细胞生物学：常规制片技术

丙酮 脱水作用比乙醇强，但对组织块的收缩 较大，价格较高，一般少用。主要用于快速脱 水或固定兼脱水。 正丁醇 脱水能力较弱，但能与水、乙醇及石 蜡相混合，故这种脱水的组织块可直接浸蜡包 埋。这种脱水剂兼透明剂的最大优点是很少引 起组织块的收缩与变脆。正丁醇在使用时易挥 发，吸入后能发生头痛，使用时应注意安全。
简便的酒精稀释法： 无论任何浓度的酒精稀释时， 需稀释到多大浓度就取多少毫升酒精， 然后用蒸馏水加至该酒精原有浓度即 可。例：将95%酒精稀释为70%浓度 时，则将95%酒精70毫升倒入量筒中， 然后加入蒸馏水至总量95毫升即可。
透

明
目的
一、组织块透明的目的是便于浸蜡包埋，但组 织块脱水后其内部的脱水剂与石蜡不相溶，还必 须用石蜡诱导剂过度，这种物质能够同时溶解于 脱水剂及包埋剂中，它能逐渐渗入组织最终将脱 水剂完全排出，诱导剂渗入后，组织块往往呈透 明状故称之为“透明”。这种药剂称为透明剂。 二、切片透明的目的是有利于光线的透过，便 于显微镜的观察。当组织块中全部为透明剂占有 时，光线可以透过，组织可呈现不同程度的透明 状态。

2.染色、脱水 （1） 苏木素染细胞核，5-30分钟。 （2） 自来水洗去浮色，流水冲洗20分钟。 （3） 1%盐酸酒精分色。 （4） 蒸馏水洗。 （5） 入1%伊红水溶液或酒精溶液复染110分钟。 （6 ） 按顺序经95%酒精I、II中脱水各1分 钟。 (7) 纯酒精I、II各2分钟。
1 3. 透明、封固 （1）1/2二甲苯1分钟。 （2）经二甲苯透明5分钟。 （3）加盖玻片封固。
将修整好的持蜡器上的蜡块，再安装到
切片机的蜡块夹持器上固定。 将切片刀装在切片机的夹刀座上，并把 刀座上的螺旋旋紧，以固定切片刀。切 片刀与蜡块应保持一定的角度，将刀座 下部前后移动，以调整好切片刀与蜡块 的距离。
调整切片机厚度调节器所需的厚度。 切片机上各部件调节好后，便开始切片，用右 手握住切片机旋转轮的手柄，摇动旋转轮进行 切片。
种类
非石蜡溶剂的脱水剂 石蜡溶剂的脱水剂]
•
方法
将脱水剂配成各种浓度，自低到高 浓度循序进行。
常用脱水剂
酒精
为常用的脱水剂。脱水能力强， 并能使组织硬化，能较好地与二甲 苯透明剂相融合。其缺点是易使组 织收缩，变脆。在一般脱水过程中， 采用循序渐进的方法，逐步升级， 经一系列的不同浓度的酒精，使组 织中的水分逐渐被酒精所替代。
浸蜡剂的种类 石蜡 有高熔点和低熔点之分，一般应用熔点 为56。C以上的石蜡。低熔点在54 。C以下，用 于酶的显示和保存抗原活性。经过浸蜡的组织 被包埋起来，有利于组织切片的连续性，展片 平整，烤片方便，结构成分保存较好，特别是 整个蜡块的材料保存可靠。 火棉胶

明胶
包


埋
目的

染色结果：细胞核染成深兰色，细胞质、 胶原纤维、肌纤维和嗜酸性颗粒染成粉 红色或浅红色，红蓝对比鲜明。
常规HE染色应注意的问题
脱蜡必须彻底。 使切片上的石蜡和二甲苯充分洗净。 染色时间应根据染色剂的性质、组织的 类别、切片的厚薄、温度、染色液的新 旧等灵活掌握。

染色后的分色是染色成败的关键之一。 分色后，应立即置于自来水中冲洗干净。
避免死后变化。
避免过度膨胀或收缩。
注意事项 组织必须新鲜 组织的厚度 防止因固定发生变形 用量 时间 促使固定

固定剂
单纯固定剂 甲醛 渗透力强，固定均匀，对组织收缩 少。经甲醛固定的组织，细胞核染色甚 佳，胞质着色较差。除单独使用外，常 与其他药品配成混合液，效果更佳。
目的和意义
保持组织和细胞与正常生活时的形态相似。

