核酸提取及扩增技术简介(含等温扩增技术)-综述
第九章 核酸等温扩增技术
品质量安全方面的第一部专门法律，该 法明确提出了转基因农产品标识制度， 对转基因农产品安全问题的重视可见一 斑。
• 早在 2001 年，我国就建立了转基因农产品 的标识制度。当年颁布的《农业转基因生 物安全管理条例》及其 2002 年的两部配套 规章《农业转基因生物标识管理办法》和 《农业转基因生物标识审查认可程序》对 这一制度作出了较为详细的规定。此外， 同年颁布的《进出境转基因产品检验检疫 管理办法》和 2002 年颁布的《转基因食品 卫生管理办法》也对这一制度作出了规定。
• B3引物：下游外部引物(Backward Outer Primer )，由 B3区域组成，和靶基因的B3c区域互补。
扩增原理
• 60—65℃是双链DNA复性及延伸的中间 温度，DNA在65℃左右处于动态平衡状 态。因此，DNA在此温度下合成是可能 的。利用4种特异引物依靠一种高活性链 置换DNA聚合酶。使得链置换DNA合成 在不停地自我循环。
中国的转基因标识政策
• 根据《农业转基因生物安全管理条例》 和《农业转基因生物标识管理办法》规定， 中国采用有标识目录的定性强制性标识制 度。2002年公布的标识目录包括5大类17种。 表示方法分3种，包括“转基因xx”、“含 有转基因xx”、“由转基因xx原料加工， 但已不含有转基因成分”。关于阴性标识， 未作相关规定。
• 《进出境转基因产品检验检疫管理办法》 则规定了进出境转基因产品标识制度。
中国转基因标识现状及建议
现状：
我国的转基因标识制度目前还比较粗糙和单薄， 主要见于《农业转基因生物安全管理条例》及其 配套规章《农业转基因生物标识管理办法》和 《农业转基因生物标识审查认可程序》 。另外 《进出境转基因产品检验检疫管理办法》和《转 基因食品卫生管理办法》也对这一制度作出了规 定。这些法律规定仍有很多不足之处，不能适应 规制转基因生物安全的要求，也不能满足消费者 知情权的需要。
恒温扩增技术综述
恒温扩增技术综述(总6页)--本页仅作为文档封面，使用时请直接删除即可----内页可以根据需求调整合适字体及大小--摘要：恒温扩增技术是继PCR技术后发展起来的一门新型的体外核酸扩增技术。
目前主要的恒温扩增技术有：滚环核酸扩增、环介导等温扩增、链替代扩增、依赖核酸序列扩增和解链酶扩增。
它们都具有共同的特点：恒温、高效、特异、不需要特殊的仪器设备。
本文就现阶段恒温扩增技术的特点及其在动物疫病检测中的应用情况和前景做一综述。
关键词：恒温扩增；PCR引言：近年来，随着分子生物学技术的迅速发展，基于核酸检测的诊断方法已大量建立并广泛应用于动物疾病的实验室检测中，恒温扩增技术就是在此背景下出现的。
与其它的核酸扩增技术相比，恒温扩增有快速、高效、特异的优点且无需专用设备。
所以它一经出现就被许多学者认为是一种有可能与PCR 媲美的检测方法，目前主要的恒温扩增技术有：滚环核酸扩增（rolling circle amolification，RCA）、环介导等温扩增（loop-mediated isothermal amplification，LAMP）、链替代扩增（strand displacement amplification，SDA）、依赖核酸序列扩增（nucleicacid sequence based amplification，NASBA）和解链酶扩增（helix dependent amplification，HAD），这些技术各有特点，这也决定了它们在动物疾病检测中的应用情况，下面就它们的原理、特点及其在动物疫病检测中的应用情况进行综述。
1滚环核酸扩增1. 1 滚环核酸扩增的原理滚环核酸扩增（rolling circleamolification, RCA）是通过借鉴病原生物体滚环复制DNA 的方式而提出的[1]，可分为线性扩增与指数扩增两种形式。
线性RCA 是引物结合到环状DNA 上后，在DNA 聚合酶作用下被延伸，产物是具有大量重复序列（与环状DNA 完全互补）的线状单链。
核酸恒温扩增技术的原理及其应用
核酸恒温扩增技术的原理及其应用陈云芳;詹国辉;高渊【摘要】介绍基于核酸恒温扩增技术原理的赖解旋酶恒温基因扩增技术、实时荧光核酸恒温扩增检测技术、环介导等温扩增技术和切口酶核酸恒温扩增技术的原理和特点;以及核酸恒温扩增技术在疾病诊断、流行病学监测、食品安全检测、动物病原物检测等领域的应用情况,并对该技术在植物检疫领域的应用前景作出展望.【期刊名称】《西南林业大学学报》【年(卷),期】2010(030)0z1【总页数】4页(P30-32,40)【关键词】核酸恒温扩增技术;动植物检疫;原理【作者】陈云芳;詹国辉;高渊【作者单位】苏州出入境检验检疫局,江苏,苏州,215126;苏州出入境检验检疫局,江苏,苏州,215126;苏州出入境检验检疫局,江苏,苏州,215126【正文语种】中文PCR技术自1985年建立以来，发展迅速、应用广泛，近年来，基于PCR的基本原理，许多学者充分发挥创造性思维，对PCR技术进行研究和改进，使其得到完善，并在此基础上派生出了许多新的扩增技术。
简并引物扩增法、巢居PCR、单一特异引物PCR、连接介导PCR、RACE-PCR、定量PCR等多种扩增技术被广泛应用在科学研究、病原物诊断、人类基因组工程研究、法医、组织和群体生物学等各个领域。
PCR方法依据其灵敏度高、特异性好，成为目前最精准的基因诊断方法。
然而常规PCR技术存在如下缺陷：(1)需要昂贵的PCR仪；(2)多因素影响扩增效果；(3)常引起非特异性扩增；(4)扩增反应时间长，一般需要几个小时，难以在基层推广应用等诸多的缺陷[1] , 急需更新的方法来替代。
