HIV核酸检测技术及应用
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Abbott公司生产的M2000 HIV-1 RNA/DNA 定性检测 试剂盒
Roche公司生产的COBAS® AmpliPrep/COBAS® TaqMan® HIV-1 Qualitative Test,v2.0
HIV核酸定性检测
——适应范围
（1）诊断婴儿早期感染 （2）诊断急性HIV-1感染。针对对HIV-1抗体筛查阴性、近 期有流行病学史的个体,或确证结果不确定的样本,核酸定性 检测可用于诊断HIV-1急性期感染。 （3）确定艾滋病病毒感染。针对HIV-1抗体筛查阳性或确证 结果不确定的个体，结合流行病学史和临床病史，核酸定性 检测可用于HIV-1感染诊断。艾滋病晚期患者可能出现HIV抗 体反应不确定，可根据HIV核酸定性检测结果，结合临床病 史和CD4+T淋巴细胞计数等情况，进行综合判断，确定临床 诊断。
200000
Deltan Rn Deltan Rn
50000
100000
0
0
10
20
30
40
50
60
Cycle Number
HIV核酸阴性
0
0
10
20
30
40
50
60
Cycle Number
HIV核酸阳性
罗氏HIV-1 Qual Test
基于COBAS® AmpliPrep® / COBAS® TaqMan 48平台， 用于HIV-1 RNA和前病毒DNA的定性诊断，检测样本类 型包括抗凝全血、血浆、血清、干血斑或干浆斑等
核酸信号的放大！而非核酸分子的扩增！
•临床式半自动使用方案
北京万泰生物药业股份有限公司
•自动化提取
•人工加样 •试剂分装
•人工配液 •PCR仪检测
HIV核酸定量检测试剂-全自动化平台
WanTag 全自动核酸提取仪
PCR仪结果导入
PCR检测
➢强强联合整合Tecan加样与Thermo核酸提取平台
➢高通量 同时可用，实现1h内96份样本的提取
常用的HIV病毒载量检测方法
主要核酸扩增和信号放大扩增两种方法 NASBA/Easy Q (Biomerieux,生物梅里埃) Cobas Amplicor/Taqman (Roche，罗氏) m2000(Abbott，雅培) bDNA/Versant 440 (西门子) 国内：凯杰（匹基），科华，达安、东北
HIV核酸检测技术及应用
目录
HIV核酸简介 HIV核酸检测意义 HIV核酸检测技术现状与发展 HIV核酸检测质量控制 HIV核酸检测流程（新规范） HIV核酸检测实例应用
HIV病毒
病毒颗粒：呈球形，直径100-120nm 病毒衣壳：呈20面体立体对称 病毒核心：由RNA（两条ssRNA）、核衣壳蛋白、逆转录酶、核糖核酸酶及整合酶所组成
报告检测值，结果>5000 CPs/ml(或IUs/ml)，报告检测值，结果仍≤5000 CPs/ml，则需充分结合流行病学史、临床病史、CD4+T淋巴细胞计数和HIV-1 抗体随访检测结果等进行综合判断 ➢ 检测值低于最低检测限不能排除HIV-1感染。 （注：目前国内外没有商品化的HIV-2核酸检测试剂；由于核酸定量检测方法 获得的低病毒检测值可能是核酸污染所致的结果，根据国内外的相关数据和报 道，建议用5000 CPs/ml作为判断结果的阈值，两次定量检测有助于准确判断结 果）。
结果判读与报告
用于治疗效果和病程监测：检测值小于试剂盒线性范围下限，报告低于检测限， 检测值大于等于试剂盒线性范围下限，按照检测值报告。
用于HIV-1感染的诊断： ➢ 检测值>5000 CPs/ml(或IUs/ml)，报告检测值； ➢ 检测值≤5000 CPs/ml(或IUs/ml)，尽快再次严格按核酸检测的要求采样检测，
修改了艾滋病感染产妇所生儿童HIV感染早期感染检测流 程
初筛+复检+
补充试验（核酸试验）
HIV定性检测试剂盒
试剂：必须是经国家食品药品监督管理总局注册批准、 在有效期内的试剂。严格按说明书操作。全球目前正式 用于临床诊断HIV-1 急性期感染的核酸检测试剂比较少
Gen-Probe 公司生产的Aptima HIV-1 RNA 核酸定性 试剂盒
