大肠杆菌和大肠菌群计数方法

大肠杆菌和大肠菌群计数方法

Enumeration of Escherichia coli and the coliform

章节内容：

•传统检测大肠菌群和大肠杆菌的方法

•LST-MUG法检测冷藏和冷冻食品中的大肠杆菌

（除双壳类软体动物制品外）

•瓶装水检测方法

•贝类和贝类肉制品检测方法

•柑桔类水果汁中大肠杆菌检测方法

•大肠菌群和大肠杆菌计数的其他方法

•参考文件

大肠埃希氏菌，以前常称大肠杆菌，于1885年由德国儿科医生Theodor Escherich 发现，广泛存在于人类和温血动物的肠道中，是人类和动物肠道中需氧性共生菌的优势菌群，维持宿主健康部分生理功能必需的肠道菌。

大肠埃希氏菌属肠杆菌科，肠杆菌科包括许多种细菌，致病菌有沙门氏菌、志贺氏菌、和耶尔森氏菌。虽然大多数的大肠埃希氏菌为非致病菌，但是当宿主免疫力降低或细菌侵入肠道的外组织或器官时，可引起肠外感染。某些血清型可产生毒素，为致病性大肠埃希氏菌，可引起人类腹泻。

1892年，Shardinger建议把大肠杆菌作为粪便污染的指标。由于大肠杆菌广泛存在于人类和动物中，而在其他地方少见。再者，大肠杆菌能发酵葡萄糖（以后改为为乳糖）产生气体。与已知的非产气致病菌容易区别开来。

因此，大肠杆菌的检测已成为水和食品的近期粪便污染指标，表明可能含有致病菌。肠道中柠檬酸盐菌，克雷伯氏菌和肠杆菌能发酵乳糖，与大肠杆菌的生物型非常相似，使得把大肠杆菌作为健康威胁的指标，在实际应用中很复杂。于是，大肠菌群这个术语用来描述这类肠道菌，大肠菌群不是一个分类学上的定义，而是一个工作定义，指的是一群在35℃培养48h，产酸产气的，革兰氏阴性的芽孢杆菌。1914年，每国公共健康协会把大肠菌群作为一个重要的卫生标准。

虽然大肠菌群很容易检测到，但不一定与粪便污染有关系，因为在自然环境样品中也常存在。于是，粪大肠菌群就作为粪便污染的指标。首先由Eijkman提出，指的是在高温下发酵乳糖，是总大肠菌群的亚群，同时也称为耐热大肠菌群。粪大肠菌群的检测，除水、贝类、贝类养殖水在44.5℃进行，其他所有食品都在45.5℃进行。粪大肠菌群包含绝大部执蟪Ω司? 克雷伯氏菌也作为粪大肠菌群,但克雷伯氏菌的检出被认为与粪便污染并无关系。因此,大肠杆菌又被作为一个重要指标。快速鉴定大肠杆菌的新方法采用，使检测大肠杆菌相对容易了。

现在,在不同的应用中,大肠杆菌,大肠菌群和粪大肠菌群这三种类型作为污染指标。大肠菌群常用于水或食品加工过程中卫生状况的指标。粪大肠菌群用于贝类和贝类养殖水的标准指标。大肠杆菌用于近期粪便污染或不卫生的处理过程指标。几乎所有的检测方法都是基于发酵乳糖。最可能数值法(MPN)是一种统计学方法,包括近似确证和完全验证。在检测过程中,样品要进行系列稀释。实验操作要记录发酵乳糖产气的阳性管数,然后进行另外两步实验,利用阳性结果查统计表(见附录2),估计细菌的数量,仅前两步用于检测大肠菌群和粪大肠菌群,所有三步用于检测大肠杆菌。3管 MPN法用于检测大部分食品,5管 MPN法用于检测水,贝类和贝类养殖水。10管MPN法用于检测瓶装水或估计本样品为受到严重污染.

另外还有一种固体平板计数法,使用VRBA培养,其含有中性红作指示剂,当发酵乳糖时产生红色菌落。还有一种膜过滤法检测大肠菌群和粪大肠菌群,主要根据发酵乳糖产酸形成不同的菌落颜色。本章节也介绍荧光法检测大肠杆菌；检测贝类的特殊方法；一种简单的瓶装水检测方法；和一种与HACCP法规中相关的检测柑桔类水果汁

中大肠杆菌的方法.