核酸恒温扩增技术的出现满足了上述要求，本文将对现有的核酸恒温扩增技术逐一介绍，并就该技术在植物检疫领域的应用前景作一展望。
1 核酸恒温扩增技术原理及其方法1.1 赖解旋酶恒温基因扩增技术赖解旋酶恒温基因扩增技术(helicase dependent isothermal DNA amplification,简称HDA)，是由美国New Englang Biolabs 的研究人员模拟动物体内DNA的复制机制发明的一种新的体外恒温基因扩增技术[2-3]。
等温核酸扩增技术进展
等温核酸扩增技术进展等温核酸扩增技术已广泛应用于生物分析的体外核酸扩增，本文综合国内外报道，对等温核酸扩增技术的进展进行简要综述，包括依赖核酸序列型扩增（NASBA）、链置换扩增（SDA）、滚环扩增（RCA）、环介导等温扩增（LAMP）、单引物等温扩增（SPIA）、交叉引物等温扩增（CPA）、新型等温多自配引发扩增（IMSA）的原理、重要特性、应用及未来的展望。
核酸基于其生物特性被用来作为生物研究和医疗诊断的重要生物标志物。
聚合酶链式反应（PCR）是第一个也是最受欢迎的用于扩增及低丰度检测核酸扩增技术。
尽管PCR技术被广泛地应用到各个领域，但他需要反复的热循环及精密仪器的缺点限制了其在资源有限或实地分析中的应用。
近年来出现及迅猛发展的等温核酸扩增技术有望成为未来发展的新趋势，因为其只需恒温装置（例如：水浴锅），便能进行快速且高效的扩增反应。
从20世纪90年代始，很多等温核酸扩增技术被发展起来，多种等温扩增方法都具有高灵敏度，而且有部分技术已成功转向商业化[1]。
在众多的等温扩增技术中，环介导等温扩增技术应用范围较为广泛，其他的等温扩增技术还有依赖核酸序列型等温扩增、链置换等温扩增、滚环等温扩增、单引物等温扩增、交叉引物等温扩增。
本文综述了这些等温扩增技术及其在分子诊断的应用，并探讨等温扩增技术的发展及前景。
2 等温核酸扩增技术2.1 依赖核酸序列型扩增技术依赖核酸序列型扩增技术（nucleic acid sequence-based amplification，NASBA）[2]，是一种基于转录依赖扩增系统建立起来的等温扩增技术。
NASBA通过模拟逆转录病毒复制方式设计而成，用于扩增单链RNA序列。
NASBA的基本原理是模板RNA被反义引物识别，并在逆转录酶的RNA依赖型DNA聚合酶活性作用下形成互补DNA链，而RNA-DNA复合体被核糖核酸酶H（RNase H）处理，使得原来的RNA链被降解，接着在逆转录酶的DNA依赖型DNA聚合酶活性作用下，含T7启动子的特异引物（oligdNTP）识别新合成的单链DNA链，形成含T7启动子的双链DNA结构，该结构可作为随后循环扩增的底物。
核酸环介导等温扩增技术_蔡哲钧
作者单位:430030武汉,华中科技大学同济医学院(蔡哲钧、冯杰雄);310006杭州,浙江大学医学院(朱圣禾)·综述·核酸环介导等温扩增技术蔡哲钧综述 冯杰雄 朱圣禾审校 【摘要】 介绍环介导等温扩增技术的基本原理、特点及应用前景。
环介导等温扩增技术具有简单、快速、特异性强和扩增效率高等特点,目前可检测乙型肝炎病毒、流感病毒、疱疹病毒、水痘-带状疱疹病毒、腮腺炎病毒、麻疹病毒、腺病毒、S A RS冠状病毒、呼吸道合胞病毒、西尼罗河病毒、结核分支杆菌、痢疾志贺菌、大肠杆菌、螺旋体、肺炎链球菌和耶氏菌等。
【关键词】 核酸类; 基因扩增 上世纪90年代以来,出现了几种新的核酸扩增方法:核酸等温扩增法(nucleic acid sequence-based am plificatio n,NAS-BA)、自序列复制法(self-sus-tained sequence replicatio n,3S R)和链置换扩增法(strand displacement amplification,SDA)等。
No to-mi等[1]于2000年开发了一种新颖的恒温核酸扩增方法,即环介导等温扩增法(loop-mediated iso thermal am plificatio n,LAM P),其特点是针对靶基因的6个区域设计4种特异引物,利用一种链置换DNA聚合酶(Bst DNA po lymerase)在等温条件(65℃左右)保温几十分钟,即可完成核酸扩增反应。
不需要模板的热变性、长时间温度循环、繁琐的电泳、紫外观察等过程。
LAM P是一种崭新的DNA扩增方法,具有简单、快速、特异性强的特点,具有替代PCR方法的可能性。
现将该项技术的研究进展作一综述。
LAM P法的原理该方法主要是利用4种不同的特异性引物识别靶基因的6个特定区域,且可在等温条件进行扩增反应。
基因的扩增和产物的检测可一步完成,扩增效率高,可在15～60min扩增109～1010倍;特异性高,所有靶基因序列的检测可只通过扩增产物的有、无来判别。
核酸等温扩增技术
核酸等温扩增技术
核酸等温扩增技术是一种核酸体外扩增技术，其反应过程始终维持在恒定的温度下，通过添加不同活性的酶和各自特异性引物（或不加）来达到快速核酸扩增的目的。
该技术具有与PCR技术相比核酸等温扩增对仪器的要求大大简化，反应时间大大缩短，更能满足快速简便的需求等优点。
核酸等温扩增技术是一类技术的统称，包括但不限于LAMP、NASBA、RCA、SAT、IMSA、RPA、SPIA等多种具体方法。
请注意，核酸等温扩增技术虽然具有诸多优点，但也有其局限性，例如可能存在交叉污染的风险，影响检测的准确性。
因此，在使用该技术时，需要采取有效的措施来避免这些问题。
核酸等温扩增技术及其应用
核酸等温扩增技术及其应用一、引言核酸等温扩增技术是一种新兴的分子生物学技术，其在生物医学研究、临床诊断和基因工程等领域具有重要应用价值。
