酶工程技术

二、微生物酶的发酵生产
微生物酶的发酵生产是指在人工控制的条件下，有目的地利用微 生物培养来生产所需的酶，其技术包括培养基和发酵方式的选 择及发酵条件的控制管理等方面的内容。
(一)培养基 由于酶是蛋白质，酶的形成也是蛋白质的合成过程， 因此微生物产酶的培养基要 有利于蛋白质的合成。
1.碳源 是微生物细胞生命活动的基础，是合成酶的主要原料之一。
(二)优良产酶菌种的筛选方法 产酶菌种的筛选方法与发酵工程中微生物的筛选方法一 致，主要包括以下几个步骤：含菌样品的采集，菌种分离， 产酶性能测定及复筛等。 1.胞外酶的产酶菌株的筛选方法 2.胞内酶的产酶菌株的筛选方法
如果是胞内酶，则可采用以下两种方法来确定：
(1)固体培养法 把菌种接入固体培养基中，保温数天，用 水或缓冲液浸泡培养基，将酶抽提，测定酶活力，这种方 法主要适用于霉菌； (2)液体培养法 将菌种接入液体培养基后，静置或在摇床 亡振荡培养一段时间(视菌种而异)，再测定培养物中酶的 活力，通过比较，筛选出产酶性能较高的菌种供复筛使用。
第二节 酶的分离纯化
酶的种类繁多，性质各异，分离纯化方法不尽相同，即便是同一种酶， 也因其来源不同、酶的用途不同，而使分离纯化的步骤不一样。由于酶 很不稳定，在提取时容易变性失活，因而提取酶时应注意： (1)温度。整个提纯操作应尽可能在低温下(0～4℃)进行，以防止蛋白水解 酶对目的酶的破坏作用(尤其是在有机溶剂或无机盐存在下更应注意)。 (2)pH值。在提纯过程中一般采用缓冲液作为溶剂，防止过酸或过碱。对一 特定的酶，溶剂pH值的选择应考虑酶的pH稳定性以及酶的溶解度。 (3)盐浓度。因为大多数蛋白质具有盐溶性质，所以在提取过程中可选用合 适浓度的盐溶液以促进蛋白质溶解。但当盐浓度过高时，酶容易变性。



1971年，第一次国 际酶工程学术会议在美国召开，会议的主题就是 固定化酶的研制和应用。
20世纪70年代后期，酶工程领域又出现了固定化细胞技术。 1986年，我国科学家利用固定化原生质体发酵生产碱性磷酸酶和葡萄 糖氧化酶等相继获得成功，为酶工程的进一步发展开辟了新的途径。 近20年来，随着基因工程的渗入，使酶的定向改造成为可能，所以在 固定化酶、固定化细胞和固定化原生质体发展的同时，酶分子修饰技 术、酶的化学合成以及酶的人工合成等方面的研究，也在积极地开展 中，从而使酶工程更加显示出广阔而诱人的前景。
一、优良产酶菌种的筛选
(一)优良产酶菌种的特点 一个优良的产酶菌种应具备以下几点：


