实验二凝集沉淀反应演示文稿

材料：
待测血清、 AFP阳性血清、AFP诊断血清（兔抗人AFP ）、 生理盐水、琼脂板、打孔器、针头、毛细滴管、酒精灯。
双向扩散法测血清中AFP操作步骤
1、制备琼脂板：
1%盐水琼脂加热溶化，取5ml均匀铺与载玻片上。
2、打孔：
琼脂凝固后，用打孔器打孔成梅花型，针头取出孔中琼脂。
3、封底：
用酒精灯轻烤平皿底部至琼脂刚刚要熔化为止，封闭孔的底部，以防侧漏。
寒杆菌诊断血清、生理盐水； ➢ 用接种环取待测菌液，分别涂布于生理盐水和伤寒血
清中，混匀； ➢ 轻轻摇动玻片，1~2分钟后观察结果。
生理盐水 ＋
待测菌液
阴性
伤寒血清 ＋
待测菌液
？
直接凝集反应玻片法--菌种鉴定
结果及判断
❖ 盐水侧无凝集颗粒； ❖ 血清侧出现肉眼可见的凝集块为阳性，仍为均匀一致乳浊
液者为阴性。
实验二凝集沉淀反应演示文稿
实验目的
1.熟悉凝集反应、沉淀反应的概念。 2.了解单向琼脂扩散实验的原理、方法及应用。 3.掌握直接凝集反应玻片法的原理、方法及其
用途。 4.掌握双向琼脂扩散实验的原理、方法、结果
判断。
实验原理
1.直接凝集反应：颗粒性抗原与相应抗体结合后所呈 现的肉眼可见的凝集现象。 。
注意事项
1、接种环在伤寒菌液取菌前后均需严格灭菌，以免出现假阳 性。 2、注意涂菌时，先涂生理盐水侧，以免污染血清产生错误结 果。 3、摇动玻片时不要把两凹内液体混在一起。
二、沉淀反应:
➢ 经典抗原抗体反应的一种。
➢
+
可溶性抗原
➢ 分类:
✓ 琼脂扩散 ✓ 环状沉淀反应 ✓ 絮状沉淀反应 ✓ 免疫电泳
常见抗原抗体反应的种类
抗原抗体反应又称血清学反应，主要有：
1、凝集反应 2、沉淀反应 3、补体参与反应 4、中和反应 5、免疫标记技术
一、凝集反应
(一)概念
颗粒性抗原(细菌、细胞等)与相应抗体结合，在 一定条件下，出现肉眼可见的凝集物，称为凝集反应。
颗粒性Ag 又称凝集原 相应Ab 又称凝集素
直接凝集反应玻片法--菌种鉴定
（一）单向琼脂扩散试验 （示教）
原理:
适宜浓度的抗体预先在琼脂中混匀后制成琼脂板，以 适当距离打孔，将可溶性抗原至孔中，抗原向周围扩散，与 琼脂中抗体相遇，抗原与抗体比例适宜时，出现沉淀。沉淀 环的直径与孔中抗原浓度呈正相关，可根据沉淀环直径大小 从预先绘制成的标准曲线查出待测标本中抗原含量。
本试验方法简单，容易观察结果，可测定抗原的灵敏度 约为10～20μg／ml.
