PCR技术克隆目的基因全过程
PCR法获取目的基因.完整版PPT
2. PCR技术的特点
1）速度快，灵敏度高：经过30轮循环，理论上目的产物的 扩增量达230个拷贝（109拷贝）。 2）特异性：引物的序列及其与模板结合的特异性是决定 PCR反应结果的关键；引物设计的最大原则是最大限度地提 高扩增效率和特异性，同时尽可能减少非特异性扩增。 3）操作简便易行：只需要数小时就可以用电泳法检出1μg基 因组DNA中仅含数个拷贝的模板序列。
三、PCR的反应体系和基本步骤
1 .反应体系组成成分（总体积：50 L）
H2O 10×PCR反应缓冲液
25mmol/L MgCl2 4种dNTP 上游引物（引物１） 下游引物（引物２） 模板DNA (约1ng) Taq酶
35μL 5μL 4μL 4μL 0.5μL 0.5μL 0.5μL 0.5μL
基因
转移点样 进行电泳
扩增出 的目的
基因
琼脂糖凝胶电泳
3. PCR反应条件
循环参数
（1）预变性：94 ℃ 5 min
（2）变性：94 ℃ 20 s-45 s 使双链DNA解链为单链
（3）退火：温度由引物的解链温度Tm决定，时间45 s左右。
增加温度能减少引物与模板的非特异性结合；降低温度
可增加反应的灵敏性。 （4）延伸：一般为72℃，时间由扩增片段长度决定。 （5）循环次数：主要取决于模板DNA的浓度，一般为25-35次
四、PCR法获取目的基因
医疗：肿瘤：胰癌、结肠癌、肺癌、甲状腺癌、黑色素瘤、血液恶性肿瘤等癌症的筛查。 1989年 《Science》杂志比喻1989年为PCR爆炸年,Mullis荣获1993年度诺贝尔化学奖。 由于该突出碱基的存在，克隆时可以使用T载体克隆目的基因。 3 、多重PCR（复合PCR） 试剂分装 所有的PCR试剂都应小量分装，-20℃保存，以减少重复加样次数，避免污染机会。 （5）循环次数：主要取决于模板DNA的浓度，一般为25-35次 Khorana等1971年提出在体外经DNA变性、 ②复性：55℃左右，引物与模板DNA单链互补配对结合； T载体克隆PCR获取的目的基因 （2）变性：94 ℃ 20 s-45 s 使双链DNA解链为单链 1989年 《Science》杂志比喻1989年为PCR爆炸年,Mullis荣获1993年度诺贝尔化学奖。
目的基因的克隆实验报告(3篇)
第1篇一、实验目的本实验旨在通过分子克隆技术，将目的基因从基因库中提取并克隆到合适的载体上，为后续的基因表达、功能研究及基因工程应用奠定基础。
二、实验原理分子克隆技术是基因工程的核心技术之一，其基本原理是将目的基因片段与载体DNA片段通过酶切、连接等步骤形成重组DNA分子，然后将重组DNA分子导入宿主细胞进行扩增和表达。
三、实验材料1. 实验试剂：限制性核酸内切酶、T4 DNA连接酶、DNA聚合酶、dNTPs、质粒载体、目的基因DNA、LB液体培养基、LB固体培养基、IPTG、X-Gal、0.1 M MgCl2、0.1 M CaCl2等。
2. 实验仪器：PCR仪、电泳仪、凝胶成像系统、离心机、恒温培养箱、显微镜、超净工作台等。
四、实验步骤1. 目的基因的获取（1）设计引物：根据目的基因的序列，设计特异性引物，引物5'末端带有酶切位点。
（2）PCR扩增：以目的基因DNA为模板，PCR扩增目的基因片段。
（3）PCR产物回收：采用PCR产物回收试剂盒回收目的基因片段。
2. 载体与目的基因的连接（1）载体线性化：用限制性核酸内切酶酶切质粒载体，获得线性化载体。
（2）连接反应：将回收的目的基因片段与线性化载体在T4 DNA连接酶作用下进行连接。
（3）连接产物转化：将连接产物转化到大肠杆菌感受态细胞中。
3. 重组子筛选与鉴定（1）菌落培养：在含有IPTG和X-Gal的LB固体培养基上培养转化菌，挑选白色菌落。
（2）菌落PCR鉴定：以白色菌落为模板，进行PCR扩增，检测目的基因片段是否插入载体。
（3）重组子测序：对PCR鉴定阳性的重组子进行测序，验证目的基因片段是否正确插入载体。
五、实验结果与分析1. PCR扩增结果：通过PCR扩增，成功获得了目的基因片段。
2. 菌落PCR鉴定结果：白色菌落PCR鉴定阳性，表明目的基因片段已插入载体。
3. 重组子测序结果：测序结果显示，目的基因片段正确插入载体。
六、实验结论本实验成功克隆了目的基因，为后续的基因表达、功能研究及基因工程应用奠定了基础。
外源基因原核系统克隆表达的基本流程
外源基因原核系统克隆表达的基本流程
外源基因原核系统克隆表达的基本流程如下：
1. 设计引物：根据外源基因的序列，设计引物，其中至少包括一个启动子和一个终止子。
2. 基因克隆：使用PCR或其他克隆技术，将外源基因与载体DNA连接起来，形成重组质粒。
3. 转化：将重组质粒转化到适当的宿主细胞中，如大肠杆菌。
4. 筛选：通过选择性培养基或其他筛选方法，筛选出带有重组质粒的转化菌落。
5. 培养：将筛选出的转化菌落进行扩增培养，在适当的培养条件下培养细菌。
6. 表达：在培养过程中，外源基因会被宿主细胞转录和翻译，产生目标蛋白质。
7. 提取：收集细菌培养物，利用细胞破裂或其他细胞提取方法，提取目标蛋白质。
8. 纯化：通过各种纯化技术，如柱层析、电泳等，纯化目标蛋白质。
9. 鉴定：利用各种方法，如SDS-PAGE、Western blot等，对
目标蛋白质进行鉴定和定量分析。
10. 应用：利用纯化的目标蛋白质进行后续的研究或应用，如
功能鉴定、结构分析、抗原制备等。
这是一个基本的流程，根据不同的实验目的和具体情况，可能还会涉及到一些其他的步骤和操作。
同源序列法克隆目的基因
同源序列法克隆目的基因同源序列法克隆是一种常用的基因克隆方法，用于获取目的基因的DNA序列。
同源序列法克隆的主要步骤如下：1. 设计引物：根据已知目的基因的序列，设计一对引物（即寡核苷酸片段），其中一个引物具有与目的基因的5'端相互匹配，另一个引物具有与目的基因的3'端相互匹配。
2. 提取模板DNA：从包含目的基因的源生物体中提取总DNA 或特定组织/细胞中的DNA作为模板。
3. 聚合酶链反应（PCR）扩增：在PCR反应中使用设计的引物和模板DNA来扩增目的基因的DNA序列。
PCR反应通过多次循环加热和冷却来产生大量DNA复制品。
4. 凝胶电泳分析：将PCR扩增产物与分子量标记物一起加载在琼脂糖凝胶上进行电泳分离。
通过比较扩增产物与标记物在凝胶上的迁移距离，可以确定是否成功扩增了目的基因。
5. 纯化目的基因：从PCR反应中纯化目的基因的扩增产物，一般使用凝胶切片、DNA纯化试剂盒等方法。
6. 连接到载体：将纯化的目的基因DNA与适当的载体（如质粒）进行连接。
这通常涉及酶切目的基因和载体的DNA，然后使用连接酶将它们连接在一起。
7. 转化宿主细胞：将连接的DNA导入宿主细胞中，使其自行复制和表达。
这可以通过转染、电穿孔或热激冲等方法实现。
8. 筛选与鉴定：通过对转化后的细胞进行选择性培养或检测，筛选出带有目的基因的克隆。
常用的筛选方法包括抗生素筛选、荧光筛选等。
9. 验证目的基因：最终需要验证克隆中是否成功插入了目的基因。
这可以通过DNA测序、限制性酶切、PCR等方法来进行。
同源序列法克隆是一种有效的基因克隆技术，可用于获得感兴趣的基因序列并进一步研究其功能、表达和调控机制等。
基因克隆具体实验报告
一、实验目的1. 学习基因克隆的基本原理和方法。
2. 掌握PCR扩增、酶切、连接等基因克隆实验技术。
3. 验证目的基因的克隆是否成功。
二、实验原理基因克隆是指将目的基因片段从基因组中分离出来，并插入到载体中，使其在宿主细胞中复制、表达的过程。
实验过程中，主要涉及PCR扩增、酶切、连接、转化、筛选等步骤。
三、实验材料1. 模板DNA：含有目的基因的基因组DNA。
2. 引物：根据目的基因序列设计的上下游引物。
