基因组作图与基因定位

3、遗传作图的基础
连锁分析是遗传作图的基础。
摩尔根总结了连锁和交换定律。然而一个重大发现是 在实验工作的一名大学生（Sturtevant,1913)发现的： 基因间交换（去连锁）的概率与它们在染色体上的距 离成正比例。因而重组频率是衡量两个基因间距离的 单位。
少数例外：重组热点区域
4、遗传作图的方法
两者的最大区别在于是否依赖基因组作图。
1、全基因组鸟枪法
随机先将整个基因组打碎成小片段进行测序，最终 利用超级计算机根据序列之间的重叠关系进行排序 和组装，并确定它们在基因组中的正确位臵。 优点：速度快，简单易行，成本较低。 缺点：最终排序结果的拼接组装比较困难，尤其在 部分重复序列较高的地方难度较大。
Sanger F
桑格研究蛋白质的结构，成功地测定了胰鸟素的精细结构，因而获 得了1958年的诺贝尔化学奖。60年代后他致力于RNA和DNA结构研究 ，其测定RNA和DNA序列的方法，1980年再度获诺贝尔奖 。
与基因组作图有关的诺贝尔奖
The Nobel Prize in Physiology or Medicine 1993
STS作图方法
①酶切和部分酶切的制作重叠DNA片段。 ②分析两个STS位点共存于一个片段的概率（位 置越近，共存机会越大），计算STS位点的距离， 绘制图谱。
STS作图方法
难点7
蓝色标记
绿色标记
各种酶切片段
根据片段上共存 STS标记计算分 离率
蓝色标记分离率低，表明其间距近；绿色标记分离率高，间距远。
难点3
两种限制性酶切
A
B
完全酶切 如右图
如果控制反应条件避免完全酶切发生，因仅有A或B酶切，可产生部分重叠的片段。 即：这个体系中既有7kb片段，又有8kb片段，两种片段中有5kb是重叠的。
控制条件的两种限制性酶切
A
B
两酶切点之间的片段为重叠的片段
部分酶切法测定DNA片段位置
①完全降解：获得完全酶切片段的数目和大小 的图谱。 ②部分降解：避免所有切口断裂的完全降解 发生。部分酶解产物同样进行电泳分离及自显 影。 ③比较上述二步的自显影图谱,根据片段大小 及彼此间的差异即可排出酶切片段在DNA链上的 位置。
基因组学
基因组作图
genome mapping
这条轨道上的信息中蕴藏多少金钱呢？
我国能在竞争中 占据多少地盘呢？
基本要求
1、掌握基因组遗传图和基因组物理图的 概念和原理； 2、了解基因组作图技术进展和在医学研 究中的应用。
与基因组作图有关的诺贝尔奖
The Nobel Prize in Physiology or Medicine 1933
测序和计算机分析
物理图构建
①遗传标记细分基因组：使每隔100kb就有一个 标记。 ②低精度物理作图：构建覆盖每条染色体的大片 段，构建数百kb的YAC，得到重叠的YAC连续克隆 系。 ③高精度物理作图：将YAC随机切割后装入 cosmid粘粒，在几十个kb的DNA片段水平上作图。
物理图作图方法Ⅱ：荧光原位杂交 （FISH）作图
2、逐个克隆法
对连续克隆系中排定的YAC克隆逐个进行亚克 隆测序并进行组装： 遗传图-物理图-亚克隆测序-计算机拼装。
理想状况下，整条染色体就是由一个完整的重 叠群构成。
人类基因组序列已知后个人再测序
不需要再作重叠群，散弹法测序后拼装。 因有了参照系，测序更快。 454机后技术更快，能在6天完成。
物理图谱的用途
①基因组物理图谱是DNA顺序测定的基础, 它 是测序工作的第一步。 ②为基因的定位、克隆与基因之间的相互关系 分析提供了有效的途径。
三、基因组测序
两种不同的战略: 全基因组随机测序战略（美国Celera公司）。
以物理图为基础的以大片断克隆为单位的定向 测序战略（公共领域测序计划） 。
Mullis F "for his invention of the polymerase chain reaction (PCR) method" 发现PCR方法
染色体研究获诺贝尔医学奖
The Nobel Prize in Physiology or Medicine 2009
