细胞凝集反应实验

细胞凝集反应

王玉琼201005232142 齐鲁医学班

一实验目的：

1了解细胞膜的表面结构

2了解血细胞凝集原理

3学习研究细胞凝集反应的方法

二实验原理：

细胞凝集是指细胞彼此聚集在一起，成为一簇不规则的细胞团。细胞膜是双层脂镶嵌蛋白质结构，脂和蛋白质又能与糖分子结合为细胞表面的分枝状糖外被。目前认为，细胞间的联系，细胞的生长和分化，免疫反应和肿瘤发生都和细胞表面的分枝状糖分子有关。

凝集素是一类含糖的（少数例外）并能与糖专一结合的蛋白质，如植物血球凝集素，伴刀豆凝集素和土豆凝集素等，它具有凝集细胞核刺激细胞分裂的作用。凝集素使细胞凝集是由于它与细胞表面的糖分子连接，在细胞间形成“桥”的结果，加入与凝集素互补的糖可以抑制细胞的凝集。

三实验用品：

PBS缓冲液显微镜双凹载玻片滴管

土豆凝集素

土豆凝集素的提取：去皮土豆块茎2g，加10mLPBS缓冲液浸泡24h，所得粗提液中既含有可溶性土豆凝集素.

1%兔血红细胞

2.1%兔血红细胞制备：抽取兔静脉血1mL加抗凝剂，加入3mL生理盐水，1000r/min离心5min，重复洗涤三次。按红细胞压积配成1%红细胞悬浊液。

四实验步骤：

1．分别用滴管吸取土豆凝集素和1%兔血红细胞各一滴，置于双凹片左孔混匀。

2．吸取PBS缓冲液各一滴置于双凹片右孔混匀。

3．摇晃5-10min观察，并以低倍镜镜检。

五实验结果：

反应前反应后

（左为混合了PBS的兔血红细胞，右为混合了土豆凝集素的兔血红细胞）

发生凝集的细胞未发生凝集的细胞

图2 低倍镜（*10）下混合了了土豆凝集素（左）和PBS缓冲溶液（右）的兔血红细胞观察结果分析：

混合土豆凝集素9分钟时细胞开始发生凝集，可以观察到细小沙粒状的细胞团，随时间流逝小细胞团变大。

如图1可看到，混合了土豆凝集素的兔血红细胞（右侧）聚集成块，周围液体较澄清；而混合了PBS缓冲溶液的兔血红细胞（左侧）未发生凝集，液体浑浊。

低倍镜下镜检（图2）可看到，凝集了的细胞聚成一簇不规则的团，而未发生凝集的红细胞很均匀。

六关于实验操作的反思

1 兔子耳缘静脉抽血：

基本操作：按压兔子耳缘静脉的近心端，用酒精棉球擦拭，可以看到耳缘静脉鼓起来。针尖孔朝上，平行进针。看到针尖回血后，抽取血液。拔针止血。

第一次抽血，手还是有点抖，不过还是抽到血。

存在问题：感觉抽不动针的活塞。不习惯拿针管的姿势。

2细胞凝集反应操作反思：

前两次由于滴入的PBS缓冲液太多，致使两边混合在一起。因此，要少滴，摇晃玻璃片时要缓慢。

七关于实验内容的理解体会

一关于实验原理

定义：颗粒性抗原（细菌、红细胞、偶联抗原的乳胶颗粒）与相应抗体结合后出现肉眼可见的凝集现象，

此称

凝集反应。

1.直接凝集

直接凝集是颗粒性抗原（细菌红细胞）与相应抗体结合产生的凝集反应。利用直接凝集可鉴定细菌和血型。

2.间接凝集

将可溶性抗原或抗体包被在红细胞或乳胶颗粒载体表面后，与相应抗体或抗原作用出现的凝集。采用红细胞为载体的间接凝集称间接血凝。采用乳胶颗粒为载体的凝集称为乳胶凝集。以包被抗原检测抗体的

间接凝集。以包被抗体检测抗原的间接凝集称为反向间接凝集。用此法可检测乙型肝炎表面抗原和甲胎蛋白等。

二应用

1血型的鉴别

若将血型不相容的两个人的血液滴加在玻片上并使之混合，红细胞可凝集成簇，这个现象称为红细胞凝集。红细胞凝集的本质是抗原-抗体反应。起抗原作用的是镶嵌在红细胞膜上的一些特异蛋白质或糖脂，称为凝集原。能与红细胞膜上凝集原起反应的特异抗体是存在于血浆中的γ-球蛋白，称为凝集素。发生红细胞凝集时，由于每个抗体上具有2-10个抗原结合位点，因此，抗体可在若干个带有相应抗原的红细胞之间形成桥梁，使它们聚集成簇。输血反应就是由于在体内发生了红细胞凝集。在体外可利用红细胞凝集进行血型鉴定。

2作为细胞分化和成熟的标记应用凝集素作为细胞分化的标志，在这方面的应用报告最多，而且研究比较集中于血细胞，特别是淋巴细胞的分群。如Rose（1980）等发现在小鼠胸腺皮质内不成熟的T淋巴细胞呈PNA阳性反应，在小鼠小肠集合淋巴小结的生发中心也发现有20%左右的PNA阳性反应细胞，后者是否属于不成熟的T淋巴细胞，是值得进一步研究的问题。Newman等（1979）以荧光素标记凝集素PNA，发现在大鼠乳腺上皮的不同分化时期显示不同的荧光强度。在不成熟的大鼠乳腺上皮细胞，荧光弱或无，随着性成熟期到妊娠期乳腺上皮荧光程度逐渐加强，而泌乳期荧光强度达最高峰。在皮肤角质细胞自基底向表层分化、成熟的过程中，细胞表面的碳水化合物的分布和性质都在改变。Brabed等（1981）应用新生大鼠皮肤的实验表明，皮肤各层细胞分别与不同的凝集素相结合。麦芽素与角质化细胞相结合，蓖麻素与棘细胞和基底细胞相结合，而荆豆凝集素标记在棘细胞的表面。在成肌细胞（myeoblast）的分化与成熟过程中，Winaod 和Luzzati（1975）注意到类似的皮肤的改变。

3作为细胞特殊类型的标记Kivela和Farkkanen（1987）发现在人视网膜，PNA标记视锥细胞而不标记视杆细胞。在乳腺、乳腺上皮细胞呈PNA阳性反应而肌上皮细胞和间质细胞呈PNA 阴性反应。以多种凝集素对小鼠、大鼠和兔的肾组织切片进行染色结果表明，刀豆素A和蓖麻素存在于肾脏的各部，PNA和双花扁豆凝集素（DBA）主要分布于远曲小管和集合小管上皮细胞，荆豆凝集素（UEA）主要分布在血管内皮细胞，而麦芽素分布在肾小球。应用DBA对RIII 和DDK品种的小鼠研究表明，DBA主要结合在各种组织内毛细血管内皮细胞上，电镜观察显示DBA结合在内皮细胞的表面，在趣的是在RIII品系小鼠某些组织的内皮细胞显示肯定的DBA 阴性反应，说明同一种属动物的血管内皮细胞也存在有组织特异性的差别。Streit和Kreutzberg（1987）发现Griffonia Simplicifolia凝集素特异性标记面神经节内的小胶质细胞，其它类型的胶质细胞如星状胶质细胞（astrocyte）等都显示阴性反应。在切断面神经