类叶升麻苷对东莨菪碱致小鼠学习记忆障碍的改善作用

类叶升麻苷对东莨菪碱致小鼠学习记忆障碍的改善作用
目的：探讨类叶升麻苷对痴呆小鼠学习记忆的影响。

方法：连续灌服类叶升麻苷10d后，以东莨菪碱建立小鼠记忆获得性障碍模型，采用行为学实验（跳台法）检测动物学习记忆能力，行为学测试结束后，进行小鼠大脑皮层和海马组织中生化指标检测，包括谷胱甘肽过氧化物酶（GSHPx）、总超氧化物歧化酶（TSOD）、丙二醛（MDA）、乙酰胆碱酯酶（TChE）以及脑组织蛋白含量的测定。

结果：预先给予小鼠类叶升麻苷10d可以改善东莨菪碱导致的记忆获得性障碍，与模型组比较，类叶升麻苷可显著延长小鼠跳台潜伏期，减少跳台错误次数；类叶升麻苷可使小鼠脑组织中TSOD，GSHPx，TChE活性、脑组织蛋白含量升高，MDA含量降低。

结论：类叶升麻苷对东莨菪碱致小鼠学习记忆获得性障碍具有显著的改善作用，其作用机制可能与其对抗小鼠体内自由基生成以及改善中枢胆碱能系统功能有关。

标签：类叶升麻苷；学习记忆；东莨菪碱；阿尔茨海默病
1材料
11药物与试剂类叶升麻苷（本实验室自制，其化学结构经核磁共振波谱法和质谱法确认，高效液相色谱面积归一化法鉴定其纯度为95％）；氢溴酸东莨菪碱注射液（上海禾丰制药有限公司，批号101204）；石杉碱甲片（哈伯因，河南太龙药业股份有限公司，批号110302）；谷胱甘肽过氧化物酶试剂盒（GSHPx）、总超氧化物歧化酶试剂盒（TSOD）、丙二醛试剂盒（MDA）、乙酰胆碱酯酶试剂盒（TChE）、考马斯亮蓝试剂盒，均由南京建成生物工程研究所提供。

其他试剂均为分析纯，符合实验要求。

12仪器与动物小鼠跳台仪（济南益延科技发展有限公司）；BECKMAN 高速低温离心机（ALLEGRA64R，美国PE公司）。

健康昆明种小鼠72只，雄性，体重（20±2）g，由新疆实验动物研究中心提供，合格证号SCXK（新）20030002。

2方法
21分组及给药取筛选合格小鼠72只（跳台法），随机分为6组，即空白对照组、东莨菪碱组（模型组）、类叶升麻苷低、中、高剂量组（30，60，120 mg·kg-1·d-1）、阳性对照石杉碱甲片组（007mg·kg-1·d-1）。

对照组、模型组给予等量的生理盐水，石杉碱甲以及类叶升麻苷均用生理盐水溶解，每天灌胃1次，灌胃体积均为002mL·g-1，连续灌胃给药10d。

22东莨菪碱致记忆获得性障碍模型[4]将动物随机分组及给药，末次给药后1h，各组小鼠均分别腹腔注射东莨菪碱3mg·kg-1，腹腔注射体积为001 mL·g-1，对照组腹腔注射等容量生理盐水。

15min后采用跳台法进行跳台训练，24h后复测。

23跳台法实验时将小鼠放置于跳台仪中，适应环境5min，然后底部的铜栅通以36V，2mA交流电，记录动物受到电刺激后跳上绝缘平台的反应时间和5min内受电击的次数，即错误次数，作为学习成绩。

24h后将小鼠置于平台上，记录小鼠第1次跳下绝缘平台的时间（潜伏期）和5min内受电击的次数（错误次数），作为记忆成绩。

24小鼠脑组织生化指标测定行为学实验结束后，小鼠立即断头处死，在冰上剥离脑组织，迅速分离出大脑皮质和海马，在冰冷的生理盐水中漂洗，除去血液，滤纸拭干，称重后，加入冷生理盐水，于匀浆管中充分研碎，制成10％脑组织匀浆，以3500r·min-1离心10min，取上清液作生化检测，备用，保存于-20℃冰箱中。

取10％脑组织匀浆上清液，采用GSHPx，SOD，MDA，TChE用比色法测定，蛋白定量采用考马斯亮蓝染色结合比色法，具体操作步骤及计算公式按说明书进行。

25统计学处理采用SPASS130统计学软件对实验数据进行统计学分析，数据结果用±s表示，组间比较采用单因素方差分析和t检验，P＜005为差异有统计学意义。

3结果
31行为学试验模型组小鼠逃避潜伏期明显低于对照组（P＜001），石杉碱甲片阳性对照组可延长小鼠逃避潜伏期（P＜005）。

类叶升麻苷低、中、高剂量组均可显著延长小鼠逃避潜伏期（P＜001）；此外类叶升麻苷低、中、高剂量组均能使小鼠由于学习记忆能力下降引起的跳台错误次数降低（P＜001）。

由此提示东莨菪碱破坏了小鼠被动回避学习记忆能力，而类叶升麻苷可以翻转东莨菪碱对小鼠被动回避学习记忆能力的损伤，见表1。

32脑组织生化指标模型组小鼠大脑皮层中MDA含量与对照组比较极显著升高（P＜001），TSOD活力和GSHPx活力与对照组比较有显著性下降（P＜005），可以提示东莨菪碱导致记忆障碍的机制之一是氧化损伤。

提前给予类叶升麻苷预防的小鼠脑内MDA含量下降，其中低、中剂量组均可明显降低MDA水平（P＜005），但是高剂量与模型组相比较未出现显著性差异，高剂量与对照组相比较MDA含量明显升高，提示可能是出现了药物剂量过大造成的毒性反应。

