水貂犬瘟热活疫苗与水貂细小病毒性肠炎灭活疫苗制备及其联合免疫效果研究

水貂犬瘟热活疫苗与水貂细小病毒性肠炎灭活疫苗制备及其联
合免疫效果研究
罗国良;张洪亮;王振军;冯二凯;易立;郭利;程悦宁;程世鹏;王守富;王宏正
【摘要】制备了水貂犬瘟热活疫苗 (以下简称犬瘟活疫苗) 与水貂细小病毒性肠炎灭活疫苗 (以下简称肠炎灭活苗) 各3批, 通过半成品及成品检验结果显示, 生产的2种疫苗合格且生产工艺稳定.通过采用肠炎灭活苗稀释犬瘟活疫苗, 实现2种疫苗联合 (简称联合疫苗) 后, 体外接种Vero细胞, 采用专用稀释液稀释的犬瘟活疫苗作对照, 在25℃存放条件下, 5 h内两者的犬瘟热病毒含量无明显差异, 表明该方法对犬瘟热病毒的存活无明显影响.将联合疫苗免疫水貂10只, 犬瘟活疫苗、肠炎灭活苗分别免疫10只水貂作为单苗对照组, 免疫后21 d采血, 测定3组的抗体水平, 联合疫苗组的犬瘟热病毒中和抗体和细小病毒HI抗体分别与对应单苗的抗体水平无明显差异, 表明联合疫苗具有与单苗相当的免疫效力.该研究为进一步研发水貂犬瘟活疫苗与肠炎灭活苗联苗奠定了基础.%The study prepared 3 batches of mink canine distemper live vaccine and mink parvovirus inactivated vaccine respectively. The results of semi-finished products and finished products of vaccine showed that the two vaccines were qualified and the production process was stable. Vero cells were inoculated after the combination of two vaccines by the mink parvovirus enteritis inactivated vaccine to dilute the live vaccine of the canine distemper. The results indicated that the virus contents of live vaccine of the canine distemper which was diluted by the mink parvovirus enteritis inactivated vaccine (trial group) at 25℃, 5 h was not significantly different compared to the canine distemper live vaccine which was diluted by the special diluent (control
group). The combined vaccine immunized 10 minks, canine distemper vaccine and enteritis inactivated vaccine were immunized 10 minks as the control group, and the antibody levels of the three groups were determined until 21 days after immunization. The SN against CDV and the HI against MEV of the combined vaccine were not significantly different from that of the corresponding single vaccine, respectively. This study indicated that the combined vaccine has the same immune effect as the single vaccine. This trial establish basis for further studying the combined vaccine of mink canine distemper vaccine and mink parvovirus inactivated vaccine.
【期刊名称】《特产研究》
【年(卷),期】2019(041)001
【总页数】4页(P22-25)
【关键词】水貂犬瘟热活疫苗;水貂细小病毒性肠炎灭活疫苗;联合免疫
【作者】罗国良;张洪亮;王振军;冯二凯;易立;郭利;程悦宁;程世鹏;王守富;王宏正【作者单位】中国农业科学院特产研究所,长春 130112;长春西诺生物科技有限公司,长春 130012;中国农业科学院特产研究所,长春 130112;中国农业科学院特产研究所,长春 130112;中国农业科学院特产研究所,长春 130112;中国农业科学院特产研究所,长春 130112;中国农业科学院特产研究所,长春 130112;中国农业科学院特产研究所,长春 130112;吉林农业大学,长春 130118;长春西诺生物科技有限公司,长春 130012
【正文语种】中文
【中图分类】S852.4
水貂犬瘟热是引起水貂以双相热、白细胞减少、鼻炎和粘膜炎为特征的传染病[1]。

水貂病毒性肠炎是以出血和坏死、急剧下痢、白细胞高度减少为特征的急性病毒性传染病[2]。

2 种疾病均有较高的发病率和死亡率，是世界公认的危害水貂养殖业
较严重的传染病[3]，一旦发生，损失巨大。

疫苗免疫接种是目前预防这2种疾病
的最主要的方法。

目前，我国防治这2 种疾病的疫苗有水貂犬瘟热活疫苗、水貂
细小病毒性肠炎灭活疫苗以及水貂犬瘟热、细小病毒性肠炎二联活疫苗。

联苗具有“一针多防”、减少免疫次数、提高接种效率等优点，联苗方式一般为活疫苗与活疫苗联用或者为灭活疫苗与灭活疫苗联用，而活疫苗与灭活疫苗联用的情况在国内较少采用，在国外犬用多联疫苗中较多采用灭活疫苗组分稀释活疫苗组分的联用方法，该方法有效地实现了联苗中各组分的优势组合。