本文将详细介绍核酸等温扩增技术的原理、方法和应用。
二、核酸等温扩增技术的原理核酸等温扩增技术是一种在恒温条件下进行的核酸扩增方法，通过利用逆转录酶和DNA聚合酶的活性，实现核酸的扩增。
其基本原理是通过逆转录酶将RNA模板转录成互补的DNA链，然后利用DNA聚合酶在恒温条件下合成新的DNA链。
这种等温扩增方法不需要复杂的温度变化，且具有较高的特异性和敏感性。
三、核酸等温扩增技术的方法核酸等温扩增技术主要包括RT-LAMP（逆转录环介导等温扩增法）和RPA（等温扩增法）。
RT-LAMP方法利用4-6个特异性的引物，在同一温度下通过逆转录酶和DNA聚合酶的协同作用，在短时间内扩增目标核酸。
RPA方法则利用DNA聚合酶和DNA单链结合蛋白在等温条件下，通过引物结合、DNA解旋、DNA聚合等步骤，实现核酸的扩增。
四、核酸等温扩增技术的应用1. 医学诊断：核酸等温扩增技术在医学诊断中有广泛应用。
例如，可以通过核酸等温扩增技术检测病毒、细菌和真菌等病原体，快速确认感染病原体的种类和数量，为临床治疗提供依据。
此外，核酸等温扩增技术还可以用于检测肿瘤标志物、遗传病突变等，为早期癌症和遗传病的筛查提供技术支持。
2. 食品安全检测：核酸等温扩增技术可以应用于食品安全检测领域。
例如，可以利用核酸等温扩增技术检测食品中的病原菌、转基因成分和食品中的传染性病毒等。
这种技术具有快速、灵敏和高效的特点，可以为食品安全监管提供重要依据。
3. 环境监测：核酸等温扩增技术在环境监测中也有广泛应用。
例如，可以利用核酸等温扩增技术检测水体、土壤和空气中的微生物，了解环境中的微生物多样性和污染程度。
此外，核酸等温扩增技术还可以用于环境污染源的追踪和监测。
4. 生物工程：核酸等温扩增技术在生物工程领域也有重要应用。
核酸的体外扩增概述
核酸的体外扩增概述核酸体外扩增，也称为聚合酶链式反应（PCR），是一种重要的分子生物学技术，用于扩增和复制特定DNA或RNA序列。
PCR技术的广泛应用和成功应用于许多领域，例如基因检测、疾病诊断、法医学、基因工程等。
本文将对PCR技术进行概述。
PCR技术的原理是依靠DNA的双链结构，通过循环变性、引物结合和DNA合成三个步骤，实现对特定DNA序列的放大。
这三个步骤分别是变性步骤、退火步骤和延伸步骤。
变性步骤：PCR反应开始时，DNA双链被加热至95°C以上，使两个DNA链分离，并形成两个单链DNA（ssDNA）。
高温对DNA的作用是破坏氢键，导致核苷酸碱基对之间的结合断裂。
退火步骤：PCR反应降温至50°C-60°C，引物（primer）结合到目标DNA的末端，引物是DNA聚合酶所需要的模板以及DNA链延伸的起始点。
延伸步骤：PCR反应在60°C-75°C下进行，加入了一种DNA聚合酶，如热稳定的Taq聚合酶。
该酶识别引物，并根据引物上的信息开始合成新的DNA链。
在延伸步骤中，引物结合到目标DNA的3'末端，DNA聚合酶沿着模板链合成新的DNA链，通过碱基配对法则，以模板链作为基础合成新的互补链。
这个过程重复多次，每次延伸都以新合成的DNA链的3'末端为起始点，最终在特定的PCR循环中产生大量的复制DNA。
PCR技术可分为传统PCR和实时定量PCR两种方法。
传统PCR是利用热循环PCR仪进行多个PCR循环，每个循环包括变性、退火和延伸步骤。
由于PCR是在反应管中进行的，所以扩增产物只能通过凝胶电泳进行检测，不能实时监测。
实时定量PCR是在PCR反应中添加一种荧光信标，通过检测荧光信号的强度来实时监测扩增过程。
实时定量PCR具有高效、快速、准确的优点，能够定量测量样本中起始模板的数量。
同时，实时定量PCR还具有多样性，可用于各种样品，包括基因型分析、基因表达分析、病原体检测等。
核酸扩增技术教学课件ppt
RT-PCR技术
总结词
转录、反转录、灵敏度高。
详细描述
RT-PCR技术是一种将RNA的逆转录反应和PCR反应联合应用的方法，具有高 灵敏度、高特异性、简单易行等特点，常用于检测细胞中基因表达水平。
qPCR技术
总结词
定量、高灵敏度、实时监测。
详细描述
qPCR技术即实时荧光定量PCR技术，是一种对特定DNA片段进行实时定量检测 的方法，具有高灵敏度、高特异性、可实时监测等特点，已广泛应用于基因表达 分析、病原体检测等领域。
详细介绍qPCR反应所需的各个组分及其作用，如 模板DNA、引物、dNTPs、DNA聚合酶、荧光染 料或探针等。
qPCR数据分析
介绍qPCR实验数据应该如何进行分析，包括扩增 曲线和熔解曲线的绘制和分析，以及Ct值的计算 和应用。
04
核酸扩增技术的数据分析与解读
数据分析方法与技巧
描述性统计分析
对实验数据进行描述性统计，如均 值、标准差等，以了解数据的集中 趋势和离散程度。
通过检测特定基因的扩增或缺失，对疾病进 行诊断和预测。
生物制药
进化研究
利用核酸扩增技术生产重组蛋白、抗体等生 物药物，用于治疗和预防疾病。
研究物种间的基因序列差异，揭示物种进化 的历史和机制。
误差分析与质量控制
01
误差来源
分析核酸扩增技术的误差来源，如试剂质量、操作流程、仪器设备等
。
02
质量控制
制定质量控制标准，如重复实验、阳性对照等，以确保实验结果的准
2023
《核酸扩增技术教学课件 ppt》
目 录
Байду номын сангаас
• 核酸扩增技术概述 • 核酸扩增技术的种类与特点 • 核酸扩增技术实验方案与步骤 • 核酸扩增技术的数据分析与解读 • 核酸扩增技术的优化与改进建议 • 核酸扩增技术的未来发展趋势与展望
等温扩增技术的原理及应用
