌中的表达，免疫学杂志，2007，23(6): 598-6017）王宏，陈丹，邓宁，向军俭，等. 重组⼈bFGF单克隆抗体可变区基因克隆及单链抗体的构建和表达. 细胞与分⼦免疫学杂志，2007，23（12）：1150-1153（邓宁通讯作者）8）向军俭，汤伟佳，王宏，邓宁，⼈噬菌体抗体库的构建及⼈源性抗bFGF抗体的筛选，免疫学杂志，2006，22（4）：451-454 (邓宁通讯作者)9）向军俭，秦艳芳，邓宁，王宏，杨红宇，bFGF mRNA、bFGF及FGFR1与神经胶质细胞恶性⾏为的相关性，中国免疫学杂志，2006，22（5）：440-44410）黄红亮，王宏，向军俭，唐勇，邓宁，bFGF反义硫代核苷酸增强⼈喉癌Hep2细胞的化疗敏感性。

人源抗Peroxiredoxin Ⅰ肺腺癌噬菌体抗体的制备及鉴定

人源抗Peroxiredoxin Ⅰ肺腺癌噬菌体抗体的制备及鉴定罗弋;庞华;李淑杰;曹辉;李少林;樊春波;王洁【摘要】目的构建人源噬菌体抗体库,从中筛选出抗Peroxiredoxin Ⅰ(Prx Ⅰ)肺腺癌人源单链抗体.方法提取肺癌患者癌旁淋巴结组织,通过RT-PCR扩增出重链可变区基因(V_H)和轻链可变区基因(V_L),再经剪切-重叠-延伸PCR(SOE-PeR)将V_H和V_L连接得剑单链抗体(ScFv);将双酶切后的ScFv基因片段克隆入噬菌体表达载体pCANTAB5E,得到初级噬菌体抗体库.PCR检测TG1中ScFv基因插入率;1%琼脂糖凝胶电泳鉴定SfiⅠ和NotⅠ双酶切质粒的结果;以肺腺癌细胞株D549及在肺癌中高表达的抗氧化蛋白PrxⅠ为靶抗原对抗体库进行筛选富集.将阳性克隆用IPTG诱导表达.用SDS-PAGE及Western blotting鉴定该抗体;用ELISA法、免疫细胞化学法鉴定该抗体与人肺腺癌细胞的结合特异性.结果成功构建噬菌体单链抗体库.ScFv基因插入率为77%,双酶切鉴定检测到目的条带.在亲和筛选过程中,肺癌单链抗体得到富集.收获率逐轮提高,第6轮为第1轮的180倍.随机选取10个克隆,通过ELISA法检测剑其中6个与A549细胞呈阳性反应,阳性率为60%.SDS-PAGE及Western blotting证实抗体得到可溶表达.ELISA及免疫细胞化学检测表明抗体能相对特异地与肺腺癌细胞结合.结论成功构建肺腺癌人源噬菌体抗体库,并从中筛选得到能相对特异地与高表达Prx Ⅰ的肺腺癌细胞D549结合的单链抗体.【期刊名称】《南方医科大学学报》【年(卷),期】2010(030)001【总页数】5页(P30-34)【关键词】噬菌体抗体库;单链抗体;Peroxiredoxin Ⅰ;肺腺癌【作者】罗弋;庞华;李淑杰;曹辉;李少林;樊春波;王洁【作者单位】重庆医科大学,放射医学教研室,重庆400016;重庆医科大学,附属第一医院核医学科,重庆400016;重庆医科大学,放射医学教研室,重庆400016;重庆医科大学,放射医学教研室,重庆400016;重庆医科大学,放射医学教研室,重庆400016;重庆医科大学,放射医学教研室,重庆400016;重庆医科大学,附属第一医院核医学科,重庆400016【正文语种】中文【中图分类】Q78肺癌是严重威胁人类健康的疾病。

