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2011年； • 第三代: CRISPR/Cas9(成簇的规律性间隔的短回文
重复序列)，2013年； • 第四代：NgAgo-gDNA ，韩春雨，2016；
第一代: 锌指核酸酶 Zinc-finger nucleases（ZFN）
ZFN组成
ZFN = DNA识别域 + 核酸内切酶 DNA识别域：
NgAgo-gDNA技术原理
NgAgo-gDNA技术是以DNA作为引导工具的基因编辑 技术。NgAgo-gDNA技术的工作原理与CRISPR-Cas9技术 有些类似，都是在引导工具的引导下，令核酸酶对特 定位点的基因序列进行切割，从而进行基因编辑。不 同的是NgAgo-gDNA技术中所用到的引导工具是一段引 导DNA（gDNA）而不是CRISPR-Cas9技术中的RNA。由于 也不需要通过蛋白（如锌指蛋白）来寻找需要替换的 序列，因此，NgAgo-gDNA技术与CRISPR-Cas9技术一样 ，较之前的基因编辑技术，在操作上要简单方便得多
相关争议
• 2016年7月29日，澳大利亚国立大学研究者盖坦·布 尔焦称，尽管他和同事在过去的一个月做了多次尝 试，但最终发现：NgAgo无法进行基因编辑。
• 2016年8月8日，《自然》杂志网站发表一篇报道， 指出，来自澳大利亚、西班牙等国的科研人员表示 实验不可重复，另有一些科学家表示曾重复出韩春 雨的部分实验，但还需进一步确认
NgAgo-gDNA的优势
3、新的基因编辑工具精确性更高，脱靶率更低。李伟 介绍，NgAgo要结合24个碱基，比Cas9结合的19个碱 基要长5个碱基，理论上其精确性会提高1024倍。
4、韩春雨团队就是利用格氏嗜盐碱杆（ Natronobacterium gregoryi）的Argonaute蛋白实现 了DNA引导的基因组编辑，并发现NgAgo作为一种DNA 介导的核酸内切酶，适合在人体细胞（37°）中进行 基因组编辑。大大扩充了基因编辑的取材范围。”
第二代: 转录激活样效应因子核酸酶
transcription activator-like (TAL) effector nucleases(TALENs)
TALEN的组成
TALEN = DNA识别域 + 核酸内切酶 DNA识别域：由一系列TALE蛋白串联组成（20个左 右），每个TALE蛋白识别并结合一个对应的碱基 。 核酸内切酶：非特异性核酸内切酶FokI，形成二 聚体时切割双链DNA
CRISPR/cas系统的发现
• 1987年发现苗头：大阪大学研究者对一种细菌碱性磷 酸酶基因研究中发现，其基因编码区域附近存在一小段 简单重复的DNA序列片段，但不太清楚其生物学意义。
• 随后十年不断确认：约40%细菌和90%古细菌基因末端 ，有多组DNA序列+反向序列+约30bp空格序列（spacer DNA），组成成簇的、规律间隔的短回文重复序列，被 称为CRISPR。
CRISPR-Cas9的工作原理
RISPR/Cas 系统由 Cas9 核酸内切酶与sgRNA构成. 转录 的 sgRNA 折叠成特定的三维结构后与 Cas9 蛋白形成复 合体, 指导 Cas9 核酸内切酶识别特定靶标位点, 在 PAM 序列上游处切割 DNA 造成双链 DNA 断裂, 并启动 DNA 损伤修复机制. 从不同菌种中分离的 CRISPR/Cas 系统, 其 CrRNA(或者是人工构建的sgRNA)靶向序列的长度不同, PAM 序列也可能不同。
同行评价
• 《自然》杂志执行主编尼克·坎贝尔评论说：“虽 然这项新技术还处于初期，但有一些理由让我们相 信它与现在普遍使用的ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９技 术相比有多种优势，特别是在更精准的基因编辑方 面。”
• “韩春雨的工作是国际一流的技术推进，”北京大 学理学部主任、生物学家饶毅教授如此评论。他担 任主编的科学类新媒体《知识分子》刊文，介绍了 这项成果的学术细节和价值。
• 2005年提出假说： CRISPR中空格DNA能与噬菌体DNA序 列互补匹配。细菌CRISPR序列可能与细菌的免疫保护机 制相关，细菌转录形成RNA后与入侵的外源噬菌体DNA结 合，起到类似RNA干扰的作用。
CRISPR/cas系统的发现
• 2007 年 实 验 验 证 ： Danisco 公 司 的 Barrangou 和 Horvath等发现，通过插入或删除嗜热链球菌（乳酸 菌）中几个CRISPR序列的空格DNA片段，就可以改变 细菌对噬菌体的免疫力（Science, 2007） 。