使细胞内的各种成分转变成不溶性物质。
增加组织硬度，便于组织切片。
防止细胞过度收缩或膨胀而失去其原有 的形态结构。

固定的对象和方法
小块组织固定法 注射、灌注固定法 蒸汽固定法

固定剂的性质和条件

迅速渗入组织而固定细胞质。
有较强的渗透力。

苏木精—伊红染色（HE染色） 应用两种染料，一种是天然的苏木 精，另一种是煤焦油染料伊红。苏木精 主要用于对细胞核的染色，伊红主要用 于对细胞质的染色。
苏木精配方（Harris苏木精） A液（苏木精1克，无水酒精10ml） B液（钾明矾20克，蒸馏水200ml） 先将A液搅拌溶解，再将B液煮沸溶 化去火，缓缓加A液，然后加氯化汞0.5 克，再煮沸冷却后加入8ml冰醋酸，过滤 后使用，存放时间越长，颜色越鲜艳。

冰冻切片法
组织块不经任何包埋剂而直接放在 制冷台上冷却后再进行切片。
火棉胶切片法
粘
片





将切片机切下的蜡片，贴附在载玻片上的 过程。 粘片剂 蛋白甘油 用具 洁净的载玻片，酒精灯或切片伸展器， 拨针等。 方法 直接贴片法 温水漂浮贴片法
烤

片
温度一般在37-45。C，时间不少于24小时， 以防切片从载玻片上剥离。
苦味酸 黄色粉末结晶。能沉淀蛋白 质，对脂肪类脂无效，渗透力 较弱，一般很少单独使用。
乙醇 又名酒精，为无色液体，可 与水在任何比例下相混合。 一般用作固定液的浓度为 95%或纯酒精。 其他常用的单纯固定剂还有 重铬酸钾、铬酸、四氧化 锇、丙酮、三氯乙酸等。
常用混合固定剂
Bouin氏液
配方：苦味酸饱和水溶液 75 ml； 甲醛 25 ml；冰醋酸 5m。此液临 用时配制。 为一种常用良好的固定液， 渗透力强，对组织固定均匀，收缩 较小，染色效果好。一般组织固定 12-24小时。
Carnoy氏液
配方：纯酒精 60 ml；冰醋酸 10 ml；氯仿（三氯乙酸） 30ml。 此液渗透迅速。适用于一般 细胞学研究。固定后不经水洗， 即入95%酒精脱水或直接入纯酒 精，可缩短制片时间。
Zenker氏液
配方：升汞 5g；重铬酸钾 2.5g； 冰醋酸 5 ml；蒸馏水 100 ml。 为组织学、细胞学及病理学 常用的固定剂，多用于固定一般 组织。固定时间24小时，加热固 定可以加快渗透作用。固定后流 水冲洗12小时，并在以后的脱水 过程中除去汞盐沉淀。
注意事项
包埋时夹取组织的镊子，应随时烤热。 包埋操作要敏捷。 包埋后的蜡块应呈均质半透明状。 包埋恒温箱中的温度必须保持恒定。 若包埋后发现渗蜡不够，或包埋的不好， 可将蜡块熔化，重新渗蜡和包埋。

组织切片

切片机
制作组织切片标本必备的紧密仪器，可以 制出以微米为单位的薄切片。
种类 石蜡切片机 火棉胶切片机 冰冻恒温箱切片机


将修整好的蜡块固定在持蜡器（木块）上。用 一小铜片铲加上石蜡，加热至70-80C，先倒一 部分融化的蜡液于木块上，并将蜡块略融化后 与之融合，冷却后，蜡块可牢固地粘附在持蜡 器上。也可不用持蜡器，即将修整好的蜡块， 经冷冻后，直接安装在切片机的组织块支持器 中进行切片，当然如果蜡块太小，还须用持蜡 器。
保养

切片方法
石蜡切片法
包埋好的蜡块，切片前，将蜡块从包埋纸盒中 取出并修整蜡块，用切蜡刀视组织大小，切去 边缘余蜡的一部分，但应在组织的周边留有石 蜡边 0.2cm ，蜡块的四边留蜡的距离要均等， 不能一边多，一边少，否则将使连续切片受到 影响，修整好的蜡块可放在冰箱中备用。 准备好切片用具 磨好的切片刀，毛笔一支， 小手术刀一把，盛蜡片盘，二甲苯或氯仿一小 瓶，药棉等，夏天还要准备冰块。
将组织埋入石蜡等凝固成块。
方法
石蜡包埋法 先在纸制的小长形盒或金属包埋框内倒 入融化的蜡，用加温的镊子将浸蜡的组织块置于其内。 放入时应注意组织的切面朝下并放平整；石蜡的温度不 宜过高而损伤组织，过低使组织和石蜡不适宜而影响切 片。组织包埋好后，等到石蜡凝固，将包埋框打开，用 刀片把组织蜡块切开，待完全冷却后再修整蜡块，要求 组织外围的石蜡保留适中以便连续切片。
其他常用的混合固定液有中性甲醛 固定液、甲醛-乙醇固定液、Helly固定液 等。
洗
目的
涤
组织在固定后一定要把渗入组织里 面的固定液洗去，防止组织中留有较多 的固定液而影响脱水剂，甚至可在组织 中发生沉淀或结晶而影响观察。
常用方法
固定剂以水配制的 固定剂含乙醇的
脱
水
目的和原则 组织经固定和水洗后，含有大量的 水分，而水和苯及石蜡根本不相融合， 所以组织在透明前必须经过脱水这一环 节。就是用某些溶剂逐步将组织块吸收 的水分置换出来，以利于透明剂和石蜡 等的渗入，这一过程就叫做脱水，使用 的药品为脱水剂。
组织学常规制 片基本技术
组织学制片方法
切片法 非切片法 1.分离标本 2.活体标本 3.涂片标本