邓宁简历

邓宁简历邓宁，博士，暨南大学生科院教授，博士生导师,暨南大学抗体工程研究中心副主任,细胞工程教研室主任，广东省免疫学会理事。

《中国生物工程杂志》、《暨南大学学报》杂志审稿专家。

主要学历和经历：1987年本科毕业于华中师范大学生物系，1993年硕士研究生毕业于华中师范大学昆虫学研究所，2003年博士毕业于中山大学生科院。

1987年至1990年，湖北三峡大学生物系教师，1993-2000年在湖北三峡大学医学院教师，2003-现在，暨南大学生科院教授。

主要研究方向：基因工程抗体与抗体药物，肿瘤多肽疫苗，肿瘤血管新生的分子机制。

近年来主要围绕抗体工程和肿瘤多肽疫苗的研究开展工作，开展了抗体库的构建、人源抗体的筛选、抗体亲和力成熟和抗体的人源化、抗体的高效表达和纯化，抗肿瘤作用的单克隆抗体的研究与开发，进一步开展抗体药物研究。

开展了抑制肿瘤血管新生的肿瘤多肽疫苗等研究。

建立了工程抗体的表达、纯化技术平台，实现了抗乙肝表面抗原Fab抗体在酵母的高效表达。

建立了抑制肿瘤血管生长的细胞模型和小鼠动物模型。

探讨了肿瘤多肽疫苗在肿瘤血管新生和抑制肿瘤生长转移的作用。

探讨肿瘤血管新生的分子机制及其与肿瘤发生发展的关系等。

科研项目和研究成果：主持了国家“863”专题课题、国家自然科学基金、教育部科学技术研究重点项目，广东省自然科学基金和广州市科技攻关重点等科研项目。

建立了人噬菌体抗体库，并筛选到抗bFGF人源性抗体。

探讨并阐明了bFGF单克隆抗体抑制肿瘤的作用，并构建了抗bFGF 人鼠嵌和抗体。

成功构建了具有较强免疫原性的抑制肿瘤生长的VEGF/bFGF多肽疫苗。

申报国家发明专利2项，在国内外学术期刊发表研究论文45篇。

参编教材《生物技术实验精选》（暨南大学出版社）。

指导本科学生挑战杯作品获广东省第九届挑战杯竞赛三等奖。

承担的《动物细胞工程》课程为校级精品课程。

近年发表的相关研究论文1）Ning Deng, Hong Wang, Junjian Xiang, et al. Construction of natural phage display library and the screening of anti-bFGF antibody，Journal of Immunology Mehtods, (in press)2）Hu Zhiyi, Lai Wenshan, Zhang Wenze, Deng Ning, et al. Secretion Expression and Activity Assay of a Novel Fusion Protein of Thrombopoietin and Interleukin-6 in Pichia pastoris，J.Biochem. 142, 17–24 (2007)3）Deng Ning, Xiang Junjian, Zhang Qing, et al. Production of recombinant humanized anti-HBsAg Fab antibody in Pichia pastoris by fermentation，Journal of Biochemistry and molecular Biology , 2005, 38(3): 293-2994）Xiang Junjian, Zhong Zhenyu, Deng Ning, et al. Screening antigen epitope of bFGF by phage display, Journal of Biochemistry and molecular Biology , 2005, 38(3):290-293 (邓宁通讯作者)5）Deng Ning, Xiang Junjian，Wang Xunzhang，et al. Expression, purification and characterization of humanized anti-HBs Fab fragment, J Biochemistry. 2003，134（6）：813-8176）邓宁，关文达，王宏，等. bFGF人源性抗体Fab段基因克隆及其在大肠杆菌中的表达，免疫学杂志，2007，23(6): 598-6017）王宏，陈丹，邓宁，向军俭，等. 重组人bFGF单克隆抗体可变区基因克隆及单链抗体的构建和表达. 细胞与分子免疫学杂志，2007，23（12）：1150-1153（邓宁通讯作者）8）向军俭，汤伟佳，王宏，邓宁，人噬菌体抗体库的构建及人源性抗bFGF抗体的筛选，免疫学杂志，2006，22（4）：451-454 (邓宁通讯作者)9）向军俭，秦艳芳，邓宁，王宏，杨红宇，bFGF mRNA、bFGF及FGFR1与神经胶质细胞恶性行为的相关性，中国免疫学杂志，2006，22（5）：440-44410）黄红亮，王宏，向军俭，唐勇，邓宁，bFGF反义硫代核苷酸增强人喉癌Hep2细胞的化疗敏感性。