• 相关视频
发展“钱景”相当广阔
比尔·盖茨甚至曾经预 言：超过我的下一个世 界首富必定出自基因领 域。
基因编辑技术创造生 命奇迹，美国基因编 辑龙头接连上市。
基因编辑技术的发展
基因编辑定义
通过精确识别靶细胞DNA片段中靶点的核苷酸 序列，利用核酸内切酶对DNA靶点序列进行切割， 从而完成对靶细胞DNA目的基因片段的精确编辑。
四代基因编辑技术
• 第一代: ZFN(锌指核酸酶)，1996年； • 第 二 代 : TALEN( 转 录 激 活 样 效 应 因 子 核 酸 酶) ，
由一系列Cys-His锌指蛋白 （zinc-fingers）串联组成（3~4 个），每个锌指蛋白识别并结合 一个特异的三联体碱基。 核酸内切酶Fok I：
非特异性核酸内切酶FokI， 形成二聚体时切割双链DNA。
锌指蛋白
ZFN的工作原理
DNA 识别域能识别特异位点并与之结合，而由FokⅠ 构成的切割域能执行剪切功能，两者结合可使靶位点的 双链DNA 断裂(DSB)。于是，细胞可以通过同源重组(HR) 修复机制和非同源末端连接(NHEJ)修复机制来修复 DNA。 HR 修复有可能会对靶标位点进行恢复修饰或者插入修饰， 而 NHEJ 修复极易发生插入突变或缺失突变。两者都可 造成移码突变，因此达到基因敲除的目的。
，利于其在应用中的推广。
NgAgo-gDNA的优势
1、向导设计制作简便：可以像合成PCR引物一样合成 短单链DNA向导；向导可直接转染细胞和组织而无需构 建向导表达载体。由于向导核酸是DNA而非RNA，因此 避免了RNA易于形成复杂的二级结构而带来的失效或者 脱靶效应。
2、可编辑基因组内任何位置：Cas9基因组的靶点选择 受到PAM区和富含GC区的限制。而NgAgo对靶点选择没 有限制，对基因组任何位置都能有效引入双链断裂。
ZFN的特点和不足
ZFN 诱导的基因组编辑技术可应用于很多物种 及基因位点，具有较好的发展潜力。但是目前有 3 个方面的缺陷制约了该技术的推广:(1)以现有的策 略设计高亲和性的 ZFN， 需要投入大量的工作和时 间;(2)在细胞中持续表达 ZFN 对细胞有毒性;(3)虽 然三联体设计具有一定特异性，但仍然存在不同程 度的脱靶效应。
Fok I
TALEN技术原理
TALENs是一种可靶向修饰特异DNA序列的酶，它借 助于TAL效应子一种由植物细菌分泌的天然蛋白来识别 特异性DNA碱基对。TAL效应子可被设计识别和结合所 有的目的DNA序列。对TAL效应子附加一个核酸酶就生 成了TALENs。TAL效应核酸酶可与DNA结合并在特异位 点对DNA链进行切割，从而导入新的遗传物质。
• 德 国 学 者 机 制 研 究 ： Helmholtz 、 Doudna 和 、 Charpentier分别对不同的 CRISPR及相关系统进行 了研究，阐明了DNA空格序列在细菌免疫防御中的机 制。目前已经发现了3种CRISPR/Cas系统，其中依赖 Cas9蛋白的CRISPR系统更简单。
CRISPR/Cas9系统组成
TALEN的特点和不足
TALEN 已经成功应用于酵母、 哺乳动物和植物的 位点特异性基因打靶， 与锌指核酸酶系统相比有较大 的应用优势， 设计更简单，特异性更高，但仍然有些 问题需要解决，如脱靶效应、TALEN 与基因组进行特 异结合与染色体位置及邻近序列有关等。
第三代：成簇的规律性间隔的 短回文重复序列
三代主流技术对比：
Hale Waihona Puke 相关视频第四代： NgAgo-gDNA技术
文章的发表（CNS）
沈啸（左），韩春雨（中）、高峰（右）
2016年5月2日，河北科技大学的韩春雨与合作者的文章在 被《Science》审稿小半年后被拒，历时9个月终被《Nature Biotechnology》（IF=42）接收并发表。
CRISPR-Cas系统是细菌和古细菌中免疫系统（对付攻击者 的基因武器 ）： • CRISPR序列（包括空格序列）：成簇的、规律间隔的短回 文重复（Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeat Sequences）。 • Cas：CRISPR相关基因（CRISPR-associated genes）
• 2016年10月11日，河北科技大学副教授韩春雨接受 科技日报记者采访，回应无法重复他的NgAgo实验。 他依然认为，别人重复不了，细胞污染的可能性最 大。