4、加样：
中间孔加抗AFP抗体，1、4孔加AFP阳性对照，2、3孔加待检血清，5、6孔加 生理盐水。
5、反应：
于湿盒，37C 24h。
1
6
2
5
3
4
抗AFP抗体
A1g
6
2 Ag?
Ab
5
3 Ag?
4
Ag
双向扩散法测血清中AFP实验结果
1
6
2
5
3
4
1
6
2
5
3
Fra Baidu bibliotek
4
1、4两孔（阳性对照孔）与中心孔之间应出现清晰的乳白色沉淀线， 5、6（阴性对照孔）两孔与中心孔之间无沉淀线。
2、3两孔（待测血清）如与中心孔之间也出现了沉淀线，且一端与 相邻的阳性对照血清形成的沉淀线相吻合，则该待测血清为阳性。
如待测血清与中心孔出现了沉淀线，但与阳性对照血清的沉淀线相 交叉，不判为阳性。 如待测血清24h内与中心孔间无沉淀线则为阴性。
双向扩散法测血清中AFP注意事项
1、琼脂板一定平整、光滑 (无气泡)，琼脂不可过厚； 2、打孔不要划破边缘； 3、加样要加满而不溢出为止； 4、合理分配吸管，Ag、Ab吸管不能混淆。
原理 玻片凝集试验是一种快速简便的检测方法，即抗
原抗体的反应在玻片上进行，是一种定性的试验。用 已知抗体检测未知抗原。
本试验用已知的伤寒杆菌标准诊断血清鉴定未知 细菌。
材料
伤寒杆菌诊断血清、伤寒杆菌菌液、生理盐水、 载玻片、接种环、蜡笔、酒精灯等。
直接凝集反应玻片法--菌种鉴定
操作步骤
➢ 取洁净玻片1张，用蜡笔划分2等份，如下图所示 ； ➢ 无菌操作，用接种环分别于一、二格内各加2～3环伤
相应抗体
沉淀线或沉淀环
琼脂扩散试验：
琼脂是一种含有硫酸基的多糖体，高温时溶于 水，冷却后凝固，形成凝胶，呈多孔结构，充满水 分，允许各种抗原抗体分子自由扩散。二者于比例 适当处相遇，发生沉淀，形成可见的沉淀带。
分类：
单向琼脂扩散实验: 仅抗原或抗体扩散 —— 定量实验
双向琼脂扩散实验: 抗原和抗体同时扩散 —— 定性实验
2.沉淀反应：可溶性抗原与相应抗体在适当条件下结 合而出现的沉淀现象。
实验材料
伤寒杆菌诊断血清、伤寒杆菌菌液、生理盐水、 载玻片、接种环、记号笔、酒精灯；琼脂板、 打孔器、针头、毛细滴管、待测血清、 AFP阳 性血清、AFP诊断血清（兔抗人AFP ）等。
实验内容
1.直接凝集反应：玻片法（操作） 2.沉淀反应： （1）单向琼脂扩散试验（示教） （2）双向琼脂扩散试验（操作）
凝集反应与沉淀反应的比较
抗原性质 反应时间 反应产物
凝集反应
沉淀反应
颗粒性或可溶性抗原致 可溶性 敏颗粒
几分钟
数小时至数天
凝集块
沉淀物
思考题
❖ 1、凝集反应的原理及直接凝集反应玻片法的 用途是什么？
❖ 2、沉淀反应的原理是什么？
作业
1 写出实验报告 2 分析凝集反应的结果和意义 3 绘出双向琼脂扩散试验结果图
应用:
检测 AFP 、HBsAg, 协助疾病诊断.
双向琼脂扩散法测血清中AFP
甲胎蛋白（AFP）：
是一种在胚胎期由肝细胞和卵黄囊合成的α球蛋白， 存在于胎儿血清中，出生后血清中AFP几乎消失。正常 成人血清中仅含极微量的AFP，经典的免疫学方法检测 不出。
当肝细胞发生癌变时，AFP含量增高，测血清中AFP， 可协助诊断原发性肝癌。
应用:
人血清中IgG、IgM、IgA和C3的定量检测。
单向琼脂扩散实验:
琼脂中含抗体
Ag
Ag
Ag
Ag
Ag
1:80
1:40 1:20
1:10
未知
沉淀环直径平方
抗原浓度
（二）双向琼脂扩散试验 （操作）
原理:
将可溶性抗原与相应抗体两种溶液置于琼脂糖凝胶的不 同位置，使两者在凝胶中各自向四周扩散,抗原与抗体相遇并 在比例合适处形成可见的乳白色沉淀线。