人源性抗核抗体Fab片段抗体库的构建筛选及鉴定的开题报告

人源性抗核抗体Fab片段抗体库的构建筛选及鉴定的开题报告一、背景人类免疫球蛋白是一种在机体免疫防御过程中起重要作用的蛋白质，主要由四个多肽链组成：两个重链和两个轻链。

重链和轻链各自有不同的区域，其中即含有可与外来抗原结合形成免疫复合物的抗原结合部位（Fab片段），也称为抗原识别部位，同时重链和轻链之间的连接区域（Fc片段）可结合多种配体，包括细胞受体、补体蛋白等。

Fab片段与抗原的结合是通过氨基酸残基，如互补决定区（CDR）等进行特异性配对，因此将其提取并经过相应筛选后可对细胞表面的分子进行高效特异性识别，被广泛应用于临床诊断、药物开发等领域。

本研究旨在构建人源性抗核抗体Fab片段抗体库，并通过鉴定、筛选，获取能与抗核抗体特异结合的Fab片段抗体，为进一步研究自身免疫性疾病等相关领域提供有力支持。

二、研究内容及方法1.构建人源性抗核抗体Fab片段抗体库本实验将以人源性抗核抗体为模板，采用RT-PCR技术将其Fab片段DNA序列克隆到质粒载体中，将质粒从E.coli菌株中提取，再经过限制酶切和琼脂糖凝胶电泳等方法进行鉴定。

最后将合格的Fab片段DNA序列基因克隆到噬菌体抗体库质粒中构建成Fab片段抗体库。

2.进行Fab片段抗体筛选将构建好的Fab片段抗体库与靶抗原结合，经过洗涤、脱离、重复上述步骤，以免疫学实验技术如ELISA、Western blot等方法进行鉴定与筛选，最终获得能够对抗核抗体进行特异性结合的Fab片段抗体。

3.鉴定和验证Fab片段抗体对筛选出来的Fab片段抗体进行功能验证，在体内和体外中都可以使用，检测目标分子的表达水平和分布情况，验证其特异性和亲和力。

三、研究意义本研究将建立人源性抗核抗体Fab片段抗体库，厘清自身免疫性疾病的发生机理，有效提高诊断准确率，为药物研发提供新的靶标和研究思路，使得人类免疫球蛋白的应用领域更加广泛。

生物技术名词解释

生物技术：是以生命科‎学为基础，利用生物体‎的特性和功‎能，设计构建有‎预期性状的‎新产品，与工程结合‎，对这些新产‎品加工的技‎术体系。

生物技术制‎药：采用现代生‎物技术，借助某些微‎生物、植物、动物生产医‎药品。

生物药物：是指采用生‎物学、医学、生物化学等‎研究成果，从生物体、生物组织、细胞、体液等，综合利用物‎理学、化学、生物化学、生物技术、药学等学科‎的原理和方‎法制造的一‎类用于预防‎、治疗和诊断‎的制品。

生物技术药‎物：采用DNA‎重组技术或‎其他生物新‎技术研制的‎蛋白质或核‎酸类药物。

逆转录法：是先分离纯‎化目的基因‎的mRNA‎，再反转录成‎c DNA，然后进行c‎D NA的克‎隆表达。

结果不稳定‎：外源基因从‎质粒上丢失‎或碱基重排‎、缺失所致工‎程菌性能的‎改变。

分裂不稳定‎（质粒逃逸）：指工程菌分‎裂时出现一‎定比例不含‎质粒子代菌‎的现象。

（质粒不稳定‎（逃逸率）：指工程菌分‎裂时出现一‎定比例不含‎质粒的工程‎菌现象。

）是将抗体产‎生细胞与具‎有无限增殖‎能力的骨髓‎瘤细胞相融‎合，通过有限稀‎释法单克隆抗体‎：及克隆‎化使杂交瘤‎细胞成为纯‎一的单克隆‎细胞系而产‎生的。

克隆化：是指单个细‎胞通过无性‎繁殖而获得‎细胞集团的‎整个培养过‎程。

人鼠嵌合抗‎体：在基因水平‎上将鼠源单‎抗的H和L链可变‎区基因分离‎出来，分别与人I‎g 的H 和L链的稳‎定区（C）基因连接成‎人-鼠嵌合抗体‎的H和L链基因‎，再共转染骨‎髓瘤细胞，就能表达完‎整人-鼠嵌合抗体‎。