美国人伊丽莎白· 布莱克本、卡萝尔· 格雷德和杰克· 绍斯塔克，以表彰他们“发现 端粒和端粒酶是如何保护染色体的”。伊丽莎白· 布莱克本是卡萝尔· 格雷德的导师。
中国基因组北方中心
基因组“草图”和“完成图”
草图与完成图是测定基因组序列的两个阶段， 草图绘制的是整个基因组的框架，完成图则是 基因组序列测定的完成结果和最终目标。 完成图完全覆盖所测物种的基因组,准确率超 过99.99%的全DNA序列图。完成图将为人们 提供更详尽、更准确的基因图谱。
基因组比较
难点4
限制酶切图技术路线
染色体→酵母人工染色体（YAC）重叠群→单 个YAC克隆→ cosmid人工染色体重叠群→单个 cosmid克隆→质粒亚克隆→随机测序 →计算机 分析串连得大片段。
酵母人工染色体（YAC）
YAC载体是利用酿酒酵母的染色体的复制元件构建的 载体。 YAC载体必须含有以下元件： ①端粒重复序列 ②着丝粒 ③自主复制序列
基因及多态性 位点的分布
图距
连锁图
人 类 号 染 色 体 连 锁 图
1 例子：D1S160
二、基因组物理图（physical mapping)
物理图—更精细的图谱。 物理图的构建是基因组测序的基础，有承上 启下的作用。 遗传图分辨率依赖于交换率，而高等生物交 换数目有限。
物理图
遗传图
物理图与遗传图 比较：基因间关 系更准确 （啤酒酵母3号 染色体）。
①对果蝇和小鼠等物种的连锁分析，进行有计划的育 种实验：观察后代重组率。 ②对不发生减数分裂的细菌的连锁分析：诱导同源片 段交换，观察子代细胞重组率。
接合：DNA从一个细菌到另一个细菌。 转导：通过噬菌体转移小片段DNA。 转化：受体菌从环境中摄取供体细胞释放的DNA片段
③对人的连锁分析，只能通过家系分析完成：分析家 庭连续几代成员遗传标记与某基因（或某疾病）共同 出现的频率。
物理图构建和测序
大片段DNA克隆： 一片段与疾病连锁
Met A A Met
亚克隆 亚克隆
Val
Ser
Leu Gln Pro YAC人工染 色体重叠群 1000kb cosmid人工染 质粒亚 色体重叠群 克隆 40kb亚克隆
T G G T C T C A C T G C A A C C G
T G G Val T C T Ser C A C Leu T G T Stop A A C C G
难点2
（一）基因组物理图作图方法
①限制酶切作图：根据重叠序列确定酶切片段 间连接顺序，以及遗传标志之间物理距离的图 谱。 ②荧光原位杂交图：将分子标记与完整染色体 杂交来确定标记的位置。 ③序列标记位点（STS）图：通过对基因组片 段进行PCR和杂交分析，来对短序列进行定位 作图。
物理图作图方法Ⅰ：限制性酶切图
Cosmid粘粒
①cosmid 是英文 cos site-carrying plasmid 的缩写, 也称 粘粒、柯斯载体。是人工建造的含有λ噬菌体DNA的 cos序列和质粒复制子的特殊类型的质粒载体。 ② 带有质粒的复制起点、克隆位点、选择性标记以及λ 噬菌体用于包装的cos末端等。 ③可利用噬菌体体外包装的特性，利用噬菌体感染的 方式将重组DNA导入受体细胞。但它不会产生子代噬 菌体，而是以质粒DNA的形式存在于细胞内。
Smith H
"for the discovery of restriction enzymes and their application to problems of molecular genetics"
限制性内切酶的应用
与基因组作图有关的诺贝尔奖
ห้องสมุดไป่ตู้
The Nobel Prize in Chemistry 1958/1980
基因组碱基对数/基因数 乙肝病毒HBV 3200 /4 支原体M. genesis 58万/480 大肠杆菌E. coli 460万/3200 酵母S. cerevisiae 0.12亿/6000 果蝇D. melanogaster 1.37亿/13000 圆线虫C. elegans 0.97亿/19000 拟南芥A. thaliana 1亿/25000 实验小鼠M. musculus 26亿/30000 人H. sapiens 31亿/30000 大熊猫与狗79.9%相同，华大散弹法测大熊猫基 因组，准确性为97%。
