突变型与野生型TNF

突变型与野生型TNF
【关键词】 ,肿瘤
Apoptosis of tumor cells induced by mutant and wild type TNFα【Abstract】 AIM: To pare the apoptosisinduced ability of rebinant human mutant type 471 rhTNFα(mt 471rhTNFα) with that of wild type rhTNFα (wt rhTNFα) and to study the apoptotic mechanism induced by mt 471rhTNFα. METHODS: The apoptosis of ZR751 cells, a breast cancer cell line, induced by mt 471rhTNFαor wt rhTNFαwas analyzed and pared by 20 g/L agarose gel electrophoresis and flow cytometry techniques. The activation profiles of nuclear factor NFκB in ZR751 cells untreated and treated by mt 471rhTNFα or wt rhTNFα were detected using Trans AMTM NFκ B p65 kit based on ELISA for further study of the apoptotic mechanism induced by mt 471rhTNFα. RESULTS: The results from 20 g/L agarose gel electrophoresis of genomic DNA indicated that ZR751 cells treated by mt 471rhTNFα provided a typical apoptotic ladder pattern of DNA fragmentation, whereas weakened ladders were observed in ZR751 cells treated by wt rhTNFα. Flow cytometry showed that the cell apoptotic rate in mt 471rhTNFα treated group was 43%, but 25% in wt rhTNFαtreated group. The mt 471rhTNFαheld a strong apoptosisinducible ability. The results of DNAbinding activity of NFκ B showed that NFκB activation induced by wt rhTNFαwas significantly higher than that of mt 471rhTNFαwhen the protein concentration of mt 471rhTNFαor wt rhTNFαreached 50 μg/L (P=). CONCLUSION: The apoptosisinduced ability of mt 471rhTNFα
is superior to that of wt rhTNFα. One of the possible reasons for the enhanced apoptosisinduced ability may be that NFκ B activation is inhibited in tumor cells treated with mt 471rhTNFα.
【Keywords】 neoplasms; mutant type 471rhTNFα; wild type
rhTNFα; NFkappaB; apoptosis
【摘要】目的：比较重组人突变型471rhTNFα（mt 471rhTNFα）与
野生型rhTNFα（wt rhTNFα）诱导肿瘤细胞发生凋亡的能力，并对mt 471rhTNFα
诱导肿瘤细胞发生凋亡的作用机制进行初步研究. 方法：以乳腺癌细胞系
ZR751细胞为靶细胞，应用基因组DNA琼脂糖凝胶电泳及流式细胞技术分析mt
471rhTNFα与wt rhTNFα诱导肿瘤细胞凋亡的情况；利用以ELISA为基础的Trans AMTM NFκ B p65试剂盒检测经mt 471rhTNFα或wt rhTNFα处理的ZR751细胞核因子NFκB的活化情况，以便对其诱导凋亡的机制进行初步的研究. 结果：20 g/L琼脂糖凝胶电泳显示，mt 471rhTNFα处理组的ZR751细胞基因组DNA
呈现明显的ladder状分布，wt rhTNFα处理组的“ladder”条带明显减弱；流式细胞仪分析显示，mt 471rhTNFα诱导的细胞凋亡峰面积高于wt rhTNFα处
理组. NFκB活化检测结果显示，当两型rhTNFα浓度增高到50 μg/L时，wt rhTNFα处理组的NFκB的活化量明显高于同浓度的mt 471rhTNFα处理组
（P=）. 结论： mt 471rhTNFα诱导肿瘤细胞凋亡的能力明显优于wt rhTNFα；肿瘤细胞内NFκB活化明显受抑是mt 471rhTNFα诱导凋亡能力增强的主要原因之一.
【关键词】肿瘤；突变型471rhTNFα；野生型rhTNFα； NFκB；细胞凋亡
0引言
人肿瘤坏死因子α（tumor necrosis factor alpha, TNFα），主要由巨
噬细胞产生，是具有多种生物学活性的细胞因子. mt 471rhTNFα是删除wt TNFαN端的7个氨基酸，并将Pro8Ser9Asp10置换为Arg8Lys9Arg10［1］的突变体. 这种突变并不改变TNFα分子的高级结构，仍然形成具有生物活性状态的三聚体，抗肿瘤作用增强且毒副作用降低，极具开发价值. 我们在获得mt 471rhTNFα重组蛋白的基础上［2-4］，进行新的研究，为mt 471rhTNFα的临
床前研究提供实验依据.
1材料和方法
材料
两种基因工程蛋白在大肠杆菌DH5α中进行表达，初步检测具有良好的生物学活性. 乳腺癌细胞系（ZR751）为本室保存. 细胞培养基RPMI1640系GIBCO BRL产品，FCS购自杭州四季青生物技术公司. Trans AMTM NFκ B p65 Kit由晶美生物工程有限公司提供. 胞核蛋白与细胞浆蛋白抽提试剂盒由碧云天
生物技术研究所提供.