HIV病毒载量(Viral Load) 指体内复制的病毒的数量，反映体液
（一般是血浆）中HIV病毒的含量
1987年John首次提出病毒载量（viral load）的概念，体内复制的病毒的 数量是不能直接测量的，一般用血浆中HIV RNA的拷贝数代表HIV的病毒
载量。
是HIV核酸的定量检测，一般以血浆 HIV RNA的拷贝数/ml表示
HIV RNA
HIV前病毒DNAHIV生活周期图
HIV感染的自然史
急性感染期 无症状期 艾滋病期
HIV感染后标志物变化时间
Reactivity
HIV RNA
p24 Ag
IgM AntiHIV
IgG Anti-HIV
012345678
Weeks post-infection
HIV核酸检测的意义
结果判读与报告
检测结果显示“有反应”或“检测到”，报告 “HIV-1核酸阳性” ；检测结果显示“无反 应”或“未检测到”，报告“HIV-1核酸阴 性”。
核酸定性检测值低于最低检测限的结果，不能 排除HIV-1感染，需根据流行病学史、临床病 史和实验室相关指标进行综合判断。
目前国内外没有商品化的HIV-2核酸检测试剂
简易的工作流程：“上样”直接到“结果”，3.5小时 得到第一个样本结果，每分钟一个结果，12个小时500 个样本
核酸检测在新版规范主要内容
新增补充试验的概念，补充试验包括抗体确证试验和核 酸试验（定性和定量试验）
新增核酸检测流程，对复检结果有反应的情况，增加了 可以选择核酸诊断的策略；对于HIV抗体确证结果不确定 和疑似急性期感染的样品建议采用HIV-1 核酸试验。
耐药性 艾滋病的“元凶”
HIV核酸
缩短窗口期
指导治疗
病程 自然史
HIV核酸检测的意义
HIV-1感染诊断
✓ 婴儿感染早期诊断（小于18月龄） ✓ HIV-1感染补充试验及急性期和晚期感染者的诊断
治疗效果监测 通常在治疗一个月后病毒载量降低0.5log以上才
被认为临床治疗有效，六个月后应降到小于检测限 病程监控及预测 耐药性监测
停产) Roche COBAS® AmpliPrep/COBAS® TaqMan® HIV-1
Qualitative Test,v2.0 雅培RealTime HIV-1定性检测试剂盒 HIV病毒储存库的检测技术（超敏PCR）
In-house普通PCR诊断方法
核酸提取
PCR或RT-PCR扩增
COBAS® AmpliPrep® / COBAS® TaqMan48® 系统
TaqMan水解探针技术
引物
h
Q
R
引物
完整探针: 报告基团 (R) 的 荧光被淬灭基团(Q)抑制
Q R
探针被5’-外切核酸酶切掉
h
Q R
报告基团的荧光发射
R = 报告基团 Q = 淬灭基团
雅培HIV-1病毒载量仪
m2000全自动实时荧光定量 PCR系统
逆转录酶
逆转录酶
RNase H 和 引物 2延伸
逆转录酶
T7 RNA 聚合酶
引物 2
逆相 RNA 扩增物
AMV-RT (鸟肉瘤病毒逆转录酶):延伸形成RNA-DNA 杂交 链 RNase H:降解杂交链中的RNA T7-RNA聚合:转录形成的RNA转录产物
T7 RNA聚合 酶
“分子信标” 杂 交
COBAS® AmpliPrep® / COBAS® TaqMan48
制药、万泰 丽珠、科华等
NucliSENS EasyQ
血浆样本
miniMAG easyMAG
病毒载量分析仪
NASBA扩增技术
（nucleic acid sequence-based amplification,核酸序列依赖性扩增法）
RNA 引物1 延伸
T7启动子序列
RNase H 引物 1
逆转录酶
HIV核酸定量检测
——适用范围
（1）监测抗病毒药物治疗效果。抗病毒药物治疗前后，定期病 毒载量分析和监测，结合CD4+T淋巴细胞计数，有助于抗病毒药 物治疗方案的确定和修改。 （2）监测疾病进展。定期检测HIV-1病毒载量，有助于监测感染 者和病人的病程变化，结合CD4+T淋巴细胞计数，为抗病毒药物 治疗提供病毒学依据。 （3）诊断急性HIV-1感染。针对HIV-1抗体筛查阴性、近期有流 行病学史的个体，或确证结果不确定，核酸定量检测可用于诊断 HIV-1急性期感染。 （4）确定HIV-1感染。针对HIV-1抗体筛查阳性或确证结果不确 定的个体，结合流行病、和临床病史和CD4+T淋巴细胞计数等， 使用核酸定量检测帮助确定HIV-1感染。