摩尔根：遗传的染色体理论
与基因组作图有关的诺贝尔奖
The Nobel Prize in Chemistry 1962
沃森和克里克：DNA双螺旋结构
与基因组作图有关的诺贝尔奖
The Nobel Prize in Physiology or Medicine 1978
Arber W
Nathans D
有什么方法知道酶切片段之间的关系呢？答案是： 重叠片段。 重叠群：相互间存在重叠序列的一组克隆，可 根据重叠顺序的相对位置将各个克隆首尾连接， 构成连续顺序图。 以连续的重叠群为基本框架，通过遗传标记将 重叠群排列于染色体上。
限制酶切作图基本方法
通过获得重叠群，构建图谱。
DNA分子被两种识别不同靶序列的限制性酶切 和控制条件的部分酶切片段。
遗传图
物理图
测序：序列图
一、基因组遗传图
1、遗传图(genetic mapping)概念
通过遗传重组所得到的基因在具体染色 体上线性排列图称为遗传连锁图，简称遗传 图。 计算连锁的遗传标志之间的重组频率， 确定他们的相对距离，一般用厘摩(cM，即 减数分裂的重组频率为1%)来表示。
2、遗传作图标记
结构基因和DNA多态性标记可以满足要求：
限制性片段长度多态性(restriction fragment length polymorphism, RFLP)。 简单序列长度多态性（simple sequence length polymorphism, SSLP) :小卫星DNA、微卫星DNA。 单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism, SNP)： 人类基因组中至少有400万个SNP，其中只有10万个 可以形成RFLP 。 总之：它们是可以识别的结构。
染色体带型与序列的差距：23条染色体---31亿碱基对
最精确的技术也难以得到大于750bp的序列。每一DNA分子只能拼接序列。
基因组作图的概念 应用界标或遗传 学标记对基因组 进行精细的划分， 进而标示出DNA 的碱基序列或基 因排列的工作。 主要有遗传图、 物理图、序列图、 基因图。
人类基因组四张图谱
将一组不同颜色的荧光标记探针与单个变性的 染色体杂交，分辨出每种杂交信号，从而测定 出各探针序列的相对位置。
探针间位置关系提供了DNA序列与基因组图谱 间的联系。
物理图作图方法Ⅱ：荧光原位杂交 （FISH）作图
难点6
物理图作图方法Ⅲ：序列标记位 点（STS）作图
STS 来源于基因的编码序列， 是染色体上位置 已定的、核苷酸序列已知的、且在基因组中只 有一份拷贝的DNA短片断位点，片段长200－ 500bp。 基本特征：唯一性。
难点1
家系连锁分析（PCR-电泳）
遗传标记系谱连锁分析图
“1”片段与疾病基因连锁
5、遗传图谱的用途
提供基因在染色体上的坐标，为基因识别和基 因定位创造了条件。 例如，6000多个遗传标记能够把人的基因组分 成6000多个区域，连锁分析找到某一疾病基因 与某一标记紧密连锁的证据，可把这一基因定 位于这一已知区域，再对基因进行分离和研究。 遗传图的分子座标也是基因组物理图绘制的基 础。
四、基因图谱
在识别基因组所包含的蛋白质编码序列的基础 上，绘制的有关基因序列、位臵及表达模式等 信息的图谱。 基因图谱制作方法: 通过基因的表达产物mRNA反追到染色体的位 臵。 用cDNA或EST作为“探针”进行分子杂 交，鉴别出与转录有关的基因。
关于基因的数量
人类基因组包含31.647亿碱基对，不同个体间 的碱基顺序有99.9%相同。 基因总数为2～3万，远低于原估计的8万～10万。 1号染色体已定位基因数最多（2968）， Y染色 体最少（231）。第22号已定位679个基因，这 些基因主要与先天性心脏病、免疫功能低下和多 种恶性肿瘤等有关。 平均每基因碱基数为3000，最大的dystrophin 基因含240万碱基。