等温扩增技术的原理及应用等温扩增技术是一种新型的DNA扩增方法，它可以在等温条件下进行，无需对温度进行周期性变化，因此非常稳定，同时易于操作，成本也比传统的PCR方法低。
它的原理是利用一种特殊的DNA聚合酶，即Bst DNA聚合酶，在等温条件下，可将一条DNA模板扩增成数百万个拷贝。
其主要应用在医学诊断、生物工程、生物物质检测等领域。
1. 原理等温扩增技术的原理是利用Bst DNA聚合酶的内切割酶活性，在等温条件下，通过循环增强的DNA合成反应，将DNA模板快速扩增成数百万个拷贝。
具体而言，Bst DNA聚合酶可以通过在DNA链中寻找配对错误的碱基，并对其进行4’-5’链切断，然后在3’-5’方向上进行DNA聚合。
在等温条件下，反应温度一般为55-65℃，DNA聚合酶可以持续高效地工作，不需要多次升温降温，避免了反应条件的不稳定性，而且还可以进行高密度扩增，同时可以直接从样品中扩增出足够数量的DNA片段，避免了DNA的复制和纯化过程。
因此等温扩增技术的速度比传统PCR方法快，同时更加稳定，特别适合于用于快速DNA检测。
2. 应用(1) 医学诊断等温扩增技术可用于许多医学诊断领域，例如病毒和感染性疾病的快速检测和诊断。
病毒感染检测可用于检测脑膜炎病毒、细菌性脑膜炎、甲型H1N1流感等病毒感染。
这样，通过等温扩增技术，可以快速检测是否感染病毒或细菌，辅助诊断和治疗。
(2) 生物工程等温扩增技术可用于检测和筛选新的基因，进行DNA合成和基因编辑，生产转基因产品。
例如，科学家可以使用等温扩增技术扩增和检测工业微生物中的特定基因，在菌株发酵过程中对基因进行编辑和修饰，改良微生物发酵过程，提高产物质量和含量。
(3) 生物物质检测等温扩增技术还可用于生物物质检测领域。
例如，在食品安全检测中，可以使用等温扩增技术检测食品样本中的细菌、真菌、病毒等，判断其是否安全。
同样地，在水质检测领域，等温扩增技术可以帮助快速检测水中的大肠杆菌、肠炎沙门氏菌等细菌。
核酸等温扩增
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RPA技术
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RPA技术简介
RPA（recombinase polymerase amplification）技术，2006年 由剑桥大学的Olaf Piepenburg等人建立。
该技术利用一种重组酶使单链引物与双链DNA模板中互补片段结 合，启动DNA复制；不需要DNA解链过程。
其具有便携，免去PCR仪等大型实验室设备的使用；快速，20分 钟内得到检测结果；灵敏度高，几个拷贝即可检出；便于保藏， 采用冻干粉末状酶等优点。
核酸等温扩增技术在病毒 检测中的应用
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核酸等温扩增技术
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核酸等温扩增的优势
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核酸等温扩增的种类
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环介导核酸等温扩增技术（LAMP）
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LAMP引物设计原则
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LAMP扩增引物设计
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LAMP扩增过程
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环引物在茎环结构环状结构处识别并不断延伸， 使双链过早打开，有利于复杂茎环结构的成环和 外引物置换作用。这一定程度上加速了整个 LAMP 扩增循环阶段的反应。
针对靶标核酸特异设计的引物和分子信标，实现特 异性的扩增和检测，有效防止假阴性结果。
SAT检测的靶标核酸是RNA，而RNA在病原体外的环境 中易降解，检测结果可作为区分死菌、活菌的依据， 因此更利于用药之后疗效的监测和判愈。
SAT技术的高灵敏度、高特异性则可以最大程度地确 保检测结果的高度准确，高度可靠，有效避免假阳 性、假阴性结果。
• LAMP 的反应结果只有两种即扩增与不扩增，故 在产生非特异性扩增时是难以进行后续鉴定的；
详解核酸等温扩增技术
详解核酸等温扩增技术近年新发展起来的核酸等温扩增技术，无论是在实际操作还是仪器要求方面，都比PCR 技术更为简单方便，它摆脱了对精良设备的依赖，在临床和现场快速诊断中显示了其良好的应用前景。
在众多等温扩增技术中，环介导等温扩增目前已在一定范围内得到了应用，其他一些新发展起来的等温扩增技术，如链替代等温扩增、滚环等温扩增、依赖解旋酶等温扩增、依赖核酸序列等温扩增、单引物等温扩增和核酸快速等温检测放大等技术，也在不断发展与完善之中。
为了更好地有选择地开发利用这方面技术，现就这些等温扩增技术的原理、特点及应用进行简要总结。
环介导等温扩增(Loop-mediated isothermalamplification，LAMP )环介导等温扩增(LAMP)是Notomi等于2000年首先提出来的一种新的核酸扩增技术，其原理主要是基于靶基因3'和5'端的6个区域设计3对特异性引物，包括1对外引物、1对环状引物和1对内引物，3种特异引物依靠链置换BstDNA聚合酶，使得链置换DNA合成不停地自我循环，从而实现快速扩增。