本研究采用新型的制苗工艺，灭活疫苗采用新型灭活工艺，通过接种细胞和免疫动物实验，评价2 种疫苗联合免疫的效力，为进一步研制开发水貂犬瘟热活疫苗与
细小病毒性肠炎灭活疫苗二联苗奠定基础。

1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 病毒与细胞水貂犬瘟热CDV3-CL 株、水貂细小病毒MEVB株（中国农业
科学院特产研究所特种动物病原与免疫团队保存）；F81 细胞、Vero细胞（中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库提供）。

1.1.2 主要试剂 MEM培养基、0.25%胰酶-EDTA消化液（Corning 公司）；2-溴乙胺氢溴酸盐（BEA）（Sigma-aldrich公司）；甲醛（国药集团）；其它试剂为
国产分析纯。

1.1.3 实验动物水貂购自农业部长白山野生生物资源重点野外科学观测试验站，2～3月龄，雌、雄随机，体况健康且未免疫水貂犬瘟热疫苗和水貂细小病毒性肠炎疫苗，免疫前经采血检测，犬瘟热病毒中和抗体和水貂细小病毒HI 抗体均为阴性。

1.2 方法
1.2.1 水貂犬瘟热活疫苗制备与检验将CDV3-CL株用含MEM的细胞维持液作适当稀释，按5%的比例接种于长成良好单层的Vero细胞转瓶，37 ℃吸附1 h，加入含2%新生牛血清的细胞维持液，35 ℃旋转培养，细胞病变（CPE）达到80%以上时收获，20℃冻结，冻融后即为半成品。

取样检验无菌合格且病毒含量
≥105.70TCID50/mL 的半成品作为制苗用病毒液。

将检验合格的病毒液与明胶蔗糖冻干保护剂按适宜比例混合，同时用0.1 mol/L 的NaHCO3 调pH 值7.4，充分混合，定量分装至100 mL玻璃冻干瓶内，冻干机冻干，冻干后轧盖。

按以上方法制备3 批疫苗，进行性状、无菌检验、支原体检验、鉴别检验、外源病毒检验、真空度、水分测定以及效检和安检。

1.2.2 水貂细小病毒性肠炎灭活疫苗制备与检验将MEVB 株按1%的比例接种于F81 细胞悬液转瓶中。

35 ℃旋转培养，当细胞CPE达到80%以上时收获，20℃冻结，冻融后即成半成品，取样检验无菌合格且病毒含量≥106.00TCID50/mL的半成品作为制苗用病毒液。

将病毒液用0.002 mol/L 二乙烯亚胺（BEI）灭活24 h，灭活后加入BEI 使用量的10%的1 mol/L 硫代硫酸钠中和BEI。

灭活检验合格后，按病毒液∶氢氧化铝胶=9∶1的比例制成水貂细小病毒灭活疫苗。

按以上方法制备3批疫苗，进行性状、装量、无菌、效检和安检。

1.2.3 水貂犬瘟热活疫苗与细小病毒性肠炎灭活疫苗联合及联合后犬瘟热病毒含量的测定在相同头份数情况下，使用专用稀释针头将水貂细小病毒性肠炎灭活疫苗
吸入犬瘟热活疫苗冻干瓶内，将该状态下产品组合称之为水貂犬瘟热、肠炎联合疫苗（以下简称联合疫苗）。

将联合疫苗与同批次专用稀释液稀释的对照疫苗，分别置25 ℃条件下5 h，每小
时取样1 次，将样品10 倍系列稀释，接种长成单层的Vero 细胞培养板，测定两种疫苗中犬瘟热病毒含量。

