小动物活体成像的影响因素

小动物活体成像的影响因素

自美国哈佛大学W e i s s l e d e r等人提出了分子影像学（m o l e c u l a r i m a g i n g）的概念之后，近年来使用小动物活体成像技术从事科学研究的科研工作者骤增。分子影像学是指应用影像学方法，对活体状态下的生物过程进行细胞和分子水平的定性和定量研究。小动物活体成像技术作为分子影像学的重要组成部分，主要通过生物发光（b i o l u m i n e s c e n c e）与荧光（f l u o r e s c e n c e）两种技术来进行。生物发光是用荧光素酶(L u c i f e r a s e)基因标记细胞或D N A，而荧光技术则采用荧光报告基团（G F P、R F P,C y t及d y e s等）进行标记。越来越多的科研人员希望能通过该技术来长时间追踪观察活体动物体内肿瘤细胞的生长以及对药物治疗的反应，希望能观察到荧光标记的多肽、抗体、小分子药物在体内的分布和代谢情况。

与传统的体外成像或细胞培养相比，分子映像学具有着显著优点。首先，能够反映细胞或基因表达的空间和时间分布，第二，可以对同一个研究个体进行长时间反复跟踪成像，提高了数据的可比性，又不需要杀死模式动物。第三，在药物开发方面，为解决临床药物的安全问题提供了广阔的空间，使药物在临床前研究中通过利用分子成像的方法，获得更详细的分子或基因水平的数据，为新药研究的模式带来了革命性的变革。

获得高质量高清晰度的生物发光及荧光成像的图片，对于进一步的实验分析和实验方案调整具有重要意义。那么影响成像效果的因素有哪些呢？应该注意哪些问题才能达到较好的成像效果呢？

一、 CCD的性能

1、CCD 的尺寸和像素的大小直接影响CCD成像的能力

大像素点能够增加灵敏度，像素面积越大，对光越灵敏，因为像素点面积有更多电子，能产生更多信号。越高bin值像素点得面积越大，所能获取的信号也越多，能够拍摄到微弱的发光点。但由于像素点增大，会降低分辨率，导致图像的清晰度变差。反过来说小的像素点能够提高分辨率，但是像素点面积越小，其感光性越差，信噪比越低，动态范围越低。因此，想要获得好的成像效果就要在大的像素点和小的像素点之间取得平衡。广州中科恺盛医疗科技有限公司的小动物活体成像设备能够很好地解决这个问题，他们设有3种不同的bin 模式，1*1,2*2,4*4，可以满足不同实验需求。

2、动态范围的变化以bit值来表现，用来描述生成的图像所能包含的颜色数，即灰阶。深度是16位意味着图像含有216种颜色深度的变化，这样级别的CCD才能准确表现所检

测到的荧光信号的微小差异，进而在图像上表现出不同的深浅或色彩差异。

3、对于同样级别的CCD 芯片来讲，信噪比的高低则对最后的成像质量更为关键，因为信噪比不仅与CCD本身有关，更与系统的整体配置和环境密切相关。

信噪比（SNR ）的计算方法如下：

从公式可以看到，QE 值，读出噪声和暗噪声是影响SNR的主要因素。温度与暗电流有密切的关系。一般情况下，温度越低，因温度产生的暗噪声也就越低；但是，当温度降低到一定程度时，乱真电荷（spurious charge ）就会出现，从而增加了暗电流的值。因此，温度对于CCD来讲，并不是越低越好，而是有一个最佳值，即：既降低了温度带来的噪声，又没有引起乱真电荷的增加。广州中科恺盛的可见光设备采用的CCD镜头在-70℃就能达到很好的去暗电流效果，而这个温度又不足以引起乱真电荷的出现，因此能够达到很高的性噪比。

中科恺盛所采用的CCD镜头在500-700nm处能达到高达95%的量子效率，而这个波长范围基本上能够满足大多数实验工作者的需求。

二：实验所采用的细胞和基因的表达情况

对于活体成像实验来讲，实验涉及到利用活细胞系来进行研究，不同的细胞系，表达蛋白的能力也不同，因此实验采用的细胞系的好坏，很大程度上影响了荧光成像的结果。

重组基因或融合蛋白的表达情况同样直接影响荧光的强弱，这个过程主要是由启动子的强弱来控制的。如果实验中采用了弱启动子，那么在荧光检测时，很可能会导致荧光弱很多倍，这样可能会导致有表达但是无法检测到。因此，在启动子的选择上最好选择强启动子。

三：荧光标记的选择

活体荧光成像技术主要有三种标记方法：荧光蛋白标记、荧光染料标记和量子点标记。荧光蛋白适用于标记肿瘤细胞、病毒、基因等。通常使用的是GFP、EGFP、RFP（DsRed）等。荧光染料标记和体外标记方法相同，常用的有Cy3、Cy5、Cy5.5及Cy7，可以标记抗体、多肽、小分子药物等。量子点标记作为一种新的标记方法，是有机荧光染料的发射光强的20倍，稳定性强100倍以上，具有荧光发光光谱较窄、量子产率高、不易漂白、激发光谱宽、颜色可调，并且光化学稳定性高，不易分解等诸多优点。量子点是一种能发射荧光的半导体纳米微晶体，尺寸在100nm以下，它可以经受反复多次激发，而不像有机荧光染料那样容易发生荧光淬灭。

但是不同荧光波长的组织穿透力不同，如图1所示，各种波长的光对小鼠各种器官的透过率，都在波长>600nm时显著增加。而如图2所示，在650nm-900nm的近红外区间，

血红蛋白、脂肪和水对这些波长的光的吸收都保持在一个比较低的水平。因而，选择激发和发射光谱位于650nm-900nm的近红外荧光标记（或至少发射光谱位于该区间），更有利于活体光学成像，特别是深层组织的荧光成像。

四：荧光素酶成像时，底物浓度和温度的影响

哺乳动物生物发光，是将荧光素酶基因整合到细胞染色体DNA 上以表达荧光素酶，当外源（腹腔或静脉注射）给予其底物荧光素(luciferin) ，即可在几分钟内产生发光现象。这种酶在ATP 及氧气的存在条件下，催化荧光素的氧化反应才可以发光，因此只有在活细胞内才会产生发光现象，并且光的强度与标记细胞的数目线性相关。

正因为荧光素酶成像是一种酶和底物的生化反应，因此，生物荧光成像便不可避免地受到了底物浓度和动物体温度的影响。在对动物进行底物注射时，底物浓度的高低和量的多少都会对成像的快慢和荧光的强弱造成影响。而活体成像系统的暗箱和检测平台都保持良好的恒温状态，也正是为了成像时能够保证动物的体温恒定在37 ℃。下面两图直观地说明了底物浓度和温度对于酶活性的影响：