3. Taq DNA聚合酶：用于PCR扩增。
4. 酶切体系：限制性内切酶、缓冲液、连接酶等。
5. 连接载体：线性化载体。
6. 转化宿主菌：大肠杆菌DH5α。
7. 筛选培养基：含抗生素的LB培养基。
8. PCR扩增试剂：10×PCR缓冲液、dNTPs、MgCl2等。
四、实验方法1. PCR扩增（1）设计引物：根据目的基因序列设计上下游引物，长度约为20-30bp，分别位于目的基因的上下游。
（2）PCR反应体系：取模板DNA 1μl，上下游引物各1μl，10×PCR缓冲液5μl，dNTPs 4μl，MgCl2 2μl，Taq DNA聚合酶0.5μl，加ddH2O至50μl。
（3）PCR反应程序：95℃预变性5min，95℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸1min，共35个循环，最后延伸10min。
2. 酶切连接（1）酶切：取PCR产物5μl，加限制性内切酶（如EcoRI）1μl，10×酶切缓冲液2μl，ddH2O 2μl，混匀后置于37℃水浴酶切2h。
（2）连接：取线性化载体5μl，酶切产物5μl，10×连接缓冲液2μl，T4 DNA 连接酶1μl，混匀后置于16℃连接过夜。
3. 转化（1）制备感受态细胞：将大肠杆菌DH5α在LB培养基中培养至对数生长期，按照1:100的比例加入CaCl2，混匀后冰浴30min。
（2）热激转化：将连接产物加入感受态细胞中，混匀后置于42℃水浴45s，迅速转移至冰浴中。
利用PCR技术(获取并)扩增目的基因
利用PCR技术扩增目的基因
变性
退火 延伸
三
步 曲
例.“X基因”是DNA分子上一个有遗传效应的片段，若要用PCR 技术特异性地拷贝“X基因”，需在PCR反应中加入两种引物 (注：引物作用是与模板形成双链后在DNA聚合酶的作用下 就可以继续链的延伸)，两种引物及其与模板链的结合位置 如下图甲所示。经4轮循环后产物中有五种不同的DNA分子， 如下图乙所示，其中第⑤种DNA分子有几个 ( ) 提示：⑤就是目的基因
其实从pcr技术过程中你能看到是可以得到目的基因的经过三轮复制后就可以得到目的基因经过三轮复制后就可以得到目的基因
利用PCR技术扩增目的基因
有些老师不理解“利用PCR技术扩增目的基因”为什么也是 获取目的基因的一种方法。 其实从PCR技术过程中，你能看到是可以得到目的基因的， 经过三轮复制后，就可以得到目的基因。随后，可以把目 的基因大量扩增。 下面，看动画和一个例题。希望给你一点帮助。
引物1 3’
5’ X基因
引物2
5’ 3’
变性：加热至90～95 ℃（解旋）
3’
5’ 5’
3’
①
5’
退火：冷却至55～60℃（引物结合）
3’
3’ 5’
②
延伸：加热至70～75℃（互补链合成）
第一轮复制得到2个分子，即①②各一个
3’ 5’
5’ 3’ 5’
① ②
变性：加热至90～95 ℃（解旋）
3’ 5’
5’
3’ 3’ 5’
3’ 5’ 3’ 5’
3’ 3’ 5’
5’
5’ 3’ 5’ 3’
第三轮： 得到8个DNA片段 ①②各1个 ③④各2个 ⑤ 2个
第四轮：得到16个DNA片段 ①②各1个得到①②③④各一个 ③ 2个得到③ ⑤各2个 ④ 2个得到④ ⑤各2个 ⑤2个得到⑤4个
pcr 操作流程
pcr 操作流程PCR（Polymerase Chain Reaction）是一种用于复制DNA片段的技术，它可以在短时间内扩增出数百万份特定DNA序列。
PCR技术在分子生物学、医学诊断、法医学等领域有着广泛的应用。
下面将介绍PCR的操作流程。
首先，准备PCR反应体系。
PCR反应需要的基本组成包括DNA模板、引物、dNTPs（四种脱氧核苷酸）、DNA聚合酶、缓冲液和水。
引物是PCR反应的关键，它们是用来识别目标DNA序列并引导DNA聚合酶合成新链的短链DNA片段。
其次，进行PCR反应。
PCR反应通常分为三个步骤：变性、退火和延伸。
在变性步骤中，将PCR管中的混合物加热至95°C，使DNA双链解旋成两条单链。
在退火步骤中，将反应温度降至50-60°C，引物与目标DNA序列结合。
在延伸步骤中，将反应温度升至72°C，DNA聚合酶在引物的引导下合成新链。
最后，进行PCR产物的分析。
PCR反应结束后，可以通过凝胶电泳、实时荧光定量PCR等方法对PCR产物进行分析。
凝胶电泳可以用来检测PCR产物的大小和纯度，实时荧光定量PCR可以用来定量PCR产物的数量。
在PCR反应中，需要注意一些常见的问题，如引物的设计、反应条件的优化、污染的防止等。
此外，PCR反应的结果也需要谨慎解读，避免误判。
总的来说，PCR技术是一种简单、快速、高效的DNA复制技术，广泛应用于科研和临床实验中。
熟练掌握PCR的操作流程和技巧，可以提高实验效率和准确性，为科研工作提供有力支持。
PCR技术克隆目的基因全过程
实验：目的基因克隆PCR技术课前预习PCR polymerase chain reaction 反应的基本原理;目的要求1．学习和掌握PCR 反应的基本原理与实验技术方法;2．认真完成每一步实验操作,详细记录实验现象和结果并加以分析和总结;基本原理类似于DNA 的天然复制过程,其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物;PCR 由变性--退火--延伸三个基本反应步骤构成：①模板DNA的变性：模板DNA 经加热至93℃左右一定时间后,使模板DNA双链或经PCR 扩增形成的双链DNA 解离,使之成为单链,以便它与引物结合,为下轮反应作准备；②模板DNA 与引物的退火复性：模板DNA 经加热变性成单链后,温度降至55℃左右,引物与模板DNA 单链的互补序列配对结合；③引物的延伸：DNA 模板--引物结合物在TaqDNA 聚合酶的作用下,以dNTP为反应原料,靶序列为模板,按碱基配对与半保留复制原理,合成一条新的与模板DNA 链互补的半保留复制链重复循环变性--退火--延伸三过程,就可获得更多的“半保留复制链”,而且这种新链又可成为下次循环的模板;每完成一个循环需2～4 分钟,2～3 小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍;到达平台期Plateau所需循环次数取决于样品中模板的拷贝;实验用品1．材料：重组质粒DNA作为模板2．器材和仪器：移液器及吸头,硅烷化的PCR 小管,DNA扩增仪PE 公司,琼脂糖凝胶电泳所需设备电泳槽及电泳仪,台式高速离心机3．试剂：①10×PCR 反应缓冲液：500mmol/L KCl, 100mmol/L Tris·Cl, 在25℃下, , ％Triton X-100;②MgCl2 ：25mmol/L;③ 4 种dNTP 混合物:每种L;④Taq DNA聚合酶5U/μl;⑤T4 DNA连接酶及连接缓冲液：方法步骤一PCR反应1. 依次混匀下列试剂35μl H2 O 5μl 10×PCR反应缓冲液4μl 25mmol/L MgCl2 4μl 4种dNTP μl 上游引物引物１μl 下游引物引物２μl 模板DNA约1ng 混匀后离心5秒;2. 将混合物在94℃下加热5分钟后冰冷,迅速离心数秒, 使管壁上液滴沉至管底,加入Taq DNA聚合酶μl约,混匀后稍离心,加入一滴矿物油覆盖于反应混合物上;3. 用94℃变性1分钟,45℃退火1分钟, 72℃延伸2分钟, 循环35轮,进行PCR;最后一轮循环结束后, 于72℃下保温10分钟,使反应产物扩增充分;4 电泳按前所述,取10μl扩增产物用1％琼脂糖凝胶进行电泳分析,检查反应产物及长度; 注意1. PCR非常灵敏, 操作应尽可能在无菌操作台中进行;2. 吸头、离心管应高压灭菌, 每次吸头用毕应更换, 不要互相污染试剂;3. 