1.2.4 联合疫苗免疫试验犬瘟热病毒中和抗体和细小病毒HI抗体均为阴性的水貂30 只，分为3 组，每组10 只。

联合疫苗组免疫联合疫苗，每只水貂免疫各1头份，犬瘟单苗组免疫水貂犬瘟热活疫苗，每只水貂免疫1 头份，肠炎单苗组免疫
水貂细小病毒性肠炎灭活疫苗，每只水貂免疫1 头份。

免疫后21 d，采血分离血清，联合疫苗组测定犬瘟热病毒中和抗体和细小病毒HI 抗体，犬瘟疫苗组测定犬瘟热病毒中和抗体，肠炎苗组测定水貂细小病毒HI 抗体。

2 结果
2.1 水貂犬瘟热活疫苗制备与检验结果
3 批水貂犬瘟热活疫苗半成品均合格，病毒含量均在105.70TCID50/mL 标准之上，且无明显的批间差异。

成品进行性状检验、无菌检验、支原体检验、外源病毒检验、鉴别检验、剩余水分和真空度测定结果均符合现行《中国兽药典》规定。

3 批成品对水貂安全，病毒含量为104.50～104.70TCID50/mL，均符合产品质量标准
（≥103.50TCID50/mL）。

见表1、表2。

表1 水貂犬瘟热活疫苗半成品检验结果Table 1 Results of semi-finished product test of mink distemper vaccine,live批次 Batches 病毒含量测定（TCID50/mL） Tissue Culture Infectious Dose 50 无菌检验 Sterility test 1 105.88 合格 Qualified 2 106.00 合格 Qualified 3 106.00 合格 Qualified
表2 水貂犬瘟热活疫苗成品安全检验和效力检验结果Table 2 Safety test and efficacy test results of mink distemper vaccine,live批次 Batches 规格
Specifications 安全检验 Safety test 病毒含量测定（TCID50/mL）Tissue Culture Infectious Dose 50 1 100 头份/瓶 5/5 水貂安全 5/5 Mink safety 104.50 2 100 头份/瓶 5/5 水貂安全 5/5 Mink safety 104.67 3 100 头份/瓶 5/5 水貂安全 5/5 Mink safety 104.70
2.2 水貂细小病毒性肠炎灭活疫苗制备与检验结果
3 批水貂细小病毒性肠炎灭活疫苗半成品无菌检验与灭活检验均合格，病毒含量为106.67～106.80TCID50/mL，均符合质量标准（≥106.00TCID50/mL）。

成品进行检验，性状、装量、无菌检验结果均符合要求，对水貂安全，HI 抗体效价为1∶128～1∶1 024，均符合质量标准（≥1∶32）。

见表3、表4。

表3 水貂细小病毒性肠炎灭活疫苗半成品检验结果Table 3 Results of semi-finished product test of mink parvovirus enteritis inactivated vaccine批次Batches 病毒含量测定（TCID50/mL）Tissue Culture Infectious Dose 50 无菌检验 Safety test 灭活检验 Inactivation test 1 106.80 合格 Qualified 合格Qualified 2 106.50 合格 Qualified 合格 Qualified 3 106.67 合格 Qualified 合格 Qualified
表4 水貂细小病毒性肠炎灭活疫苗成品安全检验和效力检验结果Table 4 Safety and efficacy test results of mink parvovirus enteritis inactivated vaccine批次 Batches 规格 Specifications 安全检验 Safety test 效力检验（HI 抗体检测）Efficacy test(HI)1 100 mL/瓶 5/5 水貂安全5/5 Mink safety 1∶512、1∶256、1∶128、1∶256、1∶1 024 2 100 mL/瓶 5/5 水貂安全 5/5 Mink safety
1∶128、1∶512、1∶256、1∶512、1∶512 3 100 mL/瓶 5/5 水貂安全 5/5 Mink safety 1∶256、1∶128、1∶512、1∶1 024、1∶512
2.3 联合疫苗的犬瘟热病毒含量测定
将联合疫苗组、犬瘟单苗组样品25 ℃条件下不同时间取样，测定的犬瘟热病毒含
量0～5 h 而略有下降（均下降100.30），但相同时间下两者的病毒含量无明显
差异。