反应1h后可根据扩增副产物焦磷酸镁沉淀形成的浊度或者荧光染料进行判断扩增情况。
此反应先形成哑铃状模板，进入循环扩增阶段，再进行伸长、循环扩增，共3个阶段。
Loop-mediated isothermal amplification(LAMP，Fig1)依赖核酸序列的扩增(Nucleic acid sequence-based amplification，NASBA)依赖核酸序列的扩增技术 (NASBA) 是 1991 年由加拿大 Can －gene 公司首次介绍。
它是一项以核酸序列中RNA为模板，由两个引物介导的、连续均一的特异性体外等温扩增核苷酸序列的酶促过程。
整个反应由非循环相和循环相组成: 首先进行非循环相，在AMV 逆转录酶的作用下，引物I 与模板RNA 退火后合成cDNA，形成RNA/DNA 杂合体，随即RNaseH 降解 RNA，引物Ⅱ与 cDNA 退火，合成第二条 DNA 互补链。
核酸扩增技术
目录
CONTENTS
• 核酸扩增技术概述 • 常用核酸扩增技术 • 核酸扩增技术的应用 • 核酸扩增技术的优缺点 • 核酸扩增技术实验操作流程
01 核酸扩增技术概述
定义与原理
定义
核酸扩增技术是一种通过特定的生物 化学反应，将目标核酸片段在体外进 行快速、特异的复制的技术。
原理
基于DNA或RNA的复制机制，通过使 用引物和特定的酶，将目标核酸片段 进行指数级扩增，从而实现核酸的快 速扩增。
临床意义评估
结合临床样本情况和患者病情，对扩增结果进行解读 ，为临床诊断和治疗提供依据。
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THANKS
历史与发展
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02
03
1980年代初期
最早的核酸扩增技术问世 ，基于PCR技术。
1990年代
随着技术的不断改进，出 现了多种核酸扩增技术， 如LAMP、TMA等。
21世纪
随着测序技术的发展，新 一代核酸扩增技术如数字 PCR、单分子测序等逐渐 兴起。
技术分类
基于PCR的方法
包括常规PCR、实时荧光定量PCR、数字 PCR等。
可定量
通过扩增过程中的荧光标记或电泳技术，可以确定核酸的相对或绝对 含量，有助于了解病情严重程度和治疗效果。
应用广泛
核酸扩增技术可以应用于各种不同的生物和医学领域，如病毒检测、 细菌鉴定、基因表达分析等。
缺点
易污染
扩增过程中可能出现假阳性结果，主 要原因是扩增产物污染或交叉污染。
高成本
核酸扩增技术需要昂贵的仪器、试剂 和探针，导致检测成本较高。
要点二
肿瘤诊断
通过扩增肿瘤相关基因的表达产物，可以辅助肿瘤的诊断 和预后评估，为肿瘤个体化治疗提供依据。
核酸等温扩增ppt课件
• 产物相当复杂，无法进行后续的回收、鉴定、克 隆等基因工程操作。
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NASBA的优缺点
NASBA 是种 RNA 扩增法，因此其主要应用 是对 RNA 病毒的检测。
整个反应能在 42℃条件下进行，经过两个 小时的扩增可将模板 RNA放大至 109~1010 倍。
近年来，各国学者陆续利用RPA技术，对于DNA病毒、细菌等 进行核酸检测。
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RPA的原理
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四氢呋喃非碱基位点类似物
tetrahydrofuran abasic–site mimic (THF)
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结果观察：
Basic RPA
lateral-flow strip
exo RPA
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引物、探针设计
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LAMP的操作过程
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检测方法
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LAMP技术在病原体检测中的应 用
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LAMP技术小结
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LAMP技术的优点
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存在缺陷
• 所识别的靶位序列长度不得过大，一般在300 bp 以内。因此，无法进行长片段 DNA 的扩增；
• LAMP 技术具备高灵敏度，对操作要求严格分区， 否则极易受到污染而产生假阳性结果；
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SAT技术的原理
SAT技术（Simultaneous Amplification and Testing）是基于TMA （Transcription mediated amplification）恒温扩增技术发展起来的一项最新 核酸检测技术，是国内企业自主研发的专利技术