加试剂前, 应短促离心10秒钟, 然后再打开管盖, 以防手套污染试剂及管壁上的试剂污染吸头侧面;4. 应设含除模板DNA所有其它成分的负对照;实验结果注意事项微量操作、PCR 反应体系的设计、引物设计、扩增条件的优化思考题1. 降低退火温度对反应有何影响2. 延长变性时间对反应有何影响3. 循环次数是否越多越好为何4. PCR有哪些用途举例说明;附：PCR知识供参考一PCR 反应体系与反应条件标准的PCR 反应体系：10×扩增缓冲液10ul4 种dNTP 混合物各200umol/L引物各10～100pmol模板DNA ～2ugTaq DNA聚合酶Mg2+ L加双或三蒸水至100ulPCR 反应五要素：参加PCR 反应的物质主要有五种即引物、酶、dNTP、模板和Mg2+引物：引物是PCR 特异性反应的关键,PCR 产物的特异性取决于引物与模板DNA互补的程度;理论上,只要知道任何一段模板DNA序列,就能按其设计互补的寡核苷酸链做引物,利用PCR 就可将模板DNA在体外大量扩增;设计引物应遵循以下原则：①引物长度：15-30bp,常用为20bp左右;②引物扩增跨度：以200-500bp为宜,特定条件下可扩增长至10kb 的片段;③引物碱基：G+C 含量以40-60%为宜,G+C 太少扩增效果不佳,G+C 过多易出现非特异条带;ATGC最好随机分布,避免5 个以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列;④避免引物内部出现二级结构,避免两条引物间互补,特别是3’端的互补,否则会形成引物二聚体,产生非特异的扩增条带;⑤引物3’端的碱基,特别是最末及倒数第二个碱基,应严格要求配对,以避免因末端碱基不配对而导致PCR 失败;⑥引物中有或能加上合适的酶切位点,被扩增的靶序列最好有适宜的酶切位点,这对酶切分析或分子克隆很有好处;⑦引物的特异性：引物应与核酸序列数据库的其它序列无明显同源性;引物量：每条引物的浓度～1umol 或10～100pmol,以最低引物量产生所需要的结果为好,引物浓度偏高会引起错配和非特异性扩增,且可增加引物之间形成二聚体的机会;酶及其浓度：目前有两种Taq DNA聚合酶供应, 一种是从栖热水生杆菌中提纯的天然酶,另一种为大肠菌合成的基因工程酶;催化一典型的PCR 反应约需酶量指总反应体积为100ul 时,浓度过高可引起非特异性扩增,浓度过低则合成产物量减少;dNTP 的质量与浓度：dNTP 的质量与浓度和PCR 扩增效率有密切关系,dNTP 粉呈颗粒状,如保存不当易变性失去生物学活性;dNTP 溶液呈酸性,使用时应配成高浓度后,以1M NaOH 或1M Tris;HCl的缓冲液将其PH调节到～,小量分装,-20℃冰冻保存;多次冻融会使dNTP 降解;在PCR 反应中,dNTP 应为50～200umol/L, 尤其是注意 4 种dNTP 的浓度要相等等摩尔配制, 如其中任何一种浓度不同于其它几种时偏高或偏低,就会引起错配;浓度过低又会降低PCR 产物的产量;dNTP 能与Mg2+结合,使游离的Mg2+浓度降低;模板靶基因核酸：模板核酸的量与纯化程度,是PCR 成败与否的关键环节之一,传统的DNA 纯化方法通常采用SDS 和蛋白酶K 来消化处理标本;SDS 的主要功能是：溶解细胞膜上的脂类与蛋白质,因而溶解膜蛋白而破坏细胞膜,并解离细胞中的核蛋白,SDS 还能与蛋白质结合而沉淀；蛋白酶K 能水解消化蛋白质,特别是与DNA 结合的组蛋白,再用有机溶剂酚与氯仿抽提掉蛋白质和其它细胞组份,用乙醇或异丙醇沉淀核酸;提取的核酸即可作为模板用于PCR 反应;一般临床检测标本,可采用快速简便的方法溶解细胞,裂解病原体,消化除去染色体的蛋白质使靶基因游离,直接用于PCR 扩增;RNA 模板提取一般采用异硫氰酸胍或蛋白酶K 法,要防止RNase降解RNA;Mg2+浓度：Mg2+对PCR 扩增的特异性和产量有显著的影响,在一般的PCR 反应中,各种dNTP 浓度为200umol/L时,Mg2+浓度为～L为宜;Mg2+浓度过高,反应特异性降低,出现非特异扩增,浓度过低会降低Taq DNA聚合酶的活性,使反应产物减少;PCR 反应条件的选择PCR 反应条件为温度、时间和循环次数;温度与时间的设置：基于PCR 原理三步骤而设置变性-退火-延伸三个温度点;在标准反应中采用三温度点法,双链DNA 在90～95℃变性,再迅速冷却至40 ～60℃,引物退火并结合到靶序列上,然后快速升温至70～75℃,在Taq DNA 聚合酶的作用下,使引物链沿模板延伸;对于较短靶基因长度为100～300bp 时可采用二温度点法, 除变性温度外、退火与延伸温度可合二为一,一般采用94℃变性,65℃左右退火与延伸此温度Taq DNA酶仍有较高的催化活性;①变性温度与时间：变性温度低,解链不完全是导致PCR 失败的最主要原因;一般情况下,93℃～94℃lmin足以使模板DNA变性,若低于93℃则需延长时间,但温度不能过高,因为高温环境对酶的活性有影响;此步若不能使靶基因模板或PCR 产物完全变性,就会导致PCR 失败;②退火复性温度与时间：退火温度是影响PCR 特异性的较重要因素;变性后温度快速冷却至40℃～60℃,可使引物和模板发生结合;由于模板DNA 比引物复杂得多,引物和模板之间的碰撞结合机会远远高于模板互补链之间的碰撞;退火温度与时间,取决于引物的长度、碱基组成及其浓度,还有靶基序列的长度;对于20 个核苷酸,G+C 含量约50%的引物,55℃为选择最适退火温度的起点较为理想;引物的复性温度可通过以下公式帮助选择合适的温度：Tm值解链温度=4G+C＋2A+T复性温度=Tm值-5～10℃在Tm值允许范围内, 选择较高的复性温度可大大减少引物和模板间的非特异性结合,提高PCR 反应的特异性;复性时间一般为30～60sec,足以使引物与模板之间完全结合;③延伸温度与时间：Taq DNA聚合酶的生物学活性：70～80℃150核苷酸/S/酶分子70℃60 核苷酸/S/酶分子55℃24 核苷酸/S/酶分子高于90℃时, DNA合成几乎不能进行;PCR 反应的延伸温度一般选择在70～75℃之间,常用温度为72℃,过高的延伸温度不利于引物和模板的结合;PCR 延伸反应的时间,可根据待扩增片段的长度而定,一般1Kb以内的DNA片段,延伸时间1min是足够的;3～4kb 的靶序列需3～4min；扩增10Kb 需延伸至15min;延伸进间过长会导致非特异性扩增带的出现;对低浓度模板的扩增,延伸时间要稍长些;循环次数：循环次数决定PCR 扩增程度;PCR 循环次数主要取决于模板DNA的浓度;一般的循环次数选在30～40 次之间,循环次数越多,非特异性产物的量亦随之增多;PCR 反应特点特异性强PCR 反应的特异性决定因素为：①引物与模板DNA 特异正确的结合；②碱基配对原则；③Taq DNA 聚合酶合成反应的忠实性；④靶基因的特异性与保守性;其中引物与模板的正确结合是关键;引物与模板的结合及引物链的延伸是遵循碱基配对原则的;聚合酶合成反应的忠实性及Taq DNA 聚合酶耐高温性,使反应中模板与引物的结合复性可以在较高的温度下进行,结合的特异性大大增加,被扩增的靶基因片段也就能保持很高的正确度;再通过选择特异性和保守性高的靶基因区,其特异性程度就更高;灵敏度高PCR 产物的生成量是以指数方式增加的,能将皮克pg=10 -12 g量级的起始待测模板扩增到微克ug=10 -6 g水平;能从100 万个细胞中检出一个靶细胞；在病毒的检测中,PCR 的灵敏度可达3 个RFU空斑形成单位；在细菌学中最小检出率为3 个细菌;简便、快速PCR 反应用耐高温的Taq DNA 聚合酶,一次性地将反应液加好后,即在DNA 扩增液和水浴锅上进行变性-退火-延伸反应,一般在2～4 