叶绿素提取实验

实验10 叶绿体色素的提取分离及其性质鉴定
一、目的
学会叶绿体色素提取和分离的方法，了解叶绿体色素的性质。

二、材料用具及仪器药品
（1）层析液配方：石油醚20ml+丙酮2ml+苯1ml
（2）天平、研钵、烧杯、量筒、滤纸、表面皿、剪刀、90-95%乙醇、汽油、漏斗、滴管
（3）菠菜、木茨等叶子
三、原理
叶绿体含有叶绿体色素，叶绿体色素主要包括有Chla、Chlb、叶黄素和胡萝卜素，可用有机溶剂乙醇、丙酮等将它们提取出来。

纸层析法是分离叶绿体色素最简单的方法。

它的原理是利用混合色素中各个成分物理、化学性质的差别，分别以不同程度分布于两相中（即固定相和流动相）。

由于它们以不同的速度移动，从而达到分离的目的。

叶绿体色素容易受光的破坏，变成褐色。

叶绿体色素具有荧光现象。

叶绿素分子的镁可被铜替代，形成铜代叶绿素。

叶绿体色素对不同波长的光具有吸收作用。

四、方法
1、纸层析法分离叶绿体色素（方法1）
（1）称取新鲜叶片（木茨、菜心、菠菜等叶均可）1克，剪碎，放在研钵中，加乙醇5m1，共研磨成匀浆，静置5分钟。

（2）用滴管吸取上面的色素提取液4～5滴。

一滴一滴地滴在滤纸的中央（滤纸要平放在表面皿或培养皿上）。

待色素点风干后，向该色素点上慢慢滴加汽油，使四种色素（叶绿素a、叶绿素b、叶黄素、胡萝卜素）在滤纸上分离出来，四种色素在滤纸上的移动速度是胡萝卜素（橙黄色）>叶黄素（黄色）>叶绿素a(蓝绿色)>叶绿素b（黄绿色）。

2、纸层析法分离叶绿体色素（方法2）
（1）称2克新鲜绿色叶片，剪碎，放在研钵中，加入5ml乙醇，共研磨成匀浆，过滤，该滤液即为色素提取液。

（2）取一块预先干燥处理过的定性滤纸，将它剪成长约10cm ，宽约1cm的滤纸条。

（3）用毛细管吸取色素提取液。

在滤纸条的一端（约距这一端的1cm处）划出一条滤液细线，等滤液干燥后，再重复划4～5次。

（4）将滤纸条的另一端（约距这一端1cm处）拆成“V”字形，并将它挂在放有层析液的烧杯壁上（注意：色素线要略高于层析液面，且滤纸条下端最好不要碰到烧杯壁），盖上培养皿。

（5）经几分钟后，观察色素带的分布，最上端为胡萝卜素，其次是叶黄素，再次是叶绿素a，最后是叶绿素b。

3、叶绿体色素的性质鉴定
（1）叶绿体色素的提取
取菠菜（或其他植物）叶子2g，加石英砂和碳酸钙少许，乙醇约5ml，研磨成匀浆，再加乙醇15ml，用漏斗过滤，即为色素提取液。

（2）叶绿素的荧光现象
取上述色素乙醇提取液少许于试管中，在反射光和透射光下观察色素提取液的颜色有什么不同。

反射光下观察到的溶液颜色，即为叶绿素产生的荧光现象。

（3）光对叶绿素的破坏作用
取上述色素乙醇提取液少许，分装在2支试管中，1支试管放在暗处（或用黑纸包裹），另1支试管放在强光下（太阳光），经2—3小时后，观察两支试管中溶液的颜色有何不同？
（4）铜在叶绿素分子中的替代作用
取上述色素乙醇提取液少许于试管中，1滴1滴地加入盐酸，直至溶液出现褐绿色，此时叶绿素分子已遭破坏，形成去镁叶绿素。

然后加醋酸铜晶体1小粒，慢慢地在酒精灯上加热溶液，使溶液又产生亮绿色，此即表明铜已在叶绿素分子中替代了原来镁的位置。

（5）黄色素和绿色素的分离
将叶绿体色素的酒精提取液10毫升倒入分液漏斗中，倾斜漏斗，并沿其壁慢慢加入15毫升汽油（或乙醚），轻轻摇动5分钟，静置片刻后，溶液即分为两层，上层为绿色的汽油层，主要含有叶绿素。

为使色素分离完全，从分液漏斗放出下层酒精溶液，将之盛于干燥的试管（A）中，再往留在分液漏斗中的汽油层色素溶液加入95%酒精5ml，轻轻摇动之，弃去下层黄色溶液，并将上层绿色的叶绿素汽油层提取液放入试管（B）中，用棉花塞住试管口。

同样将试管（A）所盛的黄色酒精溶液倒入分液漏斗中，加入汽油5ml，轻轻摇动分液漏斗，将下层黄色溶液放入试管（C）中，塞以棉花。

最后用分光镜观察绿色溶液和黄色溶液的吸收光谱。

（6）黄色和绿色溶液的吸收光谱的观察
用手持分光镜观察黄色溶液和绿色溶液的吸收光谱。

五、实验报告
1、将纸层析法分离叶绿体色素的实验结果贴在实验报告纸上，并给予分析。

2、解释叶绿体色素的光学性质。

六、思考题
1、Chla、Chlb、叶黄素和胡萝卜素在滤纸上的分离速度不一样，这与它们的分子量有关吗？
2、什么叫叶绿素的荧光现象？铜代叶绿素有荧光现象吗？。