双功能抗体‎：又称双特性‎抗体，是一种非天‎然性抗体。

其结合抗原‎的两个臂具‎有不同的特‎异性。

原代培养：是指直接从‎有机体获得‎的组织或将‎其分散成细‎胞后开始的‎培养。

接触抑制现‎象：多数二倍体‎细胞均需基‎质贴附，每个细胞与‎其周围细胞‎相互接触时‎，细胞就停止‎生长，若有充足营‎养，细胞仍可存‎活一段时间‎，但数量不增‎加。

噬菌体展示肽库的筛选方法及其应用

噬菌体展示肽库的筛选方法及其应用1985年,SmithGP利用基因工程手段将一段外源肽序列展示在丝状噬菌体的表面[1]。

1988年[2]他们又将合成的随机序列的寡核苷酸片段克隆到丝状噬菌体,表达后每个噬菌体粒子的表面展示一种肽段,所有这些展示不同肽段的噬菌体构成了噬菌体展示肽库。

1990年,他们通过亲合筛选,得到了与特定蛋白结合的结合肽,并由于噬菌体表达的肽与编码基因直接相关,扩增和分离目的克隆后,很容易得到其DNA序列[3]。

这样就建立了噬菌体表面展示的随机肽库技术,这项技术一经产生就显示其无与伦比的生命力,被广泛用于生命科学的各个领域,并带来广泛而深远的影响。

传统的药物筛选大多数是从自然界的动、植物及微生物中分离天然的具有特定药理作用的化学物质,然后直接应用或再以此作为药物化学的先导化合物,再进一步设计、加工、合成,筛选有效的功能药物。

此方法具有一定的盲目性,筛选周期长。

而采用分子进化工程技术则会大大加速这一过程。

根据所需要的药物特性,选用适当的方法构建含有大量异质性分子的组合库,用靶分子进行筛选,先筛选药物先导化合物,然后进一步优化设计,最终确定候选的药物结构。

近年来,引入组合策略和模拟进化思想,建立了一种从噬菌体随机肽库中筛选药物先导化合物的新方法[4],即用库容量极大的随机肽库去快速筛选具有较高特异性和亲和力的理想目的肽。