小时完成扩增反应;扩增产物一般用电泳分析,不一定要用同位素,无放射性污染、易推广;对标本的纯度要求低不需要分离病毒或细菌及培养细胞,DNA 粗制品及总RNA均可作为扩增模板;可直接用临床标本如血液、体腔液、洗嗽液、毛发、细胞、活组织等粗制的DNA 扩增检测;PCR 扩增产物分析PCR 产物是否为特异性扩增,其结果是否准确可靠,必须对其进行严格的分析与鉴定,才能得出正确的结论;PCR产物的分析,可依据研究对象和目的不同而采用不同的分析方法;凝胶电泳分析：PCR产物电泳,EB 溴乙锭染色紫外仪下观察,初步判断产物的特异性;PCR产物片段的大小应与预计的一致,特别是多重PCR,应用多对引物,其产物片断都应符合预讦的大小,这是起码条件;琼脂糖凝胶电泳：通常应用1～2%的琼脂糖凝胶,供检测用;聚丙烯酰胺凝胶电泳：6～10%聚丙烯酰胺凝胶电泳分离效果比琼脂糖好,条带比较集中,可用于科研及检测分析;酶切分析：根据PCR 产物中限制性内切酶的位点,用相应的酶切、电泳分离后,获得符合理论的片段,此法既能进行产物的鉴定,又能对靶基因分型,还能进行变异性研究;分子杂交：分子杂交是检测PCR 产物特异性的有力证据,也是检测PCR 产物碱基突变的有效方法;Southern 印迹杂交：在两引物之间另合成一条寡核苷酸链内部寡核苷酸标记后做探针,与PCR 产物杂交;此法既可作特异性鉴定,又可以提高检测PCR 产物的灵敏度,还可知其分子量及条带形状,主要用于科研;斑点杂交：将PCR 产物点在硝酸纤维素膜或尼膜薄膜上,再用内部寡核苷酸探针杂交,观察有无着色斑点,主要用于PCR 产物特异性鉴定及变异分析;核酸序列分析：是检测PCR 产物特异性的最可靠方法;PCR 常见问题总结PCR 产物的电泳检测时间一般为48h 以内,有些最好于当日电泳检测,大于48h 后带型不规则甚致消失;假阴性,不出现扩增条带PCR 反应的关键环节有①模板核酸的制备,②引物的质量与特异性,③酶的质量及活性④PCR循环条件;寻找原因亦应针对上述环节进行分析研究;模板：①模板中含有杂蛋白质,②模板中含有Taq 酶抑制剂,③模板中蛋白质没有消化除净,特别是染色体中的组蛋白,④在提取制备模板时丢失过多,或吸入酚;⑤模板核酸变性不彻底;在酶和引物质量好时,不出现扩增带,极有可能是标本的消化处理,模板核酸提取过程出了毛病,因而要配制有效而稳定的消化处理液,其程序亦应固定不宜随意更改;酶失活：需更换新酶,或新旧两种酶同时使用,以分析是否因酶的活性丧失或不够而导致假阴性;需注意的是有时忘加Taq 酶或溴乙锭;引物：引物质量、引物的浓度、两条引物的浓度是否对称,是PCR 失败或扩增条带不理想、容易弥散的常见原因;有些批号的引物合成质量有问题,两条引物一条浓度高,一条浓度低,造成低效率的不对称扩增,对策为：①选定一个好的引物合成单位;②引物的浓度不仅要看OD值,更要注重引物原液做琼脂糖凝胶电泳,一定要有引物条带出现,而且两引物带的亮度应大体一致,如一条引物有条带,一条引物无条带,此时做PCR 有可能失败,应和引物合成单位协商解决;如一条引物亮度高,一条亮度低,在稀释引物时要平衡其浓度;③引物应高浓度小量分装保存,防止多次冻融或长期放冰箱冷藏部分,导致引物变质降解失效;④引物设计不合理,如引物长度不够,引物之间形成二聚体等;Mg2+浓度：Mg2+离子浓度对PCR 扩增效率影响很大,浓度过高可降低PCR扩增的特异性,浓度过低则影响PCR 扩增产量甚至使PCR扩增失败而不出扩增条带;反应体积的改变：通常进行PCR 扩增采用的体积为20ul、30ul、50ul;或100ul,应用多大体积进行PCR 扩增,是根据科研和临床检测不同目的而设定,在做小体积如20ul 后,再做大体积时,一定要模索条件,否则容易失败;物理原因：变性对PCR 扩增来说相当重要,如变性温度低,变性时间短,极有可能出现假阴性;退火温度过低,可致非特异性扩增而降低特异性扩增效率退火温度过高影响引物与模板的结合而降低PCR扩增效率;有时还有必要用标准的温度计,检测一下扩增仪或水溶锅内的变性、退火和延伸温度,这也是PCR失败的原因之一;靶序列变异：如靶序列发生突变或缺失,影响引物与模板特异性结合,或因靶序列某段缺失使引物与模板失去互补序列,其PCR 扩增是不会成功的;假阳性出现的PCR 扩增条带与目的靶序列条带一致,有时其条带更整齐,亮度更高;引物设计不合适：选择的扩增序列与非目的扩增序列有同源性, 因而在进行PCR 扩增时, 扩增出的PCR产物为非目的性的序列;靶序列太短或引物太短,容易出现假阳性;需重新设计引物;靶序列或扩增产物的交叉污染：这种污染有两种原因：一是整个基因组或大片段的交叉污染,导致假阳性;这种假阳性可用以下方法解决：①操作时应小心轻柔,防止将靶序列吸入加样枪内或溅出离心管外;②除酶及不能耐高温的物质外,所有试剂或器材均应高压消毒;所用离心管及样进枪头等均应一次性使用;③必要时,在加标本前,反应管和试剂用紫外线照射,以破坏存在的核酸;二是空气中的小片段核酸污染,这些小片段比靶序列短,但有一定的同源性;可互相拼接,与引物互补后,可扩增出PCR产物,而导致假阳性的产生,可用巢式PCR 方法来减轻或消除;出现非特异性扩增带PCR 扩增后出现的条带与预计的大小不一致,或大或小,或者同时出现特异性扩增带与非特异性扩增带;非特异性条带的出现,其原因：一是引物与靶序列不完全互补、或引物聚合形成二聚体;二是Mg2+离子浓度过高、退火温度过低,及PCR 循环次数过多有关;其次是酶的质和量,往往一些来源的酶易出现非特异条带而另一来源的酶则不出现,酶量过多有时也会出现非特异性扩增;其对策有：①必要时重新设计引物;②减低酶量或调换另一来源的酶;③降低引物量,适当增加模板量,减少循环次数;④适当提高退火温度或采用二温度点法93℃变性,65℃左右退火与延伸;出现片状拖带或涂抹带PCR 扩增有时出现涂抹带或片状带或地毯样带;其原因往往由于酶量过多或酶的质量差,dNTP浓度过高,Mg2+浓度过高,退火温度过低,循环次数过多引起;其对策有：①减少酶量,或调换另一来源的酶;②减少dNTP的浓度;③适当降低Mg2+浓度;④增加模板量,减少循环次数;PCR 污染与对策PCR 反应的最大特点是具有较大扩增能力与极高的灵敏性,但令人头痛的问题是易污染,极其微量的污染即可造成假阳性的产生;污染原因一标本间交叉污染:标本污染主要有收集标本的容器被污染,或标本放置时,由于密封不严溢于容器外,或容器外粘有标本而造成相互间交叉污染;标本核酸模板在提取过程中,由于吸样枪污染导致标本间污染;有些微生物标本尤其是病毒可随气溶胶或形成气溶胶而扩散,导致彼此间的污染;二PCR 试剂的污染:主要是由于在PCR 试剂配制过程中,由于加样枪、容器、双蒸水及其它溶液被PCR核酸模板污染.三PCR扩增产物污染:这是PCR反应中最主要最常见的污染问题, 因为PCR产物拷贝量大一般为1013拷贝/ml,远远高于PCR 检测数个拷贝的极限,所以极微量的PCR 产物污染,就可造成假阳就可形成假阳性;还有一种容易忽视,最可能造成PCR 产物污染的形式是气溶胶污染;在空气与液体面摩擦时就可形成气溶胶,在操作时比较剧烈地摇动反应管,开盖时、吸样时及污染进样枪的反复吸样都可形成气溶胶而污染;据计算一个气溶胶颗粒可含48000 拷贝,因而由其造成的污染是一个值得特别重视的问题;四实验室中克隆质粒的污染:在分子生物学实验室及某些用克隆质粒做阳性对照的检验室,这个问题也比较常见;因为克隆质粒在单位容积内含量相当高,另外在纯化过程中需用较多的用具及试剂,而且在活细胞内的质粒,由于活细胞的生长繁殖的简便性及具有很强的生命力,其污染可能性也很大;污染的监测一个好的实验室,要时刻注意污染的监测,考虑有无污染是什么原因造成的污染,以便采取措施,防止和消除污染;对照试验1. 