➢高自动化可自动完成包括加样、核酸提取与纯化、PCR试剂配制与分配等扩增前的所有操作
➢采磁棒转移技术，有效避免气溶胶污染
➢中文自主操作界面，方便快捷
达安基因HIV病毒载量核酸检测系统
•DA3200
•HIV-1核酸定量检测试剂盒 •全自动核酸提取仪 •国产化！全自动！
PANTHER系统——TMA（转录介导的等温扩增）
HIV定量检测的试剂盒
试剂：必须是经国家食品药品监督管理总局注 册批准、在有效期内的试剂。严格按说明书操作。 NASBA/Easy Q (Biomerieux,生物梅里埃) Cobas Amplicor/Taqman (Roche，罗氏) m2000(Abbott，雅培) bDNA/Versant 440 (西门子) 国内：凯杰（匹基），科华，达安、东北制药、万 泰 丽珠、科华等
琼脂糖凝胶电泳
β-actin gag env pol
In-house 荧光PCR
国内外文献报道以HIV RNA或前病毒DNA作为 检测目标，选择LTR、gag、pol等基因作为靶基 因，建立荧光PCR检测方法
A
200000
FAM CY5
B
400000
FAM CY5
150000
300000
100000
•HIV-1病毒载量自动化检测平 台（96通量）
•已认证用于干血斑病毒载量检 测
•婴儿HIV-1核酸检测试剂盒
•用于实验室in-house方法的自 动化核酸提取
•此平台同时有HBV病毒载量， HCV病毒载量及分型，HPV高 危分型，MTB检测，CT/NG检 测等试剂盒
bDNA (Bayer versantTM)
电泳鉴定或测序
HIV-1的基因组结构
~9.2kb 结构蛋白
酶类
衣壳蛋白
In-house普通PCR诊断方法
检测设计：分别针对HIV gag、env和pol的三个独立 PCR检测体系，并另外设立1个检测内参（β-actin）的 检测体系（国家艾滋病参比实验室）
阳性：扩增出人β-actin，HIV-1 gag 、env和pol基因中扩增出2个及以上 基因片段 阴性：扩增出人β球蛋白基因，HIV-1 gag 、env和pol 3个基因都没有扩 增出来 不确定：人β球蛋白基因未扩增出预期的片段或HIV-1 gag 、env和pol 3 个基因只扩增出一个
surveillance program • Not a drug target today
LTR: • Targeted in Roche MPx blood screening test • Not a drug target today
检测总核酸（DNA/RNA）
检测结果示例
阴性 阳性
HIV核酸定量检测
The COBAS® AmpliPrep/COBAS® TaqMan® HIV-1 Qualitative Test, v2.0
Dual-PCR target Assay design
gag: • Targeted in previous Roche HIV-1 tests • Large sequence database from Roche’s Global
“套式”PCR
5’ gag
第一轮PCR 产物
pol
env
3’
AAAAAA
Байду номын сангаас
Reverse primer 1 Forward primer 1
Reverse primer 2 Forward primer 2
第二轮PCR 产物
优点: 增加敏感性/特异性 缺点: 增加扩增偏差机会
需要增加操作过程 容易增加污染机会
HIV核酸检测技术
分为HIV定性和HIV定量检测两大类： ➢HIV定性检测：HIV核酸（RNA和前病毒DNA） 的检测 ➢HIV定量检测：又称HIV病毒载量检测 （Viral load），主要用于抗病毒治疗患者 的疗效评价，也可用于补充试验（新规范）
HIV核酸定性检测
IN-HOUSE（文献报道） Roche Amplicor HIV-1 DNA PCR, v1.5试剂盒(已