核酸提取与PCR扩增实验教案
核酸提取与PCR扩增实验教案引言：核酸提取与PCR扩增是现代生物学研究中常用的实验技术。
核酸提取是从生物样本中提取出DNA或RNA的过程，而PCR扩增则是通过复制DNA序列来增加样本中特定基因的数量。
本文将介绍核酸提取与PCR扩增实验的步骤和原理，并探讨其在生物学研究中的应用。
一、核酸提取实验步骤与原理：1. 样本准备：准备待提取核酸的生物样本，如血液、组织或细胞。
2. 细胞破碎：使用细胞裂解缓冲液将细胞膜破裂，释放细胞内的核酸。
3. 蛋白质去除：通过加入蛋白酶来降解蛋白质，使其不能干扰核酸的提取。
4. DNA/RNA沉淀：通过加入盐溶液，使得核酸形成可见的沉淀。
5. 洗涤：用酒精洗涤沉淀，去除杂质。
6. 溶解：将核酸沉淀溶解于适当的缓冲液中，以便后续实验使用。
核酸提取的原理是利用化学试剂破坏细胞膜和核蛋白结构，使核酸释放出来。
然后通过沉淀和洗涤步骤，去除其他杂质，最后将核酸溶解于缓冲液中。
二、PCR扩增实验步骤与原理：1. 反应体系准备：准备PCR反应所需的试剂，包括DNA模板、引物、dNTPs、酶和缓冲液等。
2. 反应条件设定：根据所需扩增的DNA片段大小和序列特性，确定PCR反应的温度和时间等条件。
3. 反应进行：将反应体系加热至变性温度，使DNA链分离，然后降温至引物结合温度，使引物与DNA链结合，最后加热至延伸温度，使DNA链被酶复制。
4. 反应分析：通过电泳等方法，将PCR产物分离并检测。
PCR扩增的原理是利用DNA聚合酶酶活性，通过不断重复变性、引物结合和延伸步骤，将目标DNA片段扩增至可检测的数量。
三、核酸提取与PCR扩增在生物学研究中的应用：1. 基因检测：核酸提取与PCR扩增技术可以用于检测基因突变、基因表达水平等，对于遗传病的诊断和研究具有重要意义。
2. 病原体鉴定：通过核酸提取与PCR扩增技术，可以从临床样本中快速鉴定病原体，有助于疾病的早期诊断和治疗。
3. 进化研究：核酸提取与PCR扩增技术可以用于研究物种间的遗传关系和进化历程，揭示生物多样性和进化机制。
等温扩增技术实验报告(3篇)
第1篇一、实验目的1. 掌握等温扩增技术的原理和操作步骤。
2. 学习利用等温扩增技术对特定靶标进行扩增和检测。
3. 了解等温扩增技术在分子生物学研究中的应用。
二、实验原理等温扩增技术（Isothermal Amplification Technology）是一种在恒定温度下进行核酸扩增的技术。
与传统的PCR技术相比，等温扩增技术具有操作简便、快速、成本低、特异性高等优点。
其原理是利用特定设计的引物和聚合酶在恒定温度下进行核酸扩增，无需热循环，从而实现快速、高效、特异的核酸扩增。
三、实验材料1. 样本：含有靶标基因的DNA样本。
2. 引物：针对靶标基因设计的引物。
3. 聚合酶：等温扩增用聚合酶。
4. 反应体系：缓冲液、dNTPs、引物、聚合酶等。
5. 实验器材：PCR仪、离心机、电泳仪、凝胶成像系统等。
四、实验步骤1. 引物设计：根据靶标基因的序列设计引物，确保引物特异性高、Tm值相近。
2. 反应体系配置：按照实验要求，配置反应体系，包括缓冲液、dNTPs、引物、聚合酶等。
3. 反应：将配置好的反应体系加入PCR管中，放入PCR仪进行等温扩增。
反应温度根据所使用的聚合酶和引物进行优化。
4. 扩增产物检测：将扩增产物进行电泳分析，观察扩增结果。
5. 结果分析：根据电泳结果，判断靶标基因是否存在，并进行定量分析。
五、实验结果与分析1. 扩增结果：根据电泳结果，观察到扩增产物条带，说明等温扩增成功。
2. 特异性分析：通过设置阴性对照和阳性对照，验证扩增结果的特异性。
3. 定量分析：通过比较扩增产物条带的亮度，对靶标基因进行定量分析。
六、实验讨论1. 引物设计：引物设计是等温扩增技术成功的关键。
引物设计时应考虑引物长度、Tm值、GC含量等因素，以确保扩增结果的特异性。
2. 反应体系优化：反应体系中的各种成分比例对扩增结果有较大影响。
在实验过程中，应优化反应体系，以提高扩增效率和特异性。
3. 扩增温度优化：不同聚合酶对温度的敏感度不同，因此在实验过程中，需要根据所使用的聚合酶和引物优化扩增温度。
核酸提取与PCR扩增实验教案
核酸提取与PCR扩增实验教案引言：核酸提取与PCR扩增是生物学领域中常用的实验技术，广泛应用于基因检测、疾病诊断、遗传学研究等方面。
本文将介绍核酸提取与PCR扩增的实验教案，旨在帮助读者了解实验原理、步骤和注意事项，并提供相关实验技巧。
一、实验原理核酸提取是从生物样品中分离纯化核酸的过程，常用的方法有酚-氯仿法、盐法、磁珠法等。
PCR扩增是利用聚合酶链式反应（PCR）技术，通过特定引物将目标DNA序列扩增至数百万倍，从而实现对目标基因的快速检测和定量。
二、实验步骤1. 核酸提取a. 准备样品：将待提取的生物样品（如血液、组织、细胞）放入离心管中。
b. 细胞破碎：加入细胞裂解液，破坏细胞膜释放核酸。
c. 蛋白质沉淀：加入蛋白质沉淀剂，将蛋白质与核酸分离。
d. 氯仿萃取：加入氯仿，将核酸分离至水相层。
e. 洗涤与纯化：将水相层转移至新离心管，加入洗涤液洗涤核酸，最后用纯化液纯化核酸。
f. 保存提取的核酸：将提取的核酸保存在-20℃的冰箱中，避免降解。
2. PCR扩增a. 反应体系准备：根据实验需要，配制PCR反应液，包括DNA模板、引物、聚合酶、缓冲液和dNTPs等。
b. 反应条件设置：根据目标序列的特性，设置PCR反应的温度、时间和循环次数。