阳性对照:在建立PCR 反应实验室及一般的检验单位都应设有PCR 阳性对照,它是PCR 反应是否成功、产物条带位置及大小是否合乎理论要求的一个重要的参考标志;阳性对照要选择扩增度中等、重复性好,经各种鉴定是该产物的标本,如以重组质粒为阳性对照,其含量宜低不宜高100 个拷贝以下,但阳性对照尤其是重组质粒及高浓度阳性标本,其对检测或扩增样品污染的可能性很大;因而当某一PCR 试剂经自己使用稳定,检验人员心中有数时,在以后的实验中可免设阳性对照;2. 阴性对照:每次PCR 实验务必做阴性对照;它包括①标本对照:被检的标本是血清就用鉴定后的正常血清作对照;被检的标本是组织细胞就用相应的组织细胞作对照;②试剂对照:在PCR 试剂中不加模板DNA或RNA,进行PCR 扩增,以监测试剂是否污染;3. 重复性试验4. 选择不同区域的引物进行PCR 扩增防止污染的方法一合理分隔实验室:将样品的处理、配制PCR 反应液、PCR 循环扩增及PCR产物的鉴定等步骤分区或分室进行,特别注意样本处理及PCR产物的鉴定应与其它步骤严格分开;最好能划分①标本处理区;②PCR 反应液制备区;③PCR 循环扩增区;④PCR 产物鉴定区;其实验用品及吸样枪应专用,实验前应将实验室用紫外线消毒以破坏残留的DNA 或RNA;二吸样枪:吸样枪污染是一个值得注意的问题;由于操作时不慎将样品或模板核酸吸入枪内或粘上枪头是一个严重的污染源,因而加样或吸取模板核酸时要十分小心,吸样要慢,吸样时尽量一次性完成,忌多次抽吸,以免交叉污染或产生气溶胶污染;三预混和分装PCR试剂:所有的PCR 试剂都应小量分装,如有可能,PCR 反应液应预先配制好,然后小量分装,-20℃保存;以减少重复加样次数,避免污染机会;另外,PCR 试剂,PCR 反应液应与样品及PCR产物分开保存,不应放于同一冰盒或同一冰箱;四防止操作人员污染,使用一次性手套、吸头、小离心管应一次性使用;五设立适当的阳性对照和阴性对照,阳性对照以能出现扩增条带的最低量的标准病原体核酸为宜,并注意交叉污染的可能性,每次反应都应有一管不加模板的试剂对照及相应不含有被扩增核酸的样品作阴性对照;六减少PCR 循环次数,只要PCR 产物达到检测水平就适可而止;七选择质量好的Eppendorf管,以避免样本外溢及外来核酸的进入,打开离心管前应先离心,将管壁及管盖上的液体甩至管底部;开管动作要轻,以防管内液体溅出;参考文献一、主要教学参考书：1.基因工程原理第二版.吴乃虎编著,科学出版社2.分子克隆实验指南第三版.黄培堂等译,科学出版社3.基因克隆和DNA分析.魏群等译,高等教育出版社4.最新分子生物学实验技术梁国栋主编,科学出版5分子生物学实验指导主编：魏群高等教育出版社施普林格出版社二、主要参考文献：, SN, ACY Chang and L Hsu, 1972, Sci. 69:2110., HC and J Doly. 1979.,Nucleic Acids Res. 7:1513., C and P Borst, 1972.,Biochim. Biophys. Acta 269:192.F, RL Rodriguez, PJ Greene, MC Betlach, HL Heyneker, HW Boyer, JH Crosa, and S Falkow, 1977b,,Gene 2:95.K, F Faloona, S Scharf, R Saiki, G Horn and H Erlich, 1986.,Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 51:263.。
基因工程中目的基因的检测pcr法
基因工程中目的基因的检测pcr法基因工程中目的基因的检测PCR法在现代生物技术领域，基因工程扮演着至关重要的角色。
它涉及到对生物体的基因进行精确的修改和调控，以实现特定的科学或商业目标。
在基因工程的过程中，检测目的基因的存在和表达是至关重要的一步。
聚合酶链反应（PCR）作为一种高效、灵敏的基因检测技术，已被广泛应用于这一领域。
PCR技术的基本原理是利用DNA聚合酶在特定条件下，对目标DNA 序列进行指数级扩增。
这一过程涉及到几个关键步骤：变性、退火和延伸。
通过高温将双链DNA变性为单链，然后通过降温使引物与目标序列特异性结合，在适宜的温度下，DNA聚合酶沿着模板链合成新的DNA链。
通过这一系列的循环，目标DNA序列得以在短时间内大量复制，从而便于检测和分析。
在基因工程中，PCR技术被用于多种目的。
它可以用于验证目的基因是否已成功导入宿主细胞。
通过设计特异性的引物，可以扩增出导入的基因片段，并通过凝胶电泳等方法进行检测。
PCR还可以用于检测目的基因的表达水平。
通过逆转录PCR（RTPCR）技术，可以将RNA转录为cDNA，然后通过PCR扩增，从而间接检测基因的表达量。
为了确保PCR检测的准确性和可靠性，必须严格控制实验条件。
引物的设计至关重要。
引物需要与目标序列完全匹配，并且具有适当的长度和GC含量，以确保高效性和特异性。
实验中的温度控制、试剂浓度和循环次数等参数也需要精确调控。
任何微小的偏差都可能导致结果的误判。
在应用PCR技术进行基因检测时，还需要考虑到可能存在的假阳性或假阴性结果。
假阳性通常是由于交叉污染或非特异性扩增引起的，而假阴性可能是由于模板量不足或扩增条件不适宜导致的。
因此，在实验设计中，应采取适当的对照和重复实验，以验证结果的可靠性。
随着PCR技术的不断发展，出现了许多基于PCR的衍生技术，如定量PCR（qPCR）、多重PCR和高通量PCR等。
这些技术不仅提高了检测的灵敏度和特异性，还实现了对多个基因的同时检测，大大提高了实验效率。
克隆实验报告
一、实验目的1. 学习和掌握基因克隆的基本原理和操作步骤。
2. 掌握质粒DNA的提取、目的基因的扩增、重组质粒的构建和转化等分子生物学实验技术。
3. 熟悉阳性克隆的筛选和鉴定方法。
二、实验原理基因克隆是指将目的基因片段插入到载体DNA分子中，构建成重组DNA分子，并通过转化宿主细胞使目的基因在宿主细胞内表达。
本实验采用PCR技术扩增目的基因，通过限制性内切酶将目的基因和载体DNA切割成相应的黏性末端，然后将目的基因片段插入到载体DNA分子中，构建成重组质粒。
最后，将重组质粒转化大肠杆菌宿主细胞，筛选出含有目的基因的阳性克隆。
三、实验材料与仪器1. 材料：- 大肠杆菌菌株（如DH5α）- 质粒载体（如pUC19）- 目的基因DNA模板- 限制性内切酶（如EcoRI、HindIII）- DNA连接酶（如T4DNA连接酶）- 转化试剂- 抗生素（如氨苄青霉素）- 培养基（如LB培养基）2. 仪器：- PCR仪- 紫外分光光度计- 电泳仪- 真空离心机- 显微镜四、实验步骤1. 目的基因的扩增：- 设计引物，根据目的基因序列设计特异性引物。
- 进行PCR扩增，将目的基因DNA模板与引物混合，在PCR仪中进行扩增。
2. 质粒DNA的提取：- 使用质粒提取试剂盒或碱裂解法提取质粒DNA。
3. 限制性内切酶酶切：- 将目的基因DNA和质粒载体分别用相应的限制性内切酶进行酶切。
4. DNA连接：- 将酶切后的目的基因DNA片段和质粒载体混合，加入DNA连接酶，进行连接反应。
5. 重组质粒的转化：- 将连接产物转化大肠杆菌宿主细胞，常用热击法或电穿孔法。
6. 阳性克隆的筛选：- 将转化后的菌液涂布于含有氨苄青霉素的LB平板上，培养过夜。
- 从平板上挑取单菌落进行PCR检测，筛选出含有目的基因的阳性克隆。
7. 阳性克隆的鉴定：- 对阳性克隆进行酶切鉴定，确认重组质粒是否构建成功。
五、实验结果与分析1. PCR扩增结果：- 通过PCR扩增，成功扩增出目的基因片段。
PCR原理过程和应用方法有哪些步骤
PCR原理过程和应用方法有哪些步骤引言聚合酶链反应（PCR）是一种在分子生物学中广泛应用的技术，它能够扩增特定DNA片段并产生大量复制品。