见表5。

表5 水貂犬瘟热活疫苗与细小病毒性肠炎灭活疫苗联合后病毒含量结果Table 5 The TCID50 result of mink distemper vaccine live combined with parvovirus enteritis inactivated vaccine组别 Groups 时间（h） Time 犬瘟热
病毒含量（TCID50/mL） Tissue Culture Infectious Dose 50联合疫苗组Combined vaccine 0 104.50 1 104.50 2 104.43 3 104.33 4 104.33 5 104.20
续表5组别 Groups 时间（h） Time 犬瘟热病毒含量（TCID50/mL） Tissue Culture Infectious Dose 50犬瘟单苗组Mink distemper vaccine 0 104.50 1 104.43 2 104.43 3 104.33 4 104.20 5 104.20
2.4 联合疫苗动物免疫试验
联合疫苗组样品产生的犬瘟热中和抗体与犬瘟单苗组相比，两者无明显差异；联合疫苗组产生的水貂细小病毒HI 抗体与肠炎单苗组相比，两者亦无明显差异。

表6 联合疫苗免疫抗体结果组别 Groups犬瘟热病毒中和抗体 SN against CDV
水貂细小病毒HI 抗体 HI against MEV每只抗体值SN per mink平均值Average每只抗体值HI per min平均值Average联合疫苗组Combined vaccine 1∶51、1∶64、1∶64、1∶75、1∶81、1∶91、1∶91、1∶102、
1∶102、1∶128 1∶84.9 1∶128、1∶256、1∶256、1∶256、1∶256、1∶256、1∶512、1∶512、1∶1 024、1∶2 048 1:550.4犬瘟单苗组Mink distemper vaccine 1∶51、1∶64、1∶81、1∶81、1∶81、1∶91、1∶91、1∶91、1∶91、1∶102 1∶82.4 - -肠炎单苗组Mink enteritis vaccine - - 1∶128、1∶128、
1∶256、1∶256、1∶256、1∶256、1∶512、1∶512、1∶1 024、1∶2 048 1∶537.6
3 结论与分析
目前，采用灭活疫苗稀释活疫苗实现联苗的方式在国外犬用苗上较常用，如法国梅理亚生产的犬瘟热、腺病毒病、细小病毒病、副流感病毒2 型呼吸道感染症4 联
活疫苗-犬钩端螺旋体病、黄疸钩端螺旋体病2 价灭活疫苗；硕腾公司的犬瘟热、腺病毒2 型、副流感、细小病毒四联活疫苗-犬钩端螺旋体病（犬型、黄疸出血型）2 价灭活疫苗-犬冠状病毒病灭活疫苗。

能够实现灭活疫苗与活疫苗联用的前提条
件是灭活疫苗与活疫苗联合后对活疫苗中的病毒无灭活作用，两者一起免疫后不降低各自的免疫效果。

本研究中，在水貂细小病毒性肠炎灭活疫苗的制苗过程中，为了降低灭活剂的残留，优化了水貂细小病毒性肠炎的灭活工艺，采用BEI进行灭活，残留的BEI采用硫代硫酸钠进行中和，经检验水貂细小病毒灭活完全。

半成品和成品的各项检验指标均符合要求，成品效力检测抗体水平无明显差异，生产工艺稳定。

犬瘟热半成品、成品的检测指标亦表明，采用100mL 玻璃冻干瓶冻干的犬瘟热活疫苗的生产工艺稳定，成品病毒含量无明显差异（104.50～104.70TCID50/mL）；灭活疫苗组分对犬瘟热病毒无明显影响；犬瘟热病毒、细小病毒抗体水平与单苗相比均无明显影响。

参考文献
【相关文献】
[1]Appel MJ,Summers BA.Pathogenicity of morbilliviruses for terrestrial carnivores [J]. Veterinary Microbiology, 1995,44:187-191.
[2]王洋,胡博,马凡舒,等.水貂病毒性肠炎研究进展[J].特产研究,2016,38(3):67-71.
[3]易立.特种毛皮动物(水貂、狐、貉)主要传染病防控技术研究进展及发展趋势[C]//. 中国畜牧兽医
学会家畜传染病学分会、解放军军事医学科学院军事兽医研究所.中国畜牧兽医学会家畜传染病学
分会第八届全国会员代表大会暨第十五次学术研讨会论文集.北京:中国畜牧兽医学会,2013:2.。