Roche公司生产的COBAS® AmpliPrep/COBAS® TaqMan® HIV-1 Qualitative Test,v2.0
HIV核酸定性检测
——适应范围
（1）诊断婴儿早期感染 （2）诊断急性HIV-1感染。针对对HIV-1抗体筛查阴性、近 期有流行病学史的个体,或确证结果不确定的样本,核酸定性 检测可用于诊断HIV-1急性期感染。 （3）确定艾滋病病毒感染。针对HIV-1抗体筛查阳性或确证 结果不确定的个体，结合流行病学史和临床病史，核酸定性 检测可用于HIV-1感染诊断。艾滋病晚期患者可能出现HIV抗 体反应不确定，可根据HIV核酸定性检测结果，结合临床病 史和CD4+T淋巴细胞计数等情况，进行综合判断，确定临床 诊断。
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Deltan Rn Deltan Rn
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Cycle Number
HIV核酸阴性
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Cycle Number
HIV核酸阳性
罗氏HIV-1 Qual Test
基于COBAS® AmpliPrep® / COBAS® TaqMan 48平台， 用于HIV-1 RNA和前病毒DNA的定性诊断，检测样本类 型包括抗凝全血、血浆、血清、干血斑或干浆斑等
核酸信号的放大！而非核酸分子的扩增！
•临床式半自动使用方案
北京万泰生物药业股份有限公司
•自动化提取
•人工加样 •试剂分装
•人工配液 •PCR仪检测
HIV核酸定量检测试剂-全自动化平台
WanTag 全自动核酸提取仪
PCR仪结果导入
PCR检测
➢强强联合整合Tecan加样与Thermo核酸提取平台
➢高通量 同时可用，实现1h内96份样本的提取
常用的HIV病毒载量检测方法
主要核酸扩增和信号放大扩增两种方法 NASBA/Easy Q (Biomerieux,生物梅里埃) Cobas Amplicor/Taqman (Roche，罗氏) m2000(Abbott，雅培) bDNA/Versant 440 (西门子) 国内：凯杰（匹基），科华，达安、东北
HIV核酸检测技术及应用
目录
HIV核酸简介 HIV核酸检测意义 HIV核酸检测技术现状与发展 HIV核酸检测质量控制 HIV核酸检测流程（新规范） HIV核酸检测实例应用
HIV病毒
病毒颗粒：呈球形，直径100-120nm 病毒衣壳：呈20面体立体对称 病毒核心：由RNA（两条ssRNA）、核衣壳蛋白、逆转录酶、核糖核酸酶及整合酶所组成
报告检测值，结果>5000 CPs/ml(或IUs/ml)，报告检测值，结果仍≤5000 CPs/ml，则需充分结合流行病学史、临床病史、CD4+T淋巴细胞计数和HIV-1 抗体随访检测结果等进行综合判断 ➢ 检测值低于最低检测限不能排除HIV-1感染。 （注：目前国内外没有商品化的HIV-2核酸检测试剂；由于核酸定量检测方法 获得的低病毒检测值可能是核酸污染所致的结果，根据国内外的相关数据和报 道，建议用5000 CPs/ml作为判断结果的阈值，两次定量检测有助于准确判断结 果）。
结果判读与报告
用于治疗效果和病程监测：检测值小于试剂盒线性范围下限，报告低于检测限， 检测值大于等于试剂盒线性范围下限，按照检测值报告。
用于HIV-1感染的诊断： ➢ 检测值>5000 CPs/ml(或IUs/ml)，报告检测值； ➢ 检测值≤5000 CPs/ml(或IUs/ml)，尽快再次严格按核酸检测的要求采样检测，
修改了艾滋病感染产妇所生儿童HIV感染早期感染检测流 程
初筛+复检+
补充试验（核酸试验）
HIV定性检测试剂盒
试剂：必须是经国家食品药品监督管理总局注册批准、 在有效期内的试剂。严格按说明书操作。全球目前正式 用于临床诊断HIV-1 急性期感染的核酸检测试剂比较少
Gen-Probe 公司生产的Aptima HIV-1 RNA 核酸定性 试剂盒