PCR的原理简单而灵活，被广泛用于基因分型、遗传性疾病的检测、DNA克隆、基因工程等领域。
本文将介绍PCR的原理过程以及常见的PCR 应用方法和步骤。
PCR原理过程PCR的原理基于DNA的双链复制过程，在一个热循环中通过不同温度的变化开展。
一般包括三个关键步骤：变性、退火和延伸。
1.变性（Denaturation）：将待扩增的DNA双链在高温（通常为94-98℃）下解链成两条单链DNA。
这一步的目的是使DNA的两条链完全分离，为后续的扩增提供模板。
2.退火（Annealing）：将温度降低至较低的退火温度（通常为50-65℃），使两个引物（primer）与目标DNA序列的两端互补结合。
引物是由设计的片段特异性DNA 序列，它们会定向性地结合到待扩增的目标序列上。
3.延伸（Extension）：将温度升高至适宜的延伸温度（通常为68-72℃），此时DNA聚合酶开始复制DNA。
酶会在引物结合的位置上逐渐合成新的DNA链，延伸到相邻的引物区域。
通过以上三个步骤的循环，PCR可以快速扩增特定DNA序列，使其得到数量级增加。
PCR应用方法和步骤PCR在科学研究和临床诊断中有着广泛的应用。
以下将介绍几种常见的PCR方法和相应的步骤。
1.基因型鉴定•提取DNA样本：从样品（如血液、唾液、组织等）中提取目标DNA。
•Primer设计：根据待鉴定的基因序列设计特异性引物。
•PCR扩增：按照前文介绍的PCR原理过程进行扩增。
•凝胶电泳：将扩增产物通过凝胶电泳分离，根据不同大小和迁移速率确定基因型。
2.突变检测•提取DNA样本：从患者样本中提取DNA。
•引物设计：设计引物以特异性扩增突变位点。
•扩增反应：按照前文介绍的PCR原理过程进行扩增。
•测序分析：通过测序技术对PCR产物进行分析，检测突变。
目的基因的获取方法具体操作流程
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PCR技术克隆目的基因全过程
PCR技术克隆目的基因全过程PCR（聚合酶链式反应）是一种体外的DNA合成技术，可以通过放大目的基因序列来克隆和检测DNA。
以下是PCR技术克隆目的基因全过程的详细解释。
1.设计引物：引物是用于扩增目的基因的短DNA片段。
引物分为前向引物和反向引物，其序列分别与目的基因的5’和3’末端相互匹配。
引物的设计应该尽量避免互相形成二聚体或发生引物间杂交。
一般情况下，前向引物和反向引物的长度约为18-30个碱基。
2.DNA模板的准备：DNA模板是PCR反应中的起始材料，可以是从细胞中提取的基因组DNA、cDNA或合成的DNA片段等。
DNA模板需要经过特定的处理步骤，如酶切或热变性，以解开DNA双链结构，使得引物能够与目的基因序列起始材料结合。
3.PCR反应体系的制备：PCR反应体系通常包含DNA模板、引物、dNTPs（脱氧核苷酸三磷酸盐）、聚合酶、缓冲液和稀释的镁离子。
这些成分需要以特定的量和浓度配制在一起。
在反应体系中加入适量的聚合酶，可以保证PCR反应能够进行。
4.PCR扩增条件设定：PCR反应需要经历一系列的温度变化，这些温度的设定旨在创造一个适宜扩增引物的环境。
PCR反应通常包含三个主要的步骤：变性、退火和延伸。
变性步骤中，DNA模板的双链结构被加热到95°C，使其变性为两条单链DNA。
退火步骤中，反应体系温度降至碱基互补序列的温度，使引物能够与DNA模板结合。
延伸步骤中，反应体系温度升至适合聚合酶的工作温度，引物被复制形成两条新的双链DNA。
这三个步骤的温度和时间根据目的基因的特性和引物的设计来设定。
5.PCR扩增循环：PCR反应通常包含20-40个循环，每个循环包括变性、退火和延伸三个步骤。
每个循环都会使目的DNA序列扩增一倍。
PCR反应的循环数取决于目的基因的起始材料的丰度和所需扩增的DNA数量。
6.PCR产物检测：PCR扩增产物可以通过凝胶电泳等方法进行检测。
凝胶电泳可以将PCR扩增产物按照大小分离。
基因工程pcr技术
基因工程pcr技术
PCR技术是一种基因工程技术，它是一种快速、高效、准确的DNA复制技术。
PCR技术的原理是利用DNA聚合酶酶的特性，在体外复制DNA分子。
PCR技术的应用非常广泛，包括基因克隆、基因检测、基因表达分析等。
PCR技术的基本步骤包括三个步骤：变性、退火和延伸。
变性是将DNA分子的双链分离成两条单链，这个步骤需要高温。
退火是将引物与DNA分子的单链互相结合，这个步骤需要低温。
延伸是将DNA聚合酶酶作用于引物与DNA分子的单链，使其合成新的DNA 分子，这个步骤需要适当的温度和时间。
PCR技术的应用非常广泛，其中最重要的应用之一是基因克隆。
基因克隆是指将一个DNA分子复制成多个完全相同的DNA分子。
PCR技术可以用来扩增DNA分子，从而得到大量的DNA分子。
这些DNA分子可以用来进行基因克隆，从而得到大量的目的基因。
PCR技术还可以用来进行基因检测。
基因检测是指检测某个基因是否存在或者是否突变。
PCR技术可以用来扩增目的基因，从而得到足够的DNA分子进行检测。
PCR技术还可以用来进行基因表达分析。
基因表达分析是指研究某个基因在不同组织或者不同条件下的表达情况。
PCR技术可以用来扩增目的基因，从而得到足够的DNA分子进行表达分析。
PCR技术是一种非常重要的基因工程技术，它可以用来进行基因克隆、基因检测、基因表达分析等。
PCR技术的应用非常广泛，可以应用于医学、生物学、农业等领域。
随着技术的不断发展，PCR技术的应用将会越来越广泛。
pcr反应的原理及步骤
pcr反应的原理及步骤PCR（聚合酶链式反应）一种分子生物学技术，它利用酶的特定性质将少量的DNA序列扩增为大量的DNA序列，以便于后续研究。
PCR技术已经广泛应用于医学、生物学、法医学和环境科学等领域，成为生物分子研究中最重要的工具之一。
下面详细介绍PCR反应的原理及步骤。
一、PCR反应的原理PCR反应是指把少量的DNA模板扩增为大量DNA的技术。
该技术系多次复制小段DNA的过程，是一种体外的细胞复制技术。
PCR技术过程中主要包括三个重要的步骤：变性、引物与DNA复制。
在变性步骤，将DNA链分离成单链，使其能够与引物形成复合物，在引物的作用下，在DNA聚合酶的辅助下，进行合成反应，产生一个新的DNA链。
在PCR反应中，利用一种特殊的DNA聚合酶——Taq聚合酶。
由于Taq聚合酶稳定性高，耐高温和高盐浓度等多种条件下工作，使其成为PCR反应的首选酶之一。
PCR反应通常包括：预变性、变性、退变性、延伸和保持等步骤。
以下是详细的步骤介绍。
二、PCR反应的步骤（一）PCR反应的前期准备在进行PCR反应前，需要准备好以下的试剂和设备：1. DNA模板DNA模板是PCR反应的起点。
新鲜或保存时间较短的DNA更适合进行PCR反应，因为存放时间过长可能会导致DNA的降解。
2. 引物引物是指使用一对特定的寡核苷酸引物，用于聚合酶链反应的启动和反应的低温退火程序。
引物的设计对PCR反应的准确性、特异性和效率等方面起到关键作用。
3. dNTPsdNTPS是脱氧核苷酸三磷酸盐，是DNA链的合成所必需的单体，其中包括dATP、dCTP、dGTP和dTTP。
通常采用等浓度的四种dNTPs。
4. 反应缓冲液反应缓冲液含有pH、离子和其他的成分，与聚合酶链反应的酶活性最佳条件一致。
（二）PCR反应的步骤1. 预变性（Pre-denaturation）在PCR反应之前进行预变性，使反应混合物中暴露的DNA链变性转变成单链状态，从而使引物在继续链扩增时能与模板DNA复合。
pcr检测目的基因是否转入受体植物的原理 -回复
pcr检测目的基因是否转入受体植物的原理-回复PCR（聚合酶链式反应）是一种用于扩增DNA片段的技术，可以检测基因是否转入受体植物。
