浅谈哺乳动物乳腺生物反应器的研究现状及应用

浅谈哺乳动物乳腺生物反应器的研究现状及应用摘要：应用生产乳腺生物反应器可以获得高效、安全、足量的人类重组蛋白、药用蛋白及其目的蛋白为人类社会作出积极的贡献。本文在述乳腺生物反应器概念的基础上，介绍了乳腺生物反应器的原理及其应用，指出乳房生物反应器优缺点、存在的问题并展望了乳腺生物反应器前景。

关键词：哺乳动物; 乳腺生物反应器; 应用

自从1987年Gordon等报道以转基因小鼠的乳汁表达分泌人组织纤维酶原激活剂(tPA)以来。转基因动物的研究进入了一个新的发展时期, 成为生物技术研究中最具活力和产业化前景的热点研究领域。目前,研究对象已从家畜及试验动物扩展到了人;研究内容也从动物的育种扩展到生产药用珍稀蛋白[l, 2〕。其中以乳腺生物反应器生产有生物活性的多肤产品,是一种全新的生产模式,具有生物活性稳定、成本低、质量高、生产周期短、经济效益高等优点。本文就动物乳腺生物反应器的操作流程、应用、优点、存在的问题及其国内外研究进展和产业化现状作一综述。

1.动物乳腺生物反应器及其原理

动物乳腺生物反应器技术是指利用动物乳腺特异性表达的启动子元件构建转基因动物, 指导外源基因在乳腺中表达, 并从转基因动物的乳中获取重组蛋白。由于这一特异表达方式安全、可靠, 且不对家畜造成伤害, 因此转基因动物最理想的表达部位和表达场所以乳腺最佳。目前已成功的在绵羊、山羊乳腺中表达了人凝血因子IX、a ,抗胰蛋白酶和人尿激酶等。动物乳腺生物反应器技术是指利用动物乳腺特异性表达的启动子元件构建转基因动物,指导外源基因在乳腺中表达, 并从转基因动物的乳中获取重组蛋白。由于这一特异表达方式安全、可靠, 且不对家畜造成伤害,因此转基因动物最理想的表达部位和表达场所以乳腺最佳。目前已成功的在绵羊、山羊乳腺中表达了人凝血因子IX、a , 抗胰蛋白酶和人尿激酶等。泌生产目的产品进人乳中。

乳腺生物反应器成功的关键在于乳腺组织特异性表达载体构建的合理性和有效性, 这包括外源基因在活体动物乳叶中分泌表达, 表迭是否具消组织特异性, 表达水平及其蛋白是否具有全部的生物学活性目前, 国外一般采用各乳球蛋白(BLG)、酸性乳清蛋白(wAP)、俘一酪蛋白的启动子及部分内含子进行乳腺特异性

表达的调控;采用基因组DNA或小基因替代cDNA,以提高基因表达水平;采用YAC 携带大容量的外源基因和侧翼顺序,消除基因的位置效应图。另外还需要采用定点整合法,将外源基因定点整合在乳腺特异表达的区域,或在其启动子控制之下, 以便从大量的转基因动物中筛选出表达效率高的动物。

2.国内外研动物乳腺生物反应器究现状

2.1国内研究现状

我国对动物乳腺生物反应器的研究起步较早，上世纪80年代初，施履吉院士就提出了乳腺生物反应器的构想，并成功获得了表达乙肝病毒表面抗原的转基因兔子。1996年，国家正式投资进行动物乳腺生物反应器的研究，并将它列入“九五”、“863”计划重大项目，强化了资助和组织管理工作，积极支持我国科学家进行乳腺生物反应器的研究开发。1998年，上海儿童医学院遗传研究所的曾溢滔和黄淑浈等获得了能表达人血清白蛋白的转基因奶牛。2005年，李宁等在国际上首次利用体细胞克隆技术获得人乳铁蛋白基因和人"－乳清白蛋白转基因克隆牛；在国际上首次获得人岩藻糖转移酶转基因奶牛，并在其乳实现了高效表达Lewis抗原，还在世界上首次获得人溶菌酶转移酶转基因奶牛，这是我国第一次成功研制了具有商业开发前景的奶牛乳腺生物反应器。2007年，周兴等用收获的病毒上清转染妊娠期奶牛乳腺组织，产后奶样经纤维蛋白平板溶圈法检测蚓激酶活性，结果表明牛奶具有明显的纤溶活性，即蚓激酶基因已经整合到奶牛乳腺组织并能实现相对稳定的表达。2008年，吴湃等用筛选出活性最强的重组β－酪蛋白启动子，构建出了新型的高效重组奶牛乳腺定位表达载体。尽管我国在该项技术上取得了较大进展，但仍处于探索研究阶段。