HIV病毒载量(Viral Load) 指体内复制的病毒的数量，反映体液
（一般是血浆）中HIV病毒的含量
1987年John首次提出病毒载量（viral load）的概念，体内复制的病毒的 数量是不能直接测量的，一般用血浆中HIV RNA的拷贝数代表HIV的病毒
载量。
是HIV核酸的定量检测，一般以血浆 HIV RNA的拷贝数/ml表示
HIV RNA
HIV前病毒DNAHIV生活周期图
HIV感染的自然史
急性感染期 无症状期 艾滋病期
HIV感染后标志物变化时间
Reactivity
HIV RNA
p24 Ag
IgM AntiHIV
IgG Anti-HIV
012345678
Weeks post-infection
HIV核酸检测的意义
结果判读与报告
检测结果显示“有反应”或“检测到”，报告 “HIV-1核酸阳性” ；检测结果显示“无反 应”或“未检测到”，报告“HIV-1核酸阴 性”。
核酸定性检测值低于最低检测限的结果，不能 排除HIV-1感染，需根据流行病学史、临床病 史和实验室相关指标进行综合判断。
目前国内外没有商品化的HIV-2核酸检测试剂
简易的工作流程：“上样”直接到“结果”，3.5小时 得到第一个样本结果，每分钟一个结果，12个小时500 个样本
核酸检测在新版规范主要内容
新增补充试验的概念，补充试验包括抗体确证试验和核 酸试验（定性和定量试验）
新增核酸检测流程，对复检结果有反应的情况，增加了 可以选择核酸诊断的策略；对于HIV抗体确证结果不确定 和疑似急性期感染的样品建议采用HIV-1 核酸试验。
耐药性 艾滋病的“元凶”
HIV核酸
缩短窗口期
指导治疗
病程 自然史
HIV核酸检测的意义
HIV-1感染诊断
✓ 婴儿感染早期诊断（小于18月龄） ✓ HIV-1感染补充试验及急性期和晚期感染者的诊断
治疗效果监测 通常在治疗一个月后病毒载量降低0.5log以上才
被认为临床治疗有效，六个月后应降到小于检测限 病程监控及预测 耐药性监测
停产) Roche COBAS® AmpliPrep/COBAS® TaqMan® HIV-1
Qualitative Test,v2.0 雅培RealTime HIV-1定性检测试剂盒 HIV病毒储存库的检测技术（超敏PCR）
In-house普通PCR诊断方法
核酸提取
PCR或RT-PCR扩增
COBAS® AmpliPrep® / COBAS® TaqMan48® 系统
TaqMan水解探针技术
引物
h
Q
R
引物
完整探针: 报告基团 (R) 的 荧光被淬灭基团(Q)抑制
Q R
探针被5’-外切核酸酶切掉
h
Q R
报告基团的荧光发射
R = 报告基团 Q = 淬灭基团
雅培HIV-1病毒载量仪
m2000全自动实时荧光定量 PCR系统
逆转录酶
逆转录酶
RNase H 和 引物 2延伸
逆转录酶
T7 RNA 聚合酶
引物 2
逆相 RNA 扩增物
AMV-RT (鸟肉瘤病毒逆转录酶):延伸形成RNA-DNA 杂交 链 RNase H:降解杂交链中的RNA T7-RNA聚合:转录形成的RNA转录产物
T7 RNA聚合 酶
“分子信标” 杂 交
COBAS® AmpliPrep® / COBAS® TaqMan48
制药、万泰 丽珠、科华等
NucliSENS EasyQ
血浆样本
miniMAG easyMAG
病毒载量分析仪
NASBA扩增技术
（nucleic acid sequence-based amplification,核酸序列依赖性扩增法）
RNA 引物1 延伸
T7启动子序列
RNase H 引物 1
逆转录酶
HIV核酸定量检测
——适用范围
（1）监测抗病毒药物治疗效果。抗病毒药物治疗前后，定期病 毒载量分析和监测，结合CD4+T淋巴细胞计数，有助于抗病毒药 物治疗方案的确定和修改。 （2）监测疾病进展。定期检测HIV-1病毒载量，有助于监测感染 者和病人的病程变化，结合CD4+T淋巴细胞计数，为抗病毒药物 治疗提供病毒学依据。 （3）诊断急性HIV-1感染。针对HIV-1抗体筛查阴性、近期有流 行病学史的个体，或确证结果不确定，核酸定量检测可用于诊断 HIV-1急性期感染。 （4）确定HIV-1感染。针对HIV-1抗体筛查阳性或确证结果不确 定的个体，结合流行病、和临床病史和CD4+T淋巴细胞计数等， 使用核酸定量检测帮助确定HIV-1感染。