基于这个技术，本文将详细介绍PCR检测目的基因是否转入受体植物的原理和步骤。
第一部分：PCR基本原理PCR反应是由DNA模板、DNA引物（寡核苷酸引物）和DNA聚合酶组成的。
在PCR过程中，DNA模板将会被DNA聚合酶通过反复的扩增使之数量大幅增加。
第二部分：引物的设计在PCR检测目的基因是否转入受体植物时，需要设计特异性引物，即只能与目的基因片段配对，而不与其他非目的基因片段配对。
在设计引物时，需要考虑到目的基因的序列信息和受体植物的基因组信息。
第三部分：DNA模板的提取在进行PCR反应之前，需要从受体植物中提取DNA模板。
DNA提取方法可以根据不同的植物材料进行调整，常用的方法有CTAB法、酚/氯仿法和商业化的DNA提取试剂盒。
第四部分：PCR反应条件的设定PCR反应需要根据引物设计和模板DNA的性质来确定适当的条件。
其中，主要包括温度、时间和反应体系的优化。
一般情况下，PCR反应包含初步变性、引物结合、DNA合成和终结扩增四个阶段。
第五部分：PCR反应的扩增过程在PCR反应中，首先将反应体系加热到94-96C，使DNA模板变性。
然后，在特定的温度下，引物可以与目的DNA片段互相配对，即结合。
接下来，DNA聚合酶会在45-72C的适宜温度下合成新的DNA链，在这个过程中，DNA增长指数级扩增。
最后，反应结束时，加热到72-74的温度保持一段时间，以保证DNA扩增的完全结束。
第六部分：PCR产物的分析PCR反应产物可以通过凝胶电泳进行分离和分析。
凝胶电泳可以根据DNA片段的大小进行分离，通过观察PCR反应的条带来判断目的基因是否转入了受体植物。
第七部分：结果的解读如果PCR反应的电泳结果显示，存在了目的基因特异性的扩增产物草带，则说明目的基因已经成功转入受体植物。
pcr技术扩增目的基因的过程
pcr技术扩增目的基因的过程
嘿，朋友！你知道 PCR 技术扩增目的基因是咋回事不？这可神奇
得很呐！
PCR 技术就像是一场基因的复制狂欢。
首先呢，得有个模板DNA，这就好比是盖房子的蓝图。
没有这蓝图，咱可没法建出想要的房子。
然后就是准备原料，像是脱氧核苷酸，这可是构建基因大厦的“砖头”。
还有 DNA 聚合酶，它就像是个超级能工巧匠，能把那些“砖头”
砌得整整齐齐。
接下来，得设定反应条件。
温度可太关键啦！就像炒菜时火候的把握，温度不合适，这菜可就不好吃。
PCR 反应里，温度一会儿高一会
儿低，为啥？这是为了让 DNA 链解开、结合，反复折腾，基因就这么
被扩增啦！
在这个过程中，不是随随便便就能成功的哟！比如说，如果原料的
质量不行，那岂不是像盖房子用了劣质砖头，房子能结实吗？基因扩
增能顺利吗？
而且，要是温度控制不好，那可不就乱套啦！这就好像蒸馒头，火
大了就糊了，火小了又蒸不熟。
经过一轮又一轮的加热、冷却，目的基因就像变魔术一样越来越多。
这不就像一颗种子，不断地发芽、长大，最后变成一片繁茂的树林？
PCR 技术扩增目的基因，可不只是在实验室里耍耍酷。
它在医学诊断上可大有用处，能帮医生快速找出疾病的“元凶”。
在科研领域，也是个得力的助手，让科学家们能更深入地探索生命的奥秘。
总之，PCR 技术扩增目的基因，就像是一场精心编排的舞蹈，每个步骤都要精准无误，才能跳出精彩的舞步，为我们的生活带来更多的可能和惊喜！你说是不是这个理儿？。
转录组序列基因克隆
转录组序列基因克隆
转录组序列基因克隆是一种用于从转录组数据中克隆基因的方法。
以下是一般的步骤：
1. 获得转录组数据：通常通过 RNA 测序（RNA-seq）技术获得转录组数据。
这些数据提供了有关细胞或组织中表达的所有 RNA 分子的信息。
2. 筛选目标基因：根据研究的目的，从转录组数据中筛选出感兴趣的目标基因。
这可以基于特定的表达模式、功能注释或其他相关的生物信息学分析。
3. 设计引物：针对目标基因的序列，设计特异性的引物用于 PCR 扩增。
4. PCR 扩增：使用设计的引物，从转录组数据对应的 cDNA 文库中进行 PCR 扩增。
这将产生目标基因的特定片段。
5. 克隆和测序：将 PCR 扩增的产物克隆到适当的载体中，并进行测序以确认所克隆的序列的准确性。
6. 功能分析：对克隆的基因进行进一步的功能分析，例如表达分析、蛋白质表达和功能研究等。
需要注意的是，转录组序列基因克隆的成功与否取决于许多因素，包括转录组数据的质量、引物的设计、PCR 条件等。
在进行该方法之前，建议对相关技术和实验步骤有一定的了解，并根据具体情况进行优化和调整。
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实验：目的基因克隆（PCR技术）【课前预习】PCR (polymerase chain reaction) 反应的基本原理。
【目的要求】1．学习和掌握PCR 反应的基本原理与实验技术方法。
2．认真完成每一步实验操作，详细记录实验现象和结果并加以分析和总结。
【基本原理】类似于DNA 的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。
PCR 由变性--退火--延伸三个基本反应步骤构成：①模板DNA的变性：模板DNA 经加热至93℃左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR 扩增形成的双链DNA 解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备；②模板DNA 与引物的退火(复性)：模板DNA 经加热变性成单链后，温度降至55℃左右，引物与模板DNA 单链的互补序列配对结合；③引物的延伸：DNA 模板--引物结合物在TaqDNA 聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA 链互补的半保留复制链重复循环变性--退火--延伸三过程，就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。
每完成一个循环需2～4 分钟，2～3 小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。
到达平台期(Plateau)所需循环次数取决于样品中模板的拷贝。
【实验用品】1．材料：重组质粒DNA作为模板2．器材和仪器：移液器及吸头，硅烷化的PCR 小管，DNA扩增仪(PE 公司)，琼脂糖凝胶电泳所需设备(电泳槽及电泳仪)，台式高速离心机3．试剂：①10×PCR 反应缓冲液：500mmol/L KCl, 100mmol/L Tris·Cl, 在25℃下, pH9.0, 1.0％Triton X-100。
②MgCl2 ：25mmol/L。
③ 4 种dNTP 混合物:每种 2.5mmol/L。
④Taq DNA聚合酶5U/μl。
⑤T4 DNA连接酶及连接缓冲液：【方法步骤】（一）PCR反应1. 依次混匀下列试剂35μl H2 O 5μl 10×PCR反应缓冲液4μl 25mmol/L MgCl2 4μl 4种dNTP 0.5μl 上游引物（引物１）0.5μl 下游引物（引物２）0.5μl 模板DNA(约1ng) 混匀后离心5秒。
2. 将混合物在94℃下加热5分钟后冰冷,迅速离心数秒, 使管壁上液滴沉至管底,加入Taq DNA聚合酶（0.5μl约2.5U），混匀后稍离心,加入一滴矿物油覆盖于反应混合物上。
3. 用94℃变性1分钟，45℃退火1分钟, 72℃延伸2分钟, 循环35轮,进行PCR。
最后一轮循环结束后, 于72℃下保温10分钟，使反应产物扩增充分。
4 电泳按前所述,取10μl扩增产物用1％琼脂糖凝胶进行电泳分析,检查反应产物及长度。
[注意]1. PCR非常灵敏, 操作应尽可能在无菌操作台中进行。