1. 传统方法检测大肠菌群、粪大肠菌群、和大肠杆菌

A．设备和材料

1.水浴箱：44.5±0.2℃，水浴箱中的水应高于试管中的培养基液面。

2.插入型温度计：1-55℃，大约长55cm，精度为0.1℃，必须经NIST或相关部门检

测合格

3.培养箱：35±1.0℃

4.电子天平：感量0.1g，称量范围大于2Kg

5.均质器或均质瓶（见第1章）

6.无菌吸管：1.0ml和10.0ml

7.无菌器皿：（用于样品处理）

8.无菌稀释用带盖玻璃瓶

9.菌落计数器或同等产品

10.长波紫外灯:（-365nm）不超过6w

11.PH计

B．培养基和试剂

煌绿乳糖胆盐肉汤，2% （M25）

LST肉汤（M76）

EC肉汤(M49)

L-EMB琼脂（M80）

胰蛋白胨（色氨酸）肉汤（M164）

MR-VP肉汤（M104）

Koser枸橼酸盐肉汤（M72）

PCA（标准方法）（M124）

Butterfield`s磷酸盐缓冲液（R11）或同等稀释液（贝类除外）

Kovacs`试剂（R38）

V-P试剂（R89）

革兰氏染色液（R32）

甲基红指示剂（R44）

结晶紫中性红胆盐琼脂（VRBA）（M174）

VRBA-MUG琼脂（M175）

EC-MUG培养基（M50）

LST-MUG肉汤（M77）

0.1%蛋白胨水稀释液（R56）

C、MPN法—用于大肠菌群、粪大肠菌群和大肠杆菌的计数

称取50g样品加入高速捣碎杯中，见第1章或现在FDA器械。冷冻样品在2-5℃解冻(≤18h)，但不要融化。加入450ml 磷酸盐缓冲液，搅拌2分钟，如果样品量小于50g，称取一半样品加入足够体积的无菌稀释液，制成1：10的样品液，在捣碎杯中的液体应完全覆盖刀片。稀释倍数根据大肠菌群对样品的污染情况，用稀释液将样品制成一系列十倍递增的样品稀释液，以30cm幅度于7s内将样品振摇25次（或以器械振摇器震荡）。选择适宜的三个连续稀释度的样品稀释液，每个稀释度接种3管LST，每管接种1ml，以一定的角度，使吸管的尖部在试管壁上停留2-3s，从制备样品匀液至稀释完毕，全过程不要超过15min。

（注意：用5管MPN法检测贝类食品和贝类养殖水）将接种的LST管放置35℃培养，检查和记录在24±2h时倒管内产气的试管，未产气的试管继续培养24h，在48±2h 时检查和记录产气情况，对所有产气的试管进行确证试验。

D、MPN法—大肠菌群确证试验

将所有LST肉汤产气管，用接种环接种一环到煌绿乳糖胆盐（BGLB）肉汤中。置BGLB 试管于35℃培养48±2h，记录所有BGLB肉汤管的产气管数。按BGLB肉汤产气管数，查MPN表（见附录2 ），计数出大肠杆菌的最可能数值。

E、MPN法—粪大肠菌群和大肠杆菌确证试验

从产气LST肉汤管中接种一环培养物到EC肉汤管中（木制接种棒也可以使用）。将所有接种的EC肉汤管放入带盖水浴箱中，45.5℃培养24±2h，检查产气情况。如果不产气，继续培养至48±2h，检查产气情况。按产气管数，查MPN表计数出粪大肠菌群MPN值。继续大肠杆菌分析，按以下F部分进行。EC肉汤MPN方法可用于海

水和贝肉类的粪大肠菌群检测。

注意：除水、贝类和贝类养殖水中的粪大肠菌群检测的培养温度为44.5±0.2℃外，其他所有食品中粪大肠菌群的培养温度为45.5±0.2℃。

F、MPN法—大肠杆菌的完全测定