c. PCR反应：将反应液加入PCR管，放入热循环仪中进行PCR扩增。
d. 电泳分析：将PCR产物与DNA分子量标准品一同进行琼脂糖凝胶电泳，根据PCR产物的大小判断扩增是否成功。
e. 结果分析：根据电泳结果判断目标基因的存在与否，以及扩增的效果。
三、实验注意事项1. 实验操作要严格遵守无菌技术，避免污染样品。
2. 在核酸提取过程中，避免RNA酶的污染，使用RNase-free试剂和耗材。
3. PCR反应液的配制要准确，避免引物和聚合酶的浓度过高或过低。
4. PCR反应管要密封良好，避免蒸发和外源性DNA污染。
5. 电泳时要注意电流和电压的设置，避免样品烧毁和电泳缓冲液溢出。
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核酸提取及扩增技术原理简介1核酸理化性质RNA和核苷酸的纯品都呈白色粉末或结晶，DNA则为白色类似石棉样的纤维状物。
除肌苷酸、鸟苷酸具有鲜味外，核酸和核苷酸都呈酸味。
DNA、RNA和核苷酸都是极性化合物，一般都溶于水，不溶于乙醇、氯仿等有机溶剂，它们的钠盐比游离酸易溶于水，RNA钠盐在水中溶解度可达40g/L。
DNA可达10g/L，呈黏性胶体溶液，在酸性溶液中，DNA、RNA易水解，在中性或弱碱性溶液中较稳定。
2细胞破碎大多数核酸分离与纯化的方法一般都包括了细胞裂解、核酸与其他生物大分子物质分离、核酸纯化等几个主要步骤。
每一步骤又可由多种不同的方法单独或联合实现。
根据原理不同，细胞破碎主要包含机械破碎法，化学试剂法，酶溶解法。
1）机械方法：包括低渗裂解、超声裂解、微波裂解、冻融裂解和颗粒破碎等物理裂解方法。
这些方法用机械力使细胞破碎，但机械力也可引起核酸链的断裂，因而不适用于高分子量长链核酸的分离。
有报道超声裂解法提取的核酸片段长度从< 500bp~>20kb之间，而颗粒匀浆法提取的核酸一般<10kb。
2）化学试剂法：经一定的pH 环境和变性条件下，细胞破裂，蛋白质变性沉淀，核酸被释放到水相。
上述变性条件可通过加热、加入表面活性剂（SDS、Triton X-100、Tween 20、NP-40、CTAB、sar-cosyl、Chelex-100等）或强离子剂（异硫氰酸胍、盐酸胍、肌酸胍）而获得。
而pH环境则由加入的强碱（NaOH）或缓冲液（TE、STE 等）提供。
在一定的pH环境下，表面活性剂或强离子剂可使细胞裂解、蛋白质和多糖沉淀，缓冲液中的一些金属离子螯合剂（EDTA 等）螯合对核酸酶活性所必须的金属离子Mg2+ 、Ca2+ ，从而抑制核酸酶的活性，保护核酸不被降解。
3）酶解法：主要是通过加入溶菌酶或蛋白酶（蛋白酶K、植物蛋白酶或链酶蛋白酶）以使细胞破裂，核酸释放。
蛋白酶还能降解与核酸结合的蛋白质，促进核酸的分离。
其中溶菌酶能催化细菌细胞壁的蛋白多糖N-乙酰葡糖胺和N-乙酰胞壁酸残基间的β-(1 ,4) 键水解。
蛋白酶K能催化水解多种多肽键，其在65 ℃及有EDTA、尿素（1~4mol/ L）和去污剂（0.5%SDS 或1%Triton X-100）存在时仍保留酶活性，这有利于提高对高分子量核酸的提取效率。
3传统的核酸抽提方法传统的核酸抽提方法包括异硫氰酸胍-酚-氯仿抽提法、碱抽提法、溴化十六烷基三甲铵抽提法（CTAB）、溴化乙锭-氯化铯梯度离心法（EtBr-CsCl）、寡聚脱氧胸腺嘧啶核苷酸（Oligo-dT）-纤维素层析法等。
3.1异硫氰酸胍-酚-氯仿抽提法酚-氯仿抽提法是核酸分离的一个经典方法。
细胞裂解后离心分离含核酸的水相，加入等体积的酚：氯仿：异戊醇（25:24:1体积比）混合液，离心后收集上层水相并以异丙醇沉淀其中的，乙醇漂洗掉盐分后弃去，缓冲液或蒸馏水溶解DNA。
异硫氰酸胍是一种强的蛋白变性剂，既可以破裂细胞，也可以抑制核酸酶的作用。
异硫氰酸胍用于RNA抽提由Ulrich等（1977年）首次提出。
该法比较繁琐，已被Chomezynski和Sacchi发明的异硫氰酸胍-酚-氯仿抽提一步法所代替。
此法是用包含异硫氰酸胍、乙酸盐、酚和氯仿的酸性溶液抽提实现RNA与DNA的分离，最后以异丙醇沉淀回收水相中的总RNA。
3.2碱抽提法碱裂解法用于分离大肠杆菌质粒DNA，在十二烷基磺酸钠存在情况下，该法可有效处理所有的大肠杆菌菌株和体积在1mL至500mL以上的细菌培养物。
该法的原理是基于共价闭合环状DNA保持双链的同时对高分子量染色体DNA 进行选择性的碱变性。
细菌蛋白、破碎的细胞壁以及变性的染色体形成表面覆盖有十二烷基磺酸盐的大的复合物，经离心，这些变性的物质被去除，质粒便可从上清中回收。
3.3 CTAB抽提法CTAB是一种非离子去污剂，可从低离子强度溶液中沉淀核酸和酸性多糖，而蛋白质和中性多糖仍留在溶液中，在高离子强度溶液中，CTAB则不会沉淀核酸，而是和蛋白质形成复合物。
因此，CTAB常用于从可产生大量脂多糖的有机体中纯化核酸，如植物和某些革兰氏阴性菌。
该方法后续步骤也是通过有机溶剂、乙醇沉淀等去除蛋白质、污染的盐和其他物质来纯化核酸。
3.4 EtBr-CsCl梯度离心法经乙醇沉淀和重悬后，通过离心，可将核酸浓缩在EtBr-CsCl的一个梯度内。
EtBr的插入改变了核酸分子在高摩尔CsCl中的泳动密度。
相对于线性分子，共价闭合环状分子中的每个碱基结合的EtBr较少，因此它们会聚集在CsCl梯度的较低密度区。
抽提后用适当的非极性溶剂除去疏水的，再以乙醇沉淀回收核酸。
相对于其它纯化方法，梯度离心较为复杂、昂贵和费时，且需要大规模的细菌培养物。
因此，该方法不适合于质粒DNA的小量制备。
3.5 Oligo-dT-纤维素层析法真核mRNA的3’末端大都携带有多聚腺苷酸（Poly(A)）尾，因此可用Oligo-dT-纤维素亲和层析进行分离。