➢高自动化可自动完成包括加样、核酸提取与纯化、PCR试剂配制与分配等扩增前的所有操作
➢采磁棒转移技术，有效避免气溶胶污染
➢中文自主操作界面，方便快捷
达安基因HIV病毒载量核酸检测系统
•DA3200
•HIV-1核酸定量检测试剂盒 •全自动核酸提取仪 •国产化！全自动！
PANTHER系统——TMA（转录介导的等温扩增）
HIV定量检测的试剂盒
试剂：必须是经国家食品药品监督管理总局注 册批准、在有效期内的试剂。严格按说明书操作。 NASBA/Easy Q (Biomerieux,生物梅里埃) Cobas Amplicor/Taqman (Roche，罗氏) m2000(Abbott，雅培) bDNA/Versant 440 (西门子) 国内：凯杰（匹基），科华，达安、东北制药、万 泰 丽珠、科华等
琼脂糖凝胶电泳
β-actin gag env pol
In-house 荧光PCR
国内外文献报道以HIV RNA或前病毒DNA作为 检测目标，选择LTR、gag、pol等基因作为靶基 因，建立荧光PCR检测方法
A
200000
FAM CY5
B
400000
FAM CY5
150000
300000
100000
•HIV-1病毒载量自动化检测平 台（96通量）
•已认证用于干血斑病毒载量检 测
•婴儿HIV-1核酸检测试剂盒
•用于实验室in-house方法的自 动化核酸提取
•此平台同时有HBV病毒载量， HCV病毒载量及分型，HPV高 危分型，MTB检测，CT/NG检 测等试剂盒
bDNA (Bayer versantTM)
电泳鉴定或测序
HIV-1的基因组结构
~9.2kb 结构蛋白
酶类
衣壳蛋白
In-house普通PCR诊断方法
检测设计：分别针对HIV gag、env和pol的三个独立 PCR检测体系，并另外设立1个检测内参（β-actin）的 检测体系（国家艾滋病参比实验室）
阳性：扩增出人β-actin，HIV-1 gag 、env和pol基因中扩增出2个及以上 基因片段 阴性：扩增出人β球蛋白基因，HIV-1 gag 、env和pol 3个基因都没有扩 增出来 不确定：人β球蛋白基因未扩增出预期的片段或HIV-1 gag 、env和pol 3 个基因只扩增出一个
surveillance program • Not a drug target today
LTR: • Targeted in Roche MPx blood screening test • Not a drug target today
检测总核酸（DNA/RNA）
检测结果示例
阴性 阳性
HIV核酸定量检测
The COBAS® AmpliPrep/COBAS® TaqMan® HIV-1 Qualitative Test, v2.0
Dual-PCR target Assay design
gag: • Targeted in previous Roche HIV-1 tests • Large sequence database from Roche’s Global
“套式”PCR
5’ gag
第一轮PCR 产物
pol
env
3’
AAAAAA
Байду номын сангаас
Reverse primer 1 Forward primer 1
Reverse primer 2 Forward primer 2
第二轮PCR 产物
优点: 增加敏感性/特异性 缺点: 增加扩增偏差机会
需要增加操作过程 容易增加污染机会
HIV核酸检测技术
分为HIV定性和HIV定量检测两大类： ➢HIV定性检测：HIV核酸（RNA和前病毒DNA） 的检测 ➢HIV定量检测：又称HIV病毒载量检测 （Viral load），主要用于抗病毒治疗患者 的疗效评价，也可用于补充试验（新规范）
HIV核酸定性检测
IN-HOUSE（文献报道） Roche Amplicor HIV-1 DNA PCR, v1.5试剂盒(已