通过此种方法可以快速筛选生物活性肽、蛋白质、受体及其他化合物等新型药物或先导化合物。

这一方法具有传统的药物筛选无法比拟的优越性,将药物开发带入了一个崭新的时代。

1噬菌体展示系统的建立早在1986年Geysen就认为含有关键残基的短肽能够模拟蛋白质上的决定族。

在多数情况下,几个关键残基与它的结合分子所形成的非共价键构成了全部结合的主要部分,即蛋白质之间的相互作用或识别是通过局部残基肽段间的相互作用来实现的。

1982年,Dulbecco提出将病原体的免疫原与λ噬菌体和其他病毒的衣壳蛋白融合,便可产生能够用作疫苗的表面展示外来多肽的病毒颗粒。

噬菌体库的筛选原理

噬菌体库的筛选原理
噬菌体库（phage library）是一种用于筛选特定目标的噬菌体（phage）的方法。

其筛选原理如下：
1. 构建噬菌体库：从已知的DNA或RNA样品中，随机将目标序列片段插入噬菌体的基因组中，并将这些基因组片段包裹在噬菌体的外壳中。

构建好的噬菌体库含有许多噬菌体，每个噬菌体携带着不同的目标序列片段。

2. 筛选目标：将噬菌体库与特定靶点进行反应，例如与靶蛋白质结合。

未结合的噬菌体可以被洗去，而与靶点结合的噬菌体则保留下来。

3. 提取目标噬菌体：将与靶点结合的噬菌体进行扩增，使其数量增加。

通常使用大肠杆菌等宿主细胞进行扩增。

4. 再次筛选：将扩增后的目标噬菌体再次与靶点进行反应和洗脱，以进一步筛选出特异性更高的噬菌体。

5. 验证筛选结果：对所得的单个目标噬菌体进行验证，确认其与靶点的结合能力和特异性。

噬菌体库筛选原理的核心是利用噬菌体随机插入外源基因的特点，通过与目标分子结合的能力将其筛选出来。

这种方法被广泛应用于蛋白质相互作用、抗体产生
和蛋白质工程等领域。

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）抗体的自身免疫病患者外周血淋巴细胞为材料，构建人后逆转录得到，进行进一，经轮筛选特异结合的抗中，将重组噬菌粒载体电转化大肠杆菌的抗体克隆，并用构建的人源噬菌体抗体库库容为抗体库，并能够从中筛选出与
噬菌体抗体库，并从中筛选抗扩增重链
收集自身免疫病患者外周血，提取淋巴细胞总轮固相筛选，获得能结合
因子免疫原性的研究［］基础医学与临床，
自身免疫性疾病患者血
自身抗体的检测［］细胞与分子免疫学北京：北京医科
大学出版社，
结合活性，挑选特异性最好的本实验室完成了建的抗体库为人源性
一步的测序鉴定及亲和力分析。单克隆抗体研制，重组牛
，，（）：患者自身抗体单链噬菌［］［］康向东，陈顺乐，鲍春德，（）：［］田学军，寿成超，董志伟抗［［子生物学报，版社，］高：磊，等人源性抗，（）：抗原的人源抗体人源噬菌体抗体库的构建及抗体的初步筛选分析［］中国生物化学与分，（）：重组抗体［］北京：科学出
嵌合抗体的构建及其在动物细胞中表达，所构抗体的研制、以及用该抗体开展矽肺和肿瘤的病理和治疗研究奠定了基础；而且，针对自身免疫疾病患者淋巴细胞抗体库的构建，还为进一步利用这些抗体筛选自身免疫疾病相关基因及其功能研究提供了有效库源。这将有利于自身免疫性疾病研究，如分析自身抗原的表位结构；通过它了解机体免疫反应状况，以便为疫苗设计和了解发病机制提供依据。［参考文献］
落，获得的抗体库的库容为
的结合活性（表）。挑选特异性最好的、及
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讨论
噬菌体抗体库技术是通过重链和轻链将全套人抗体
区基因克隆出来，并在噬菌体表面表
达、分泌，经筛选后获得的特异性抗体。通过噬菌体展示的方法已经得到多种不同的抗体，如抗和抗
免疫学杂志［文章编号］（
第
卷）
第
期
年
月
・
・
人噬菌体抗体库的构建及人源性
向军俭，汤伟佳，王
［摘第一链，经以辅助噬菌体获得具有体克隆，为［关键词］［中图分类号］要］目的
抗体的筛选
）
宏，邓
宁! ，杨红宇（暨南大学分子免疫学与抗体工程研究中心，广州
选用含高效价碱性成纤维细胞生长因子（抗体克隆。方法段和轻链基因，分别构建到噬菌粒载体噬菌体抗体克隆。结果
。合成（表）
段基因的引物
（（（（（（ " " （ " " " " （（（ !） !） !）））（）（ !）（
!） !） !） !）
体库活化，测定克隆形成单位（筛选。按相同方法进行噬菌体抗体的鉴定及筛选筛选获得的阳性克隆，接种于含培养液中，培养至
［次免疫应答的抗体相当］
的特异结合活性。结果显示，在稀释度为体原始呈现库具有抗体。抗体的筛选与鉴定百分率，结果显示，第第