(1)繁殖快，产酶量高，有利于缩短生产周期。
(2)能在便宜的底物上良好生长。 (3)产酶性能稳定，菌株不易退化，不易受噬菌体侵袭。 (4)产生的酶容易分离纯化。 (5)不是致病菌及产生有毒物质或其他生理活性物质的微生 物，才能确保酶生产和应用的安全。
酶的发酵生产方式有两种，一种是固体发酵，另一种是液 体深层发酵。固体发酵法主要是用于真菌来源的商业酶生产， 其中用米曲霉生产淀粉酶，以及用曲霉和毛霉生产蛋白酶在 中国和日本已有悠久的历史。这种培养方法虽然简单，但是 操作条件不容易控制。现在大多数的酶是通过液体深层发酵 培养生产的。液体深层培养应注意控制以下条件： 1.温度 一般情况下产酶温度低于生长温度；
(三)提高酶产量的措施
在酶的发酵生产过程中，为了提高酶的产量，除了选育优 良的产酶细胞外，还可以采用一些与酶发酵工艺有关的措施， 例如添加诱导物、控制阻遏物浓度等。 1.添加诱导物 对于诱导酶的发酵生产，在发酵培养基中 添加诱导物能使酶的产量显著增加。
2.降低阻遏物浓度 可采用难于利用的碳源，或采用分 次添加碳源的方法使培养基中的碳源保持在不致于引起分解 代谢物阻遏的浓度。 3.表面活性剂 有些表面活性剂对酶分子有—定的稳定 作用，可以提高酶的活力。 4.添加产酶促进剂 产酶促进剂是指那些能提高酶产量 但作用机理尚未阐明的物质。它可能是酶的激活剂或稳定剂， 也可能是产酶微生物的生长因子，或有害金属的螯合剂。
第一节 酶的发酵生产
商业用酶可来自于动植物组织和某些微生物。从动物 组织或植物组织大量提取的酶，经常要涉及技术上、经 济上以及伦理上的问题，使得许多传统的酶源已远远不 能适应当今世界对酶的需求。为了扩大新老酶源，人们 正越来越多地求助于微生物。微生物发酵生产酶的方法 同其他发酵行业类似，首先必须选择合适的产酶菌株， 然后采用适当的培养基和培养方式进行发酵，使微生物 生长繁殖并合成大量所需的酶，最后将酶分离纯化制成 一定的酶制剂。
第十章
第一节
酶工程技术
酶的发酵生产
第二节 第三节
酶的分离纯化 酶分子的改造

1894年，日本科学家首次从米曲霉中提炼出淀粉酶，并将淀粉酶用作 治疗消化不良的药物，从而开创了人类有目的地生产和应用酶制剂的 先例。 1911年，美国科学家从木瓜中提取出木瓜蛋白酶，并将木瓜蛋白酶用 于除去啤酒中的蛋白质浑浊物。此后，酶制剂 的生产和应用就逐步 发展起 1949年，科学家成功地用液体深层发酵法 生产出了细菌α －淀粉酶， 从此揭开了近代酶工业的序幕。
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酶的生产是指经过预先设计，并且通过人工控制而获 得所需要的酶的过程。概括地说，酶的生产方法有提取法、 发酵法和化学合成法三种。提取法是最早采用并且一直沿 用至今的一种方法。它采用各种技术，直接从动植物或微 生物的细胞或组织中将酶提取出来。提取法虽简单易行， 但必须要有充足的原材料，这就使提取法的广泛应用受到 了限制。发酵法是20世纪50年代以来生产酶的主要方法。 它主要通过微生物发酵来获得人们所需要的酶。发酵法一 般包括固体发酵、液体深层发酵、固定化细胞发酵和原生 质体发酵等多种方式。化学合成法是20世纪60年代末出现 的一种生产酶的新技术,目前仍然停留在实验室内合成的阶 段。 下面重点介绍酶的发酵生产。
2.氮源 氮源可分为有机氮和无机氮，选用何种氮源因微生物或酶 种类的不同而异。
3.无机盐类 应特别注意有些金属离子是酶的组成成分
4.生长因子 生长因子是指细胞生长必需的微量有机物，如维生素、 氨基酸、嘌呤碱、嘧啶碱等。
5.培养基的pH值 在配制培养基时应根据微生物的需要调节pH值。
(二)酶的发酵生产方法
2.通气和搅拌 为提高氧气的溶解度，应对培养液加以适当的通 气和搅拌；
3.pH的控制 在发酵过程中要密切注意控制培养基pH值的变 化。有些微生物能同时产生几种酶，可以通过控制培养基的 pH值以影响各种酶之间的比例，例如当利用米曲霉生产蛋白 时，提高pH值有利于碱性蛋白酶的形成，降低pH值则主要 产生酸性蛋白酶。