TSOD，GSHPx活性显著升高，其中高剂量组可明显升高TSOD水平（P＜005），低、中、高剂量组均可明显升高GSHPx水平（P＜005，P＜001，P＜001）。

乙酰胆碱酯酶活性与对照组比较极显著下降（P＜001），可以提示东莨菪碱导致记忆障碍的机制之一是胆碱能损伤。

提前给予类叶升麻苷预防的小鼠脑内TChE含量升高，其中低、中、高剂量组均可明显升高TChE水平（P＜001），但是中、高剂量与对照组相比较出现显著性差异（P＜001），见表2。

33脑组织蛋白含量模型组小鼠大脑皮层中组织蛋白含量有所降低，但与对照组比较无统计学差异。

提前给予类叶升麻苷预防的小鼠脑内组织蛋白含量升高，其中低、中剂量组可明显升高组织蛋白含量（P＜005，P＜001），见表3。

4讨论
东莨菪碱是M受体阻断剂。

据报道，小鼠腹腔注射2～5mg·kg-1东莨菪碱可造成记忆获得性障碍模型[56]。

本研究曾使用不同剂量东莨菪碱进行预试，发现给药剂量小于2mg·kg-1时小鼠学习记忆能力无明显减退，但大于5 mg·kg-1时又会使小鼠出现比较严重的副作用，如躁狂等，会对于评价药物造成影响，故本研究采用3mg·kg-1进行造模，经济简便有效。

类叶升麻苷的给药剂量参考相关文献[6]，经过预试后最终确定为30，60，120mg·kg-13个给药浓度以全面考察类叶升麻苷的作用。

本文选用跳台实验行为学方法[7]观察小鼠行为学改变以及学习记忆的能力及变化，实验结果表明，类叶升麻苷可以提高东莨菪碱造成的记忆获得障碍模型动物的学习记忆能力。

MDA含量间接反映了体内自由基的多少及其反应强度，TSOD和GSHPx 是机体清除自由基的重要抗氧化酶之一，在机体抗氧化损伤中起着举足轻重的作用。

东莨菪碱可以明显升高小鼠脑内MDA的含量，降低小鼠脑组织中TSOD和GSHPx的活性。

有研究显示，苯乙醇苷类化合物可以清除机体内超氧阴离子和羟自由基，具有抗氧化作用[8]。

而类叶升麻苷为苯乙醇苷类化合物，分子中含有多个酚羟基，提前给予类叶升麻苷预防的小鼠明显降低了东莨菪碱导致的MDA生成的增多，明显升高了TSOD和GSHPx这2种酶的活性，提示类叶升麻苷的抗氧化作用可能与其改善东莨菪碱造成小鼠记忆障碍密切相关。

中枢胆碱能系统被认为与近事记忆相关，而近事记忆障碍正是AD早期的主要临床症状。

AD患者胆碱能乙酰转移酶（ChAT），乙酰胆碱酯酶（TChE）活性，M受体含量明显降低，ACh的合成、储存和释放减少[911]。

另外，朴景华等[6]也曾发现类叶升麻苷可能会对中枢胆碱能系统能产生影响。

本研究显示类叶升麻苷能显著提高TChE活性，提示类叶升麻苷改善小鼠学习记忆能力的作用可能与中枢胆碱能系统功能有关。

东莨菪碱模型组中蛋白含量与对照组比较虽然没有显著性差异，但是趋势却是降低的，类叶升麻苷低、中剂量组中的脑组织蛋白含量增多，提示可能与类叶升麻苷具有补肾壮阳，具有益智作用有关。

本研究实验结果提示类叶升麻苷对老年性痴呆等某些认知功能障碍疾病的治疗具有一定疗效，类叶升麻苷抗痴呆作用可能与其对抗体内自由基生成以及改善中枢胆碱能系统功能有关，其作用途径有待于进一步的深入研究。

［参考文献］
[1]中国药典一部[S]2010：126
[2]南京中医药大学中药大辞典上册[M]上海：上海科学技术出版社，2006：1225
[3]李媛，宋媛媛，张洪泉肉苁蓉的化学成分及药理作用研究进展[J]中国
野生植物资源，2010，29（1）：7
[4]Flood T，Cherkin A Scopolamine effects on memory retention on mice：a model of dementia[J]Behav Neurol Biol，1981，45（2）：169
[5]李仪奎中药药理实验方法学[M]上海：上海科学技术出版社，2006：254
[6]朴景华，蒲小平，马建，等类叶升麻苷对东莨菪碱所致记忆获得性障碍的改善作用[J]中国药理学通报，2001，17（6）：625
[7]曾瑾，罗霞，郑林用，等灵芝醇提物对记忆障碍模型小鼠学习记忆的影响[J]中药药理与临床，2009，25（4）：42
[8]邓敏，赵金垣，屠鹏飞，等松果菊苷对TNFα诱导的SHSY5Y细胞凋亡的保护作用[J]中国药理学通报，2005，21（2）：169
[9]Shinotoh H，Namba H，Fukushi K，et al Progressive loss of cortical acetylcholinesterase activity in association with cognitive decline in Alzheimer′s disease：a positron emission tomography study[J]Ann Neurol，2000，48（2）：194
[10]孙向红，刘洪玲，戚欣，等中药复方海康灵对东莨菪碱所致痴呆小鼠学习记忆影响及其机制的实验研究[J]中国医院药学杂志，2008，28（6）：442
[11]Piccardi M，Congiu D，Squassina A，et al Alzheimer’s disease：casecontrol association study of polymorphisms in ACHE，CHAT，and BCHE genes in a Sardinian sample[J]Am J Med Genet B Neurop sychiatr Genet，2007，144（7）：895。