4.磨片标本 5.整体封藏标本 6.铺片标本 7.组织印片
巨噬细胞（macrophage)
精子
石蜡切片HE染色制片方法
•
动物致死和取材
致死方法：麻醉、空气栓塞、股动脉放血 等。
HE染色

氧化汞
俗称升汞，剧毒，必须严格 保管和注意使用。穿透力慢， 适于固定薄块组织。能沉淀一 切蛋白质，升汞可增加对酸性 燃料的亲和力，如卡红等。
醋酸 又名乙酸、冰醋酸，为无色 透明液体，有刺激性气味。 醋酸的渗透力强。经单纯醋 酸固定的组织，可不经水洗， 直接入酒精脱水。用作固定 剂的醋酸浓度一般在0.3-5%。
染
色
染料 原理：对纤维或组织有亲和力。根据其 酸碱度不同，把染料分为酸性和碱性染 料。细胞核的主要成分是DNA，带负电 荷的磷酸基，所以细胞核能接受碱性染 料。细胞质的成分主要是蛋白质，还有 RNA、脂蛋白等，大多是两性离子化合 物，当溶液PH低于其等电点时，胞质中 蛋白质等带正电荷的与带负电荷的酸性 染料结合。

伊红配方 1%伊红：95%酒精100ml中含1克伊红。
HE染色
染色的步骤： 1. 脱蜡到水 （ 1 ）石蜡切片烤干后，浸入二甲苯 I 20分钟，洗去石蜡。 （2）浸入二甲苯II 1分钟。 （3） 纯酒精I 1分钟，洗去二甲苯。 （4）纯酒精II 1分钟。 （ 5 ） 按 顺 序 入 95% 、 80% 、 70% 、 50%酒精各1分钟。 （6）蒸馏水中洗1分钟，洗去酒精。
时间：脱水时间应根据组织的体积和厚度而定，
组织在纯酒精中脱水时间不能过长，过长则组织 过度硬化变脆，不易切片。此外，脱水的时间与 固定液的种类也有关。 如用酒精脱水，一般经水洗的小块组织可 从50%开始，依次经过70%、80%、95% I、 95%II、100% I 和100% II，每一级酒精脱水时间 约为30分钟。 简便的酒精稀释法：无论任何浓度的酒精稀释时， 需稀释到多大浓度就取多少毫升酒精，然后用蒸 馏水加至该酒精原有浓度即可。例：将95%酒精 稀释为70%浓度时，则将95%酒精70毫升倒入量 筒中，然后加入蒸馏水至总量95毫升即可。
• 取材
顺序：先腹腔（肝脏、胆囊、 肾、肾上腺、胰腺、脾、胃、 十二指肠、空肠、回肠、结 肠），然后取胸腔和盆腔内的 器官组织。
取材关键
材料新鲜
勿使组织块受挤压
组织块力求小而薄 选好组织块的切面 尽量保持组织的原有形态 保持材料的清洁
固定和固定液
固定：借助化学药品使组织和细 胞中的有机和无机成分凝固成沉 淀，防止发生死后组织变化，以 保持其生活时状态的过程。此药 品称为固定剂。

透明剂的种类和使用方法
二甲苯 易挥发，无色透明液体，长期接触 对呼吸道粘膜有刺激作用。透明能力强，但易 使组织收缩、变脆，所以组织块在二甲苯中不 宜久留。
•
时间
二甲苯I、II各15-30分钟。
浸蜡Βιβλιοθήκη Baidu包埋

目的
浸蜡是为包埋做准备，目的是除去组织中的 透明剂而代之以石蜡，并渗入组织内部（因透 明剂和石蜡相溶的性质，将透明的组织投入溶 化的石蜡中，石蜡即浸入组织），把软组织变 为适当硬度的蜡块，便于切成薄片。

方法
将组织块经过二甲苯透明后，投 入到已溶化的石蜡中。在透蜡时必 须经过数次纯石蜡（石蜡1、2、3）， 使石蜡中存有的剩余透明剂完全去 尽，以免影响切片质量。
时间
透蜡时间应根据不同组织类型 及其大小而定，基本上与组织固定 时间成正比。 最好先入1/2石蜡（含1/2二甲 苯），然后入石蜡I、II，总时间不 超过1小时。