2.2国外研究现状

自20世纪80年代末提出动物乳腺生物反应器的设想以来，国外在此方面的研究取得了突破性进展。1987年，Gordon首次成功地从转基因小鼠的乳汁中获得了人类组织型溶酶原激活剂(tpa)，此举开创了新的研究领域，随后各国展开了大量的研究。1990年，美国获得世界上第一头转基因公牛，该公牛可与非转基因母牛生产转基因后代，其1/4的后代母牛乳腺表达了人乳铁蛋白。Park等于2006年通过精子微注射受精卵获得了整合人重组促红细胞生成素的转基因猪，对F1代和F2代母猪的乳样进行分析表明，其氨基酸组成与商业化的重组促红细胞生成素完全

相同。Chan等通过反转录病毒感染技术获得了转基因奶牛。目前，国外已初步形成了以转基因动物乳腺组织为主要生产手段的医药产业。

3.国内应用开发现状

我国对动物乳腺生物反应器技术的研究起始于国家“七五”计划中设立的“动物个体表达系统”的研究项目, 其主要研究目标就是在动物乳腺中表达外源基因。目前已获得了转基因小鼠、鱼、鸡、兔和羊等有快速生长能力或抗病能力的畜(禽) 种系, 以及从乳腺生物反应器表达分泌的具有生物活性的蛋白产物。如复旦大学医学遗传研究所用转基因羊成功表达分泌人的凝血因子IX 9j中国科学院上海细胞生物学研究所利用山羊的俘乳球蛋白启动子连接人促红细胞生成素(EPO)基因, 构建成功了转基因表达载体, 并通过显微注射的方法获得了4只转基因阳性小鼠乒我国在转基因牛上的研究并不多, 但中科院发育研究所自1994年起就开展了用非病毒构件作体细胞转基因的研究。这一途径一旦可行即可转移至牛, 并将可能缩短其乳腺表达的时间。在基础研究领域, 阎喜军等将大鼠乳清酸蛋白(wAP)基因的上游调控序列与人促红细胞生成素基因组D N A融合, 构建了Pwqp一EPO—wAP3’乳腺特异性表达载体。扬州大学农学院陈国祥等克隆了绵羊的BLG基因组DNA ,上海市农科院畜牧研究所王建荣克隆了奶山羊的BLG基因及其侧翼顺序为进一步研究目的蛋白在乳腺中高效表达奠定了基础。我国虽然在此项目的研究上取得了一定成绩,但与国外先进水平相比,还有很大差距。主要是由于经济基础薄弱,科研资助力度太小,缺少研究基地,无法进行大规模试验,使得我国在外源基因表达水平上与国外相比还相差甚远。如潘玲等在转基因小鼠乳汁中所表达的人促红细胞生成素(EPO),其含量仅为0.5拼m/m阎喜军等以乳头管导人和乳腺直接导人两种转染方法获得的基因小鼠,其EPO含量仅为0.64ng/ml和0.o o6ng/ml(为大鼠分娩后48h的乳汁〕。但令人可喜的是,1998年我国的“863”计划中已将“动物乳腺生物反应器研究”作为重大项目,强化资助和组织管理工作。并且动物乳腺生物反应器的研究已逐步地受到国内有关部门和企业界的关注, 随着研究和开发力度的加强,其应用前景必定非常乐观。

4.乳腺生物反应器存在的问题

4.1 目的基因在受体动物染色体的整合问题

包括目的基因在受体动物基因组中的随机整合、调节失控、遗传不稳定、表达