• 2016年10月27日，《自然·生物技术》新闻发言人 日前表示，有一些提交的批评意义如此重大，以至 于让作者或编辑推断出论文的基本结论是无效的情 况下，论文会被撤稿。
重复序列)，2013年； • 第四代：NgAgo-gDNA ，韩春雨，2016；
第一代: 锌指核酸酶 Zinc-finger nucleases（ZFN）
ZFN组成
ZFN = DNA识别域 + 核酸内切酶 DNA识别域：
NgAgo-gDNA技术原理
NgAgo-gDNA技术是以DNA作为引导工具的基因编辑 技术。NgAgo-gDNA技术的工作原理与CRISPR-Cas9技术 有些类似，都是在引导工具的引导下，令核酸酶对特 定位点的基因序列进行切割，从而进行基因编辑。不 同的是NgAgo-gDNA技术中所用到的引导工具是一段引 导DNA（gDNA）而不是CRISPR-Cas9技术中的RNA。由于 也不需要通过蛋白（如锌指蛋白）来寻找需要替换的 序列，因此，NgAgo-gDNA技术与CRISPR-Cas9技术一样 ，较之前的基因编辑技术，在操作上要简单方便得多
相关争议
• 2016年7月29日，澳大利亚国立大学研究者盖坦·布 尔焦称，尽管他和同事在过去的一个月做了多次尝 试，但最终发现：NgAgo无法进行基因编辑。
• 2016年8月8日，《自然》杂志网站发表一篇报道， 指出，来自澳大利亚、西班牙等国的科研人员表示 实验不可重复，另有一些科学家表示曾重复出韩春 雨的部分实验，但还需进一步确认
NgAgo-gDNA的优势
3、新的基因编辑工具精确性更高，脱靶率更低。李伟 介绍，NgAgo要结合24个碱基，比Cas9结合的19个碱 基要长5个碱基，理论上其精确性会提高1024倍。
4、韩春雨团队就是利用格氏嗜盐碱杆（ Natronobacterium gregoryi）的Argonaute蛋白实现 了DNA引导的基因组编辑，并发现NgAgo作为一种DNA 介导的核酸内切酶，适合在人体细胞（37°）中进行 基因组编辑。大大扩充了基因编辑的取材范围。”
第二代: 转录激活样效应因子核酸酶
transcription activator-like (TAL) effector nucleases(TALENs)
TALEN的组成
TALEN = DNA识别域 + 核酸内切酶 DNA识别域：由一系列TALE蛋白串联组成（20个左 右），每个TALE蛋白识别并结合一个对应的碱基 。 核酸内切酶：非特异性核酸内切酶FokI，形成二 聚体时切割双链DNA
CRISPR/cas系统的发现
• 1987年发现苗头：大阪大学研究者对一种细菌碱性磷 酸酶基因研究中发现，其基因编码区域附近存在一小段 简单重复的DNA序列片段，但不太清楚其生物学意义。
• 随后十年不断确认：约40%细菌和90%古细菌基因末端 ，有多组DNA序列+反向序列+约30bp空格序列（spacer DNA），组成成簇的、规律间隔的短回文重复序列，被 称为CRISPR。
CRISPR-Cas9的工作原理
RISPR/Cas 系统由 Cas9 核酸内切酶与sgRNA构成. 转录 的 sgRNA 折叠成特定的三维结构后与 Cas9 蛋白形成复 合体, 指导 Cas9 核酸内切酶识别特定靶标位点, 在 PAM 序列上游处切割 DNA 造成双链 DNA 断裂, 并启动 DNA 损伤修复机制. 从不同菌种中分离的 CRISPR/Cas 系统, 其 CrRNA(或者是人工构建的sgRNA)靶向序列的长度不同, PAM 序列也可能不同。
同行评价
• 《自然》杂志执行主编尼克·坎贝尔评论说：“虽 然这项新技术还处于初期，但有一些理由让我们相 信它与现在普遍使用的ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９技 术相比有多种优势，特别是在更精准的基因编辑方 面。”
• “韩春雨的工作是国际一流的技术推进，”北京大 学理学部主任、生物学家饶毅教授如此评论。他担 任主编的科学类新媒体《知识分子》刊文，介绍了 这项成果的学术细节和价值。
• 2005年提出假说： CRISPR中空格DNA能与噬菌体DNA序 列互补匹配。细菌CRISPR序列可能与细菌的免疫保护机 制相关，细菌转录形成RNA后与入侵的外源噬菌体DNA结 合，起到类似RNA干扰的作用。
CRISPR/cas系统的发现
• 2007 年 实 验 验 证 ： Danisco 公 司 的 Barrangou 和 Horvath等发现，通过插入或删除嗜热链球菌（乳酸 菌）中几个CRISPR序列的空格DNA片段，就可以改变 细菌对噬菌体的免疫力（Science, 2007） 。
• 相关视频
发展“钱景”相当广阔