2. 吸头、离心管应高压灭菌, 每次吸头用毕应更换, 不要互相污染试剂。
3. 加试剂前, 应短促离心10秒钟, 然后再打开管盖, 以防手套污染试剂及管壁上的试剂污染吸头侧面。
4. 应设含除模板DNA所有其它成分的负对照。
【实验结果】【注意事项】微量操作、PCR 反应体系的设计、引物设计、扩增条件的优化【思考题】1. 降低退火温度对反应有何影响？2. 延长变性时间对反应有何影响？3. 循环次数是否越多越好？为何？4. PCR有哪些用途？举例说明。
附：PCR知识(供参考)（一）PCR 反应体系与反应条件标准的PCR 反应体系：10×扩增缓冲液10ul4 种dNTP 混合物各200umol/L引物各10～100pmol模板DNA 0.1～2ugTaq DNA聚合酶2.5uMg2+ 1.5mmol/L加双或三蒸水至100ulPCR 反应五要素：参加PCR 反应的物质主要有五种即引物、酶、dNTP、模板和Mg2+引物：引物是PCR 特异性反应的关键，PCR 产物的特异性取决于引物与模板DNA互补的程度。
理论上，只要知道任何一段模板DNA序列，就能按其设计互补的寡核苷酸链做引物，利用PCR 就可将模板DNA在体外大量扩增。
设计引物应遵循以下原则：①引物长度：15-30bp，常用为20bp左右。
②引物扩增跨度：以200-500bp为宜，特定条件下可扩增长至10kb 的片段。
③引物碱基：G+C 含量以40-60%为宜，G+C 太少扩增效果不佳，G+C 过多易出现非特异条带。
ATGC最好随机分布，避免5 个以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列。
④避免引物部出现二级结构，避免两条引物间互补，特别是3’端的互补，否则会形成引物二聚体，产生非特异的扩增条带。
⑤引物3’端的碱基，特别是最末及倒数第二个碱基，应严格要求配对，以避免因末端碱基不配对而导致PCR 失败。
⑥引物中有或能加上合适的酶切位点，被扩增的靶序列最好有适宜的酶切位点，这对酶切分析或分子克隆很有好处。
⑦引物的特异性：引物应与核酸序列数据库的其它序列无明显同源性。
引物量：每条引物的浓度0.1～1umol 或10～100pmol，以最低引物量产生所需要的结果为好，引物浓度偏高会引起错配和非特异性扩增，且可增加引物之间形成二聚体的机会。
酶及其浓度：目前有两种Taq DNA聚合酶供应，一种是从栖热水生杆菌中提纯的天然酶，另一种为大肠菌合成的基因工程酶。
催化一典型的PCR 反应约需酶量2.5U(指总反应体积为100ul 时)，浓度过高可引起非特异性扩增，浓度过低则合成产物量减少。
dNTP 的质量与浓度：dNTP 的质量与浓度和PCR 扩增效率有密切关系，dNTP 粉呈颗粒状，如保存不当易变性失去生物学活性。
dNTP 溶液呈酸性，使用时应配成高浓度后，以1M NaOH 或1M Tris。
HCl的缓冲液将其PH调节到7.0～7.5，小量分装，-20℃冰冻保存。
多次冻融会使dNTP 降解。
在PCR 反应中，dNTP 应为50～200umol/L，尤其是注意 4 种dNTP 的浓度要相等( 等摩尔配制)，如其中任何一种浓度不同于其它几种时(偏高或偏低)，就会引起错配。
浓度过低又会降低PCR 产物的产量。
dNTP 能与Mg2+结合，使游离的Mg2+浓度降低。
模板(靶基因)核酸：模板核酸的量与纯化程度，是PCR 成败与否的关键环节之一，传统的DNA 纯化方法通常采用SDS 和蛋白酶K 来消化处理标本。
SDS 的主要功能是：溶解细胞膜上的脂类与蛋白质，因而溶解膜蛋白而破坏细胞膜，并解离细胞中的核蛋白，SDS 还能与蛋白质结合而沉淀；蛋白酶K 能水解消化蛋白质，特别是与DNA 结合的组蛋白，再用有机溶剂酚与氯仿抽提掉蛋白质和其它细胞组份，用乙醇或异丙醇沉淀核酸。
提取的核酸即可作为模板用于PCR 反应。
一般临床检测标本，可采用快速简便的方法溶解细胞，裂解病原体，消化除去染色体的蛋白质使靶基因游离，直接用于PCR 扩增。
RNA 模板提取一般采用异硫氰酸胍或蛋白酶K 法，要防止RNase降解RNA。
Mg2+浓度：Mg2+对PCR 扩增的特异性和产量有显著的影响，在一般的PCR 反应中，各种dNTP 浓度为200umol/L时，Mg2+浓度为1.5～2.0mmol/L为宜。
Mg2+浓度过高，反应特异性降低，出现非特异扩增，浓度过低会降低Taq DNA聚合酶的活性，使反应产物减少。
PCR 反应条件的选择PCR 反应条件为温度、时间和循环次数。
温度与时间的设置：基于PCR 原理三步骤而设置变性-退火-延伸三个温度点。
在标准反应中采用三温度点法，双链DNA 在90～95℃变性，再迅速冷却至40 ～60℃，引物退火并结合到靶序列上，然后快速升温至70～75℃，在Taq DNA 聚合酶的作用下，使引物链沿模板延伸。
对于较短靶基因(长度为100～300bp 时)可采用二温度点法，除变性温度外、退火与延伸温度可合二为一，一般采用94℃变性，65℃左右退火与延伸(此温度Taq DNA 酶仍有较高的催化活性)。
①变性温度与时间：变性温度低，解链不完全是导致PCR 失败的最主要原因。
一般情况下，93℃～94℃lmin足以使模板DNA变性，若低于93℃则需延长时间，但温度不能过高，因为高温环境对酶的活性有影响。
此步若不能使靶基因模板或PCR 产物完全变性，就会导致PCR 失败。
②退火(复性)温度与时间：退火温度是影响PCR 特异性的较重要因素。
变性后温度快速冷却至40℃～60℃，可使引物和模板发生结合。
由于模板DNA 比引物复杂得多，引物和模板之间的碰撞结合机会远远高于模板互补链之间的碰撞。
退火温度与时间，取决于引物的长度、碱基组成及其浓度，还有靶基序列的长度。
对于20 个核苷酸，G+C 含量约50%的引物，55℃为选择最适退火温度的起点较为理想。
引物的复性温度可通过以下公式帮助选择合适的温度：Tm值(解链温度)=4(G+C)＋2(A+T)复性温度=Tm值-(5～10℃)在Tm值允许围，选择较高的复性温度可大大减少引物和模板间的非特异性结合，提高PCR 反应的特异性。
复性时间一般为30～60sec，足以使引物与模板之间完全结合。
③延伸温度与时间：Taq DNA聚合酶的生物学活性：70～80℃150核苷酸/S/酶分子70℃60 核苷酸/S/酶分子55℃24 核苷酸/S/酶分子高于90℃时，DNA合成几乎不能进行。
PCR 反应的延伸温度一般选择在70～75℃之间，常用温度为72℃，过高的延伸温度不利于引物和模板的结合。
PCR 延伸反应的时间，可根据待扩增片段的长度而定，一般1Kb 以的DNA片段，延伸时间1min是足够的。
3～4kb 的靶序列需3～4min；扩增10Kb 需延伸至15min。
延伸进间过长会导致非特异性扩增带的出现。
对低浓度模板的扩增，延伸时间要稍长些。
循环次数：循环次数决定PCR 扩增程度。
PCR 循环次数主要取决于模板DNA的浓度。
一般的循环次数选在30～40 次之间，循环次数越多，非特异性产物的量亦随之增多。
PCR 反应特点特异性强PCR 反应的特异性决定因素为：①引物与模板DNA 特异正确的结合；②碱基配对原则；③Taq DNA 聚合酶合成反应的忠实性；④靶基因的特异性与保守性。
其中引物与模板的正确结合是关键。
引物与模板的结合及引物链的延伸是遵循碱基配对原则的。
聚合酶合成反应的忠实性及Taq DNA 聚合酶耐高温性，使反应中模板与引物的结合(复性)可以在较高的温度下进行，结合的特异性大大增加，被扩增的靶基因片段也就能保持很高的正确度。
再通过选择特异性和保守性高的靶基因区，其特异性程度就更高。
灵敏度高PCR 产物的生成量是以指数方式增加的，能将皮克(pg=10 -12 g)量级的起始待测模板扩增到微克(ug=10 -6 g)水平。