Poly(A)尾可依附于各种支持基质上的Oligo-dT形成稳定的RNA-DNA杂交链。
先用高盐缓冲液稳定核酸杂交链,当非多聚腺苷酸RNA从基质中洗掉后再换用低盐缓冲液使双链结构去稳定化,然后将Poly(A)+RNA从树脂上洗脱下来。
筛选Poly(A)+RNA通常有两种方法：柱层析和批量层析。
柱层析一般用于哺乳动物细胞大量（>25μg）非放射性Poly(A)+RNA的纯化。
当哺乳动物细胞总RNA量较少（<50μg）时常选择批量层析法。
此法使用优级Oligo-dT纤维素在其最适的结合和洗脱温度下实现mRNA的分离纯化。
它也适用于不管是否为放射性RNA的大量样品的处理。
4 固相抽提法相比于传统方法，固相抽提更快速和高效。
它解决了许多液-液抽提存在的许多问题，如分离不完全等。
固相系统抽提核酸依赖缓冲液的pH 值和盐浓度来吸附核酸，其吸附过程基于以下原理：在离液条件下氢与亲水基质发生相互结合作用，在水溶液中则通过阴离子交换柱发生离子交换，以及通过亲和力和大小排除机制。
固相纯化通常采用离心柱通过离心力作用运行。
固相抽提方法的固相支持物有硅胶、玻璃颗粒、硅藻土、阴离子交换载体等。
固相抽提包括细胞裂解、核酸吸附、漂洗和洗脱四个关键性步骤。
首先需要通过特定pH的缓冲液调节柱状态，使其固相表面或功能基团转换成某一特定化学形态；然后将裂解缓冲液处理的样本转移到柱子上，在结合液的高pH值和高盐浓度帮助下靶核酸被吸附到柱上，蛋白质等其它化合物也可与柱表面发生较强的结合,但通过含有竞争性试剂漂洗缓冲液的漂洗过程可以被除掉，最后以TE缓冲液或蒸馏水将纯净的靶核酸从柱子上释放下来。
在纯化过程的漂洗和洗脱步骤中，通常要求快速离心、真空抽滤或者柱分离。
4.1 二氧化硅基质大多数核酸纯化相关产品都是基于二氧化硅选择性结合的独特属性。
二氧化硅的物质形态包括玻璃颗粒如玻璃粉末、硅颗粒、玻璃微纤维和硅藻土。
硅基质纯化的原理是基于带负电的DNA骨架与带正电的硅颗粒之间的高亲和力。
钠离子起到阳离子桥的作用，它可以吸引核酸磷酸骨架里带负电荷的氧。
在高盐条件(pH≤7)下，钠离子可破坏水中的氢与硅中带负电荷的氧之间的氢键。
通过大量漂洗去掉所有污染物后，用TE 缓冲液或蒸馏水在低离子强度下（pH≥7）洗脱纯化的DNA。
除了硅基质，硝酸纤维素和聚酞胺膜（如尼龙膜）也可结合核酸，但是特异性较差。
这些材料常被用作固相核酸转移和杂交的基质。
4.2 玻璃颗粒玻璃颗粒、粉末和玻璃珠都可用于核酸纯化。
例如，从琼脂糖凝胶中分离DNA涉及到用离液盐来促进DNA与普通硅酸盐玻璃、含铅玻璃和硼硅玻璃（玻璃纤维滤器）结合。
核酸吸附到玻璃底物上的机制多半与吸附色谱法类似。
在离液盐存在下，硅胶和玻璃颗粒的混合物可以把核酸从其它物质中分离出，因此这种混合介质也可用于核酸纯化。
4.3 磁性颗粒磁珠分离技术是现今核酸纯化的一种简单高效的方法。
有磁荷的颗粒可通过磁场中的永磁将其移除。
通常，将带有固化亲和配基的磁载体或者与靶核酸有亲和力的预制生物聚合物用于分离步骤。
这些磁颗粒可用不同的合成高分子、生物聚合物、多孔玻璃或者是基于无机磁物质（如表面修饰的氧化铁）的磁颗粒制成。
表面积大的材料结合核酸的能力较强，因此磁珠为分离支持物的较好选择。
如果赋予容器侧壁磁性，样品混合物中结合有核酸的磁颗粒则聚集到容器壁，直接倾倒容器可将其它物质去除。
利用多聚物（如可磁化的纤维素）包裹磁性或顺磁性颗粒。
在一定的盐浓度和聚亚烃基乙二醇存在条件下，磁化纤维素可结合核酸。
小片段核酸需要在高盐浓度下才能与可磁化纤维素颗粒牢固结合。
因此，可以根据核酸片段大小选择不同的盐浓度来释放结合在磁化纤维素上的核酸。
用适当的漂洗缓冲液洗涤结合有核酸的磁化纤维素，再用合适的洗脱缓冲液将靶核酸与纤维素分离。
在所有纯化步骤中，可利用磁场吸引磁化纤维素或将其吸引到管壁，使其与上清分离。
该发明的磁化纤维素中含有高达90%的氧化铁。
纤维素中磁性成分也可用其它磁性化合物如氧化亚铁或氧化镍代替。
基于固相可逆的固定化顺磁珠技术已被用于PCR纯化系统来获取优质DNA。
它只有简单的流程，无需离心和过滤。
扩增子结合到顺磁颗粒后从溶液中被吸引出去，dNTP、引物和盐类等杂质可被漂洗冲走。
Oligo-dT-磁珠是可从总RNA样品中纯化Poly(A)+RNA的Oligo-dT-基质中的一种。
带有Poly(A)尾的RNA吸附到Oligo-dT-磁珠上，然后磁珠被吸引到管底从而使mRNA直接从总RNA中分离。
特殊处理的磁珠使其它核酸的非特异性结合降到最低，保证了mRNA的纯度。
4.4螯合树脂Walsh最初用Chelex 100作为金属离子鳌合剂来提取人类DNA,利用人类细胞在含有5%Chelex 100悬液中煮沸时可使细胞膜破裂释放出DNA，同时与二价金属离子鳌合，从而避免样品中存在的金属离子在高温和低离子强度条件下作为催化剂使DNA降解。
一步完成提取过程，同时获得纯度较高的DNA。
SephadexG-200离心柱法是由Erband Wagner D9 bler（5）发明的,后又经过他人改进。
1g Sephadex G-200水化合后用含高盐的TE缓冲液（10mmol/L Tris-HCl，1mmol/L EDTA，100mmol/L NaCl（pH8））洗5次，自然分离。
用1ml 无菌注射器紧贴洗涤器底部将悬浮液抽出注入15ml的无菌螺帽塑料管中，不断离心（130×g，10min）使颗粒塞紧管底直到形成1.1ml的压实柱。
用100μl含高盐的TE缓冲液冲洗，离心（130×g，10min）并且转移至新的无菌螺帽塑料管中。