方法
确定mt 471rhTNFα与wt rhTNFα浓度蛋白溶解液溶解冷冻干燥蛋白，按1∶100稀释，测定280 nm和260 nm下的A值，确定蛋白的浓度；另取10 μL 加等体积2×蛋白电泳载样液，行150 g/L SDSPAGE凝胶电泳，BackMan光密
度扫描仪进行薄层扫描，以确定目的蛋白的含量.
两型rhTNFα诱导细胞凋亡复苏ZR751细胞，传代培养至对数生长期，胰蛋白酶消化，Hank’s液终止消化，收集细胞，并调整细胞数至2×108/L. 将细胞分为3组，即ZR751对照组、wt rhTNFα和mt 471rhTNFα处理组. 培养基中放线菌素D的终浓度为μg/L，样品终浓度为 mg/L，于加药后12 h收集细胞. 将细胞分为两部分，一部分用于20 g/L琼脂糖凝胶电泳检测基因组DNA，另一部分用于流式细胞分析，以PBS洗涤细胞，RNase降解RNA, 700 mL/L乙醇固定，待用. 检测时，PBS洗涤以弃除700 mL/L乙醇，空干，碘化丙啶（PI）避光染色15 min以上. PBS洗涤后，将细胞重新悬于1 mL PBS中，用EPICS ELITE, COULTER, USA型流式细胞仪分析比较两型TNFα诱导细胞凋亡的情况.
核蛋白的提取并定量按的处理方法复苏并传代ZR751细胞，但样品终浓度分别为10 μg/L和50 μg/L，作用4 h后收集细胞，分别提取各实验组的细胞核蛋白质，操作按试剂盒说明书进行，即：用PBS洗涤细胞，20 μL细胞沉淀加入200 μL细胞浆蛋白抽提试剂，振荡5 s将细胞沉淀充分悬浮，加细胞浆蛋白抽提试剂B 10 μL. 高速振荡5 s，冰浴1 min. 4 ℃, 12～16 kg,离心5 min，吸取上清至预冷的塑料管中，即为细胞浆蛋白.在沉淀中加入50μL细胞核蛋白抽提试剂，剧烈振荡15~30 s，把沉淀完全悬浮. 冰浴，每隔1~2 min再高速剧烈振荡15~30 s，共30 min. 4℃, 12～16 kg,离心10 min，吸取上清至预冷的塑料管中，即为细胞核蛋白，紫外分光光度计下进行蛋白定量，-70℃冻存.
基于ELISA法的NFκB活性检测操作按照Trans AMTM NFκ B p65试剂盒说明书进行，简介如下：加入3 μg的细胞核蛋白抽提物，室温孵育1 h，期间温和摇动96孔板，使之均匀地结合；用200 μL的洗涤buffer洗涤3次，加入100 μL 以1∶1000稀释的NFκB抗体，勿摇动，室温下孵育1 h；用200 μL 的洗涤buffer洗涤3次，加入100 μL 以1∶1000稀释的辣根过氧化物酶聚合的二抗，室温下孵育1 h；用200 μL 的洗涤buffer洗涤4次，室温下每孔中加入100 μL的展呈液，及时观察颜色的变化，直到培养基的颜色变为深蓝色时加入100 μL 的终止液，遇酸时，蓝色变为黄色，测定450 nm下的A值. 利用试剂盒中提供的突变寡核苷酸进行NFκB特异性结合为对照.
统计学处理：以SPSS 软件进行统计学分析，两实验组NFκB的活性检测分析采用t检验，P<认为有统计学差异.
2结果
471rhTNFα与野生型rhTNFα的浓度由两样品的SDSPAGE结果及BackMan 光密度扫描仪薄层扫描结果可知，目的蛋白的纯度为%和%；紫外分光光度法测定A280 nm和A260 nm吸光度值，可知wt rhTNFα蛋白的产量为 g/L, mt 471rhTNFα
蛋白的产量为 g/L.
诱导ZR751细胞凋亡的检测ZR751细胞在含有放线菌素D的培养液中，在mt 471rhTNFα与wt rhTNFα处理组中，分别加入10 μg/L的mt 471rhTNFα
与wt rhTNFα，分别经两样本作用12 h后，进行细胞基因组DNA 20 g/L琼脂
糖凝胶电泳. mt 471rhTNFα组的细胞基因组DNA降解成不同倍数的180~200 bp 大小的片段，呈现明显的ladder状分布（Fig 1）.
流式细胞仪检测ZR751细胞凋亡与对照组相比，虽然两实验组均有凋亡峰出现，但mt 471rhTNFα诱导的凋亡峰面积占43%，wt rhTNFα诱导凋亡峰面积占25%, mt 471rhTNFα诱导的凋亡峰面积高于同浓度wt rhTNFα诱导组，对照组未见凋亡峰.