比尔·盖茨甚至曾经预 言：超过我的下一个世 界首富必定出自基因领 域。
基因编辑技术创造生 命奇迹，美国基因编 辑龙头接连上市。
基因编辑技术的发展
基因编辑定义
通过精确识别靶细胞DNA片段中靶点的核苷酸 序列，利用核酸内切酶对DNA靶点序列进行切割， 从而完成对靶细胞DNA目的基因片段的精确编辑。
四代基因编辑技术
• 第一代: ZFN(锌指核酸酶)，1996年； • 第 二 代 : TALEN( 转 录 激 活 样 效 应 因 子 核 酸 酶) ，
由一系列Cys-His锌指蛋白 （zinc-fingers）串联组成（3~4 个），每个锌指蛋白识别并结合 一个特异的三联体碱基。 核酸内切酶Fok I：
非特异性核酸内切酶FokI， 形成二聚体时切割双链DNA。
锌指蛋白
ZFN的工作原理
DNA 识别域能识别特异位点并与之结合，而由FokⅠ 构成的切割域能执行剪切功能，两者结合可使靶位点的 双链DNA 断裂(DSB)。于是，细胞可以通过同源重组(HR) 修复机制和非同源末端连接(NHEJ)修复机制来修复 DNA。 HR 修复有可能会对靶标位点进行恢复修饰或者插入修饰， 而 NHEJ 修复极易发生插入突变或缺失突变。两者都可 造成移码突变，因此达到基因敲除的目的。
，利于其在应用中的推广。
NgAgo-gDNA的优势
1、向导设计制作简便：可以像合成PCR引物一样合成 短单链DNA向导；向导可直接转染细胞和组织而无需构 建向导表达载体。由于向导核酸是DNA而非RNA，因此 避免了RNA易于形成复杂的二级结构而带来的失效或者 脱靶效应。
2、可编辑基因组内任何位置：Cas9基因组的靶点选择 受到PAM区和富含GC区的限制。而NgAgo对靶点选择没 有限制，对基因组任何位置都能有效引入双链断裂。
ZFN的特点和不足
ZFN 诱导的基因组编辑技术可应用于很多物种 及基因位点，具有较好的发展潜力。但是目前有 3 个方面的缺陷制约了该技术的推广:(1)以现有的策 略设计高亲和性的 ZFN， 需要投入大量的工作和时 间;(2)在细胞中持续表达 ZFN 对细胞有毒性;(3)虽 然三联体设计具有一定特异性，但仍然存在不同程 度的脱靶效应。
Fok I
TALEN技术原理
TALENs是一种可靶向修饰特异DNA序列的酶，它借 助于TAL效应子一种由植物细菌分泌的天然蛋白来识别 特异性DNA碱基对。TAL效应子可被设计识别和结合所 有的目的DNA序列。对TAL效应子附加一个核酸酶就生 成了TALENs。TAL效应核酸酶可与DNA结合并在特异位 点对DNA链进行切割，从而导入新的遗传物质。
• 德 国 学 者 机 制 研 究 ： Helmholtz 、 Doudna 和 、 Charpentier分别对不同的 CRISPR及相关系统进行 了研究，阐明了DNA空格序列在细菌免疫防御中的机 制。目前已经发现了3种CRISPR/Cas系统，其中依赖 Cas9蛋白的CRISPR系统更简单。
CRISPR/Cas9系统组成
TALEN的特点和不足
TALEN 已经成功应用于酵母、 哺乳动物和植物的 位点特异性基因打靶， 与锌指核酸酶系统相比有较大 的应用优势， 设计更简单，特异性更高，但仍然有些 问题需要解决，如脱靶效应、TALEN 与基因组进行特 异结合与染色体位置及邻近序列有关等。
第三代：成簇的规律性间隔的 短回文重复序列
三代主流技术对比：
Hale Waihona Puke 相关视频第四代： NgAgo-gDNA技术
文章的发表（CNS）
沈啸（左），韩春雨（中）、高峰（右）
2016年5月2日，河北科技大学的韩春雨与合作者的文章在 被《Science》审稿小半年后被拒，历时9个月终被《Nature Biotechnology》（IF=42）接收并发表。
CRISPR-Cas系统是细菌和古细菌中免疫系统（对付攻击者 的基因武器 ）： • CRISPR序列（包括空格序列）：成簇的、规律间隔的短回 文重复（Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeat Sequences）。 • Cas：CRISPR相关基因（CRISPR-associated genes）
• 2016年10月11日，河北科技大学副教授韩春雨接受 科技日报记者采访，回应无法重复他的NgAgo实验。 他依然认为，别人重复不了，细胞污染的可能性最 大。
• 2016年10月27日，《自然·生物技术》新闻发言人 日前表示，有一些提交的批评意义如此重大，以至 于让作者或编辑推断出论文的基本结论是无效的情 况下，论文会被撤稿。