表
倍以上，说明构建的噬菌特异性，能够从中筛选到抗经过轮噬菌体展
的大容）
示筛选，计数所获的噬菌体数量（表），并计算产出轮洗脱下来的噬菌体效价为特异性抗体的轮的倍，说明携带有抗
［］获得高特异性和高亲和力的抗体。国内外已有构
事免疫学、动物细胞工程和抗体工程等方面的研究。（）；（）
! 通讯作者
建自身免疫疾病天然抗体库的研究报道，并从中筛
・
・
，］
免疫学杂志
第
卷
［选到高特异性、高亲和力的抗体
量蛋白（天为时代）；淋巴细胞分离液（上海恒信化学试剂有限公司）；质粒提取试剂盒及试剂盒（索硬化症（）。提取和）、和体的自身免疫病病人外周血液分离淋巴细胞。按总述步骤提取总成第一链参考文献［
表
分别抽取肌萎缩侧等含有高效价抗组约，用淋巴细胞分离提取试剂盒说明书所（及）为引物逆转录合家族特异性引物序列
稀释板上长出
第
期
向军俭，等
人噬菌体抗体库的构建及人源性
抗体的筛选
・
・
分别经。在
!
连接，然后转化 ! 双酶切，倍稀释的平皿上长出个左右菌。
经过
轮淘筛后，随机挑取
个单克隆，超感法检测其与个阳性
染制备噬菌体抗体上清液，用克隆（鉴定。
表噬菌体抗体与人重组
超感染，构建人噬菌体抗体库。经过特异性的噬菌体抗体克隆。结论
步鉴定及筛选，获得具有高亲和力的抗抗体药物研究奠定基础。
构建了人噬菌体
抗体；噬菌体展示；抗体库；［文献标识码］
，，
［］
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碱性成纤维细胞生长因子（，）是成纤维细胞生长因子家族的重要成能促进肿瘤血管的新生、
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助噬菌体进行活化富集噬菌体。富集的各个噬菌体克隆采用重组鼠抗方法进行特异性鉴定，每孔包被人，加抗体显色。 # 噬菌体抗体，标记的
!）
结果
轻重链片段的扩增物进行变段。扩增。各取用表产物所列引
# 进行琼脂糖凝胶电泳（图、图）。扩增出碱基长度约为的轻链基因片段和重链抗体库的构建化产物分别经电转化容为段。与 "链纯将载体
按轻链同 !和 ! 双酶切，样的方法进行连接，电转化，细菌扩增。呈现原始库的特异性鉴定呈现原始库与人重组碳酸盐包被缓冲液过夜后封闭，加孵育。参照文献［］将人重）稀释至封闭后加入，液洗），以轮洗次，每次碳酸氢钠（板；次，第稀释孔，置，二抗为羊抗鼠，一抗为鼠抗夹心法检测噬菌体稀释的噬菌体原始库，的
噬菌体抗体库的筛选用，包被次（第轮洗
初级噬菌体抗体库，孵育
。以
，具体方法按说明书进行。引物设计］提供的
扩增人抗体
中和缓冲液调节至中 # 洗脱液回收噬菌体，性，感染对数生长期的进行富集。转入三角瓶后补加（含（振荡培养和）平皿，滴。振荡培养至进行噬菌体抗）后进行下一轮挑取株经的，加入辅轮轮淘选。 # 和 # 涂定洗脱下来的噬菌体，其余的于加入，加入约培养基，），取
。因此，本研究
转化感受态培养基，比稀释后铺液体培养基［含中，到"基因库分别用噬菌体的结合，每孔加
细菌，电转化后迅速加入振荡培养，取 # 经平板检测库容，余下接入四环素（。链），倍倍］
选用含有高效价的抗体，为
抗体的自身免疫病患者的外抗体药物研究奠定基础。
［］。易地筛选到特异性强的高亲和力抗体
噬菌体得到了较好的富集。
筛选对噬菌体抗体的富集效应
・
・在构建了抗
免疫学杂志
第［］，，（）：剑
卷
噬菌体原始呈现库的鸿智，林（）：［］向军俭，漆秋兰，邓清中抗杂志，［］董志伟，王［］，，（）：琰抗体工程［］：，， !" #$ 版宁，等
础上，以行了
作为靶抗原，对
轮 “吸附洗脱扩增” 的淘选富集。通过测定倍的富集，表明轮富集后的库中挑取对个的
重组牛碱性成纤维细胞生长，
各级库的滴度和洗脱下来的噬菌体的产出率，计算噬菌体抗体库得到了约了淘选富集作用。从单克隆加体。以所构建的噬菌体抗体库表面呈现抗体的噬菌体起到超感染制备上清液即为噬菌体抗方法进行初步鉴定，检测其与个阳性克隆，用于进
而抗
抗体高表达的自身免疫病患者的抗体基
［基金项目］国家自然科学基金（（）资助
因，所构建的抗体库具有较高的
［作者简介］向军俭（
），男，江西瑞昌市人，教授，硕士，主要从
抗体重轻链基因已经特异拼接和重排，因而，建立的自身免疫病的人源性抗体库较天然抗体库更有利于
的反应条件为：性，退火，扩增碱基长度约为载体质粒分别用
预变性延伸轻链
，
，个循环。纯化产物及
的轻链基因片段和
噬菌体抗体库的构建
回收后连接， !和 ! 双酶切、，倍倍比稀释铺平皿，其中在个菌落，从而计算出轻链的库和扩增的重链片段。