不同实验组ZR751中的NFκB活性实验中，我们选择了不同的TNFα浓度处理ZR751细胞，实验结果可知(n=3)当两型rhTNFα以浓度为10 μg/L作用于ZR751细胞4 h后，与对照组A均值±相比，wt rhTNFα和mt 471rhTNFα处理组的NFκB活化均有增加，其A均值分别为±和±, wt rhTNFα处理组的NFκB 活化增加量高于mt 471rhTNFα处理组（t=, P=）；当两型TNFα浓度增高到50 μg/L时，wt rhTNFα处理组的增加量明显增多其A均值为(±)，而mt
471rhTNFα处理组仅有轻度升高，A均值为(±)，两实验组间有显著差异（t=, P=）；当样品的浓度为100 μg/L时，特别是mt 471rhTNFα处理组的细胞有明显的死亡，未见到明显的NFκB活性改变；此外，两个实验组均未见到NFκB活化量随TNFα作用时间的延长而增加，在一定浓度范围的TNFα作用下，细胞NFκB
的活化有剂量依赖性.
3讨论
我们在获得高纯度和高活性mt 471rhTNFα的基础上，对两型TNFα诱导肿瘤细胞凋亡的能力及相关机制进行了初步比较研究. 研究发现，mt
471rhTNFα杀伤肿瘤细胞的作用是通过诱导肿瘤细胞发生凋亡实现的，与wt rhTNFα相比，mt 471rhTNFα诱导ZR751细胞发生凋亡的作用明显增强. 分析mt 471rhTNFα诱导凋亡能力增强的主要因素可能与以下因素有关：首先，TNFα
作用于不同亚型的受体（TNFR1和TNFR2）可以激活不同的信号传导途径. 已有的研究报道mt 471rhTNFα由于在N端进行了缺失突变和氨基酸置换，与TNFR1的亲和力显著提高，对TNFR2的亲和力降低［1］. 存在于大部分细胞表面的TNFR1是一个含有死亡域（death domain）的受体，接头蛋白TNFRⅠ相关死亡域蛋白（TRADD）与TNFR1分子的胞内死亡域部分相结合，而TRADD随后又引起的另一个接头蛋白Fas相关死亡域蛋白（FADD）的招募，因此形成了诱导凋亡的信号传导复合物，此复合物通过caspase8的活化启动了凋亡. 其次，主要表达在髓性
细胞和受刺激的T或B淋巴细胞表面的TNFR2，可以激活NFκB，具有抗凋亡的作用并引起全身毒
副作用［5,6］. 为了进一步分析本实验中肿瘤细胞的凋亡是否与NFκB的活化有关，我们采用TRANSAM NFκB转录因子测定试剂盒，此法较凝胶分析更为灵敏，它是以ELISA为基础，将NFκB的p65亚单位结合位点的共有序列，即
5′GGGACTTTCC3′包被于96孔板上，细胞核蛋白中转录因子NFκB的活化形式能够与此寡核苷酸特异性结合，而识别转录因子的一抗则与转录因子结合，再用抗IgG偶联物和显色反应，容易得到定量的结果. 实验中，wt rhTNFα处理组的NFκB的活化量显著高于mt 471rhTNFα处理组，此结果证实了mt 471rhTNFα与TNFR2的结合力降低，使NFkB的活化受到抑制这一设想. wt rhTNFα在与TNFR1或TNFR2结合时并没有明显的选择性，它与受体结合后不仅介导凋亡信号的发生，同时也具有部分活化NFkB的作用，因此，wt rhTNFα只可以引起轻微的凋亡；而mt 471rhTNFα与TNFR2的亲和力降低，造成NFκB的活化量明显减少，引起大量的靶细胞发生凋亡，因此mt 471rhTNFα可能具有更强的抗肿瘤作用. 研究认为，NFκB是一种广泛分布的多效性的核因子［7,8］，它可以调节一些编码细胞因子、细胞黏附分子和生长因子的基因表达［9］，为大部分肿瘤细胞提供有重要意义的生存蛋白，如IAP家族、survivin蛋白等；激活凋亡抑制基因的转录，如cmyc，CD40L等，抑制了肿瘤细胞的凋亡而促进其生存. 目前，NFκB 已经成为人们密切关注的抗癌药物治疗的靶点. 我们推测mt 471rhTNFα是通过下调NFκB的抑凋亡能力，而拥有了相对较强的抑制细胞生长、诱导肿瘤细胞发生凋亡的能力. 值得注意的是细胞凋亡并不只是线性通路，而更可能存在凋亡信号分子相互影响的环性通路. 尤其是半胱天冬氨酸酶、线粒体膜Bcl2 家族以及细胞色素C 间存在的相互作用，使得上游分子和下游分子的凋亡信号可以呈环形级联放大，也可以由一些抑制凋亡的分子如 Bcl2 等阻断这种环形放大的级联效应，从而有效地抑制凋亡［10］. 因此，究竟mt 471rhTNFα是否存在其它诱导肿瘤凋亡的